CN108663424A - 一种基于海胆状核壳型金@钯纳米球的免疫传感器的制备方法及应用 - Google Patents

一种基于海胆状核壳型金@钯纳米球的免疫传感器的制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于免疫分析和生物传感技术领域，提供了一种基于海胆状核壳型金@钯纳米球的免疫传感器的制备方法。采用基于氨基化石墨烯负载金纳米棒为基底，海胆状核壳型金@钯纳米球标记的人附睾蛋白4为检测抗体溶液构建电化学免疫传感器，实现了对卵巢癌标记物的定量检测，具有特异性强，灵敏度高，检测限低等优点。对卵巢疾病的检测具有重要的科学意义和应用价值。

Description

一种基于海胆状核壳型金@钯纳米球的免疫传感器的制备方 法及应用
技术领域
本发明属于新型纳米材料、免疫分析和生物传感技术领域，提供了一种基于海胆状核壳型金@钯纳米球的免疫传感器的制备方法及应用，以及由该方法构建的电化学免疫传感器在检测人附睾蛋白4抗原中的应用，属于新型功能纳米材料、免疫分析以及生物传感检测技术领域。
背景技术
目前，在世界范围内仍有许多疾病困扰着人类，卵巢癌是妇科常见的恶性肿瘤，死亡率居妇科恶性肿瘤之首。由于卵巢癌的临床症状早期症状不典型，术前鉴别卵巢肿瘤的组织类型及良恶性相当困难，极易造成漏诊与误诊，所以在早期诊断上是一大难题。人附睾蛋白4作为一种新的肿瘤标志物，其敏感性好，特异性高，尤其是在疾病初期无症状表现的阶段，能够帮助卵巢癌的早期诊断、风险评估及随访监测，因此，发展高灵敏的人附睾蛋白4抗原的定量检测方法对卵巢癌的早期诊断尤为重要。
电化学免疫传感器是基于抗原和抗体特异性结合的一种分析方法，具有检测迅速、灵敏度高、操作简单和制备成本低的优点，近年来，电化学免疫传感器备受关注，被广泛应用于肿瘤标志物的检测中。
本发明利用层层自组装技术，以氨基化石墨烯负载金纳米棒为基底，以海胆状核壳型金@钯纳米球作为人附睾蛋白4检测抗体的标记物，制备了一种基于海胆状核壳型金@钯纳米球的免疫传感器，实现了对人附睾蛋白4抗原的定量检测，具有检测范围宽、检测下限低、灵敏度高、操作简单、检测速度快等优点，并且具有良好的重现性、稳定性和选择性，为卵巢癌的早期诊断提供了可靠的检测手段。
发明内容
本发明提供了一种基于海胆状核壳型金@钯纳米球的免疫传感器，所述电化学免疫传感器包括：工作电极、对电极和参比电极，所述工作电极的基底电极为玻碳电极，其表面依次修饰氨基化石墨烯负载金纳米棒、人附睾蛋白4捕获抗体、牛血清蛋白、人附睾蛋白4抗原、海胆状核壳型金@钯纳米球标记的人附睾蛋白4检测抗体，所述对电极为铂丝电极，所述参比电极为饱和甘汞电极。
本发明的目的之一是提供一种海胆状核壳型金@钯纳米球功能性纳米材料，构建了一种快速超灵敏的夹心型电化学免疫传感器。
本发明的目的之二是将基于一种海胆状核壳型金@钯纳米球构建的夹心型电化学免疫传感器应用于卵巢癌标记物的检测。
本发明的技术方案如下：
1. 一种基于海胆状核壳型金@钯纳米球的免疫传感器的制备方法，其特征包括以下几个步骤：
（1）将直径为3.0 ~ 5.0 mm的玻碳电极用氧化铝抛光粉抛光成镜面，在无水乙醇中超声清洗干净；
（2）取6.0 µL、0.5 ~ 4.0 mg/mL的氨基化石墨烯负载金纳米棒分散液滴加到电极表面，室温下晾干，用超纯水冲洗电极表面，晾干；
（3）继续将6.0 µL、5.0 ~ 15.0 µg/mL的人附睾蛋白4捕获抗体滴加到电极表面，4 ℃冰箱中干燥；
（4）继续将3.0 µL、1.0 ~ 2.0 wt%的BSA溶液滴加到电极表面，用以封闭电极表面上非特异性活性位点，pH = 7.0磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；
（5）滴加6.0 µL、1 nM ~ 50 nM的一系列不同浓度的人附睾蛋白4抗原溶液，pH = 7.0磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；
（6）将6.0 µL、1.0 ~ 4.0 mg/mL的海胆状核壳型金@钯纳米球标记的人附睾蛋白4抗体检测分散液滴涂于电极表面，静置于4 ℃冰箱中30 ~ 40 min，用pH = 7.0的磷酸盐缓冲液冲洗，置于4 ℃冰箱中晾干，制得一种基于海胆状核壳型金@钯纳米球的免疫传感器的工作电极。
如权利要求1所述的一种基于海胆状核壳型金@钯纳米球的免疫传感器的制备方法，所述氨基化石墨烯的制备，步骤如下：
（1）制备氧化石墨烯
将4.0 g石墨和1.0 g硝酸钠置于2000 mL烧杯中，在冰水浴环境中磁力搅拌下缓慢加入192 mL浓硫酸，随后缓慢加入24.0 g高锰酸钾并剧烈搅拌，冰水浴下反应1 h，然后向该混合物转移至35 ℃油浴锅中反应2 h，升温至55 ℃，反应1.5 h，然后将160 mL去离子水逐滴加入上述混合液并不停地用玻璃棒搅拌，再加入400 mL去离子水，最后将双氧水（20.0mL，30%）加入混合液中，反应10 min，静置过夜，取下层沉淀透析一周，经超声波分散（140W，1.0 h），离心（6000 rpm，10 min）收集上清液并冷冻干燥24 h得到氧化石墨烯；
（2）制备氨基化石墨烯分散液
在超声处理下将100.0 mg氧化石墨烯加入到40.0 mL乙二醇中，超声1 h，将1.0 mL浓氨水加入上述溶液中，得到深棕色溶液，随后把混合溶液转移至高压反应釜中，在180 ℃下进行溶剂热反应10 h，反应后，过滤沉淀物，用蒸馏水重复洗涤至中性，冷冻干燥24 h，得到片状氨基化石墨烯固体，再次分散于5.0 mL去离子水中，得到氨基化石墨烯分散液，保存于4 ℃为进一步使用。
如权利要求1所述的一种基于海胆状核壳型金@钯纳米球的免疫传感器的制备方法，所述金纳米棒分散液及氨基化石墨烯负载金纳米棒分散液的制备，步骤如下：
（1）制备金纳米棒分散液
将氯金酸溶液（250 µL，10 mM）和十六烷基三甲基溴化铵溶液（7.5 mL，100 mM）加入20mL烧瓶中，放置于30 ℃油浴锅中，磁力搅拌10 min，然后，在搅拌下将新鲜制备的冰冷的硼氢化钠溶液（600 µL，10 mM）快速加入到溶液中，2 min后停止搅拌，得到的棕黄色溶液并在30 ℃保存3 h用于随后的金纳米棒的生长，在生长溶液中，将十六烷基三甲基溴化铵溶液（40.0 mL，100 mM），氯金酸溶液（1.7 mL，10 mM）和硝酸银溶液（250 µL，10 mM）混合搅拌均匀，将抗坏血酸溶液（270 µL，100 mM）缓慢加入到溶液中，最后，将200 µL ~ 500 µL金晶种溶液加入到上述生长溶液，并在静置于30 ℃水浴锅中反应15 h，离心，用超纯水洗涤，将所得到的沉淀重新分散于20 mL超纯水，得到金纳米棒分散液并储存在4 ℃的冰箱中；
（2）制备氨基化石墨烯负载金纳米棒分散液
向20.0 mg制备的氨基化石墨烯加入5.0 mL ~ 15.0 mL金纳米棒分散液（1.0 mg/mL），然后将混合物超声1 h，离心后，黑色沉淀物在室温下干燥，然后，将20.0 mg黑色粉末再分散在5.0 mL PBS（pH = 7.4）中。
如权利要求1所述的一种基于海胆状核壳型金@钯纳米球的免疫传感器的制备方法，所述海胆状核壳型金@钯纳米球标记的人附睾蛋白4检测抗体分散液的制备，步骤如下：
（1）制备金纳米球分散液
将氯金酸溶液（0.5 mL，0.01 M），柠檬酸钠溶液（0.5 mL，0.01 M）和超纯水（19.0 mL）依次加入至50 mL烧瓶中，然后将新鲜制备的冰冷的硼氢化钠溶液（0.6 mL，0.1 M），加入至上述溶液中，磁力搅拌2 min然后停止搅拌，保存在室温下3 h，得到柠檬酸钠稳定的种子溶液，将氯金酸溶液（1.2 mL，0.01 M）和新鲜制备的抗坏血酸溶液（0.25 mL，0.1 M）与十六烷基三甲基溴化铵溶液（45.0 mL，0.08 M）依次加入至100 mL烧瓶中，然后在剧烈搅拌下加入柠檬酸钠稳定的晶种溶液（10.0 mL），将混合溶液保存在室温下反应5 h，得到金纳米球分散液；
（2）制备海胆状核壳型金@钯纳米球分散液
将氯代十六烷基吡啶溶液加至50 mL烧瓶中，在65 ℃油浴下，将四氯钯酸钠溶液（100µL，10 mM）和1.0 mL ~ 5.0 mL金纳米球依次加到上述烧瓶中，然后，注入新鲜制备的抗坏血酸溶液（200 µL，100 mM），在磁力搅拌下搅拌2 min后停止，将所得溶液反应30 min，离心（8000 rpm，5 min）收集黑色沉淀物，再分散在水中以供进一步使用；
（3）制备海胆状核壳型金@钯纳米球标记的人附睾蛋白4检测抗体分散液
取3.0 ~ 8.0 mg海胆状核壳型金@钯纳米球分散到1.0 mL、pH = 7.0的磷酸盐缓冲液中，加入1.0 ~ 2.0 mL、10.0 ~ 20.0 µg/mL的人附睾蛋白4检测抗体分散液，置于4 ℃恒温振荡培养箱中振荡孵化8 ~ 12 h后，在1000 rpm转速下离心0.5 ~ 1.5 min，得到下层沉淀，加入1.0 mL、pH = 7.0的磷酸盐缓冲溶液离心洗涤1次，将下层沉淀重新分散于1.0 mL、pH = 7.0的磷酸盐缓冲溶液中，分散均匀，得到海胆状核壳型金@钯纳米球标记的人附睾蛋白4检测抗体分散液，放置于4 ℃下保存。
如权利要求1所述的一种基于海胆状核壳型金@钯纳米球的免疫传感器的制备方法的制备，用于人附睾蛋白4抗原的检测，检测步骤如下：
（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的传感器为工作电极，在10 mL、50 mmol/L、pH 5.84 ~ 8.04的磷酸盐缓冲溶液中进行测试；
（2）用时间-电流法对分析物进行检测，输入电压为-0.4 V，取样间隔0.1 s，运行时间400 s；
（3）当背景电流趋于稳定后，每隔50 s向10 mL、50 mmol/L、pH = 7.4的磷酸盐缓冲溶液中注入10 µL、5 mol/L的双氧水溶液，记录电流变化。
根据权利要求1、2、3、4和5所述的人附睾蛋白4抗原，其特征在于，所述卵巢癌标志物选自下列之一：人附睾蛋白4抗原HE4、糖链抗原CA125。
本发明的有益成果
（1）本发明利用氨基化石墨烯负载金纳米棒作为基底，氨基化石墨烯具有较大的比表面积，能够负载更多的金纳米棒，同时金纳米棒具有良好的生物相容性、导电性，既能有效增加人附睾蛋白4负载量，又能够加速电极表面的电子传递效率，对于提高免疫传感器的灵敏度具有重要作用。
（2）本发明首次将具有特殊形貌的海胆状核壳型金@钯纳米球作为人附睾蛋白4检测抗体的标记物用于免疫传感器的构建，所述的标记物由于其特殊的形状能够提供大量的催化活性位点，金与钯之间的协同作用能加速电子的转移速率，从而有效放大电信号，提高免疫传感器的灵敏度，降低免疫传感器的检测下限。
（3）本发明的电化学免疫传感器对人附睾蛋白4抗原实现了精确定量检测的目的，其线性检测范围是1.0 pM ~ 50 nM，最低检测下限为0.33 pM。
（4）本发明的方法构建的电化学免疫传感器，操作简单、检测迅速，可用于实际样品的快速检测。
具体实施方式
现将本发明通过具体实施方式进一步说明，但不限于此
实施例1. 一种基于海胆状核壳型金@钯纳米球的免疫传感器的制备方法，操作步骤如下：
（1）将直径为4.0 mm的玻碳电极用氧化铝抛光粉抛光成镜面，在无水乙醇中超声清洗干净；
（2）取6.0 µL、2.0 mg/mL的氨基化石墨烯负载金纳米棒分散液滴加到电极表面，室温下晾干，用超纯水冲洗电极表面，晾干；
（3）继续将6.0 µL、10.0 µg/mL的人附睾蛋白4捕获抗体滴加到电极表面，4 ℃冰箱中干燥；
（4）继续将3.0 µL、1.0 wt%的BSA溶液滴加到电极表面，用以封闭电极表面上非特异性活性位点，pH = 7.0磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；
（5）滴加6.0 µL、10 nM的一系列不同浓度的人附睾蛋白4抗原溶液，pH = 7.0磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4.0 ℃冰箱中晾干；
（6）将6.0 µL、1.0 mg/mL的海胆状核壳型金@钯纳米球标记的人附睾蛋白4检测抗体分散液滴涂于电极表面，静置于4 ℃冰箱中30 min，用pH = 7.0的磷酸盐缓冲液冲洗，置于4℃冰箱中晾干，制得一种基于海胆状核壳型金@钯纳米球的免疫传感器的工作电极。
实施例2. 一种基于海胆状核壳型金@钯纳米球的免疫传感器的制备方法，操作步骤如下：
（1）将直径为4.0 mm的玻碳电极用氧化铝抛光粉抛光成镜面，在无水乙醇中超声清洗干净；
（2）取6.0 µL、2.0 mg/mL的氨基化石墨烯负载金纳米棒分散液滴加到电极表面，室温下晾干，用超纯水冲洗电极表面，晾干；
（3）继续将6.0 µL、10.0 µg/mL的人附睾蛋白4捕获抗体滴加到电极表面，4 ℃冰箱中干燥；
（4）继续将3.0 µL、1.0 wt%的BSA溶液滴加到电极表面，用以封闭电极表面上非特异性活性位点，pH = 7.0磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；
（5）滴加6.0 µL、10 nM的一系列不同浓度的人附睾蛋白4抗原溶液，pH = 7.0磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；
（6）将6.0 µL、2.0 mg/mL的海胆状核壳型金@钯纳米球标记的人附睾蛋白4检测抗体分散液滴涂于电极表面，静置于4 ℃冰箱中30 min，用pH = 7.0的磷酸盐缓冲液冲洗，置于4℃冰箱中晾干，制得一种基于海胆状核壳型金@钯纳米球的免疫传感器的工作电极。
实施例3. 一种基于海胆状核壳型金@钯纳米球的免疫传感器的制备方法，操作步骤如下：
（1）将直径为4.0 mm的玻碳电极用氧化铝抛光粉抛光成镜面，在无水乙醇中超声清洗干净；
（2）取6.0 µL、2.0 mg/mL的氨基化石墨烯负载金纳米棒分散液滴加到电极表面，室温下晾干，用超纯水冲洗电极表面，晾干；
（3）继续将6.0 µL、10.0 µg/mL的人附睾蛋白4捕获抗体滴加到电极表面，4 ℃冰箱中干燥；
（4）继续将3.0 µL、1.0 wt%的BSA溶液滴加到电极表面，用以封闭电极表面上非特异性活性位点，pH = 7.0磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；
（5）滴加6.0 µL、10 nM的一系列不同浓度的人附睾蛋白4抗原溶液，pH = 7.0磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；
（6）将6.0 µL、3.0 mg/mL的海胆状核壳型金@钯纳米球标记的人附睾蛋白4检测抗体分散液滴涂于电极表面，静置于4 ℃冰箱中30 min，用pH = 7.0的磷酸盐缓冲液冲洗，置于4℃冰箱中晾干，制得一种基于海胆状核壳型金@钯纳米球的免疫传感器的工作电极。
实施例4. 一种基于海胆状核壳型金@钯纳米球的免疫传感器的制备方法中所述，金纳米棒分散液及氨基化石墨烯负载金纳米棒分散液的制备包括以下步骤：
（1）制备金纳米棒分散液
将氯金酸溶液（250 µL，10 mM）和十六烷基三甲基溴化铵溶液（7.5 mL，100 mM）加入20mL烧瓶中，放置于30 ℃油浴锅中，磁力搅拌10 mim，然后，在搅拌下将新鲜制备的冰冷的硼氢化钠溶液（600 µL，10 mM）快速加入到溶液中，2 min后停止搅拌，得到的棕黄色溶液并在30 ℃保存3 h用于随后的金纳米棒的生长，在生长溶液中，将十六烷基三甲基溴化铵溶液（40.0 mL，100 mM），氯金酸溶液（1.7 mL，10 mM）和硝酸银溶液（250 µL，10 mM）混合搅拌均匀，将抗坏血酸溶液（270 µL，100 mM）缓慢加入到溶液中，最后，将200 µL ~ 500 µL金晶种溶液加入到上述生长溶液，并在静置于30 ℃水浴锅中反应15 h，离心，用超纯水洗涤，将所得到的沉淀重新分散于20.0 mL超纯水，得到金纳米棒分散液并储存在4 ℃的冰箱中；
（2）制备氨基化石墨烯负载金纳米棒分散液
向20.0 mg制备的氨基化石墨烯加入5.0 mL金纳米棒分散液（1.0 mg/mL），然后将混合物超声1 h，离心后，黑色沉淀物在室温下干燥，然后，将20.0 mg黑色粉末再分散在5.0 mLPBS（pH = 7.4）中。
实施例5. 一种基于海胆状核壳型金@钯纳米球的免疫传感器的制备方法中所述，金纳米棒分散液及氨基化石墨烯负载金纳米棒分散液的制备包括以下步骤：
（1）制备金纳米棒分散液
将氯金酸溶液（250 µL，10 mM）和十六烷基三甲基溴化铵溶液（7.5 mL，100 mM）加入20mL烧瓶中，放置于30 ℃油浴锅中，磁力搅拌10 mim，然后，在搅拌下将新鲜制备的冰冷的硼氢化钠溶液（600 µL，10 mM）快速加入到溶液中，2 min后停止搅拌，得到的棕黄色溶液并在30 ℃保存3 h用于随后的金纳米棒的生长，在生长溶液中，将十六烷基三甲基溴化铵溶液（40.0 mL，100 mM），氯金酸溶液（1.7 mL，10 mM）和硝酸银溶液（250 µL，10 mM）混合搅拌均匀，将抗坏血酸溶液（270 µL，100 mM）缓慢加入到溶液中，最后，将200 µL ~ 500 μL金晶种溶液加入到上述生长溶液，并在静置于30 ℃水浴锅中反应15 h，离心，用超纯水洗涤，将所得到的沉淀重新分散于20.0 mL超纯水，得到金纳米棒分散液并储存在4 ℃的冰箱中；
（2）制备氨基化石墨烯负载金纳米棒分散液
向20.0 mg制备的氨基化石墨烯加入10.0 mL金纳米棒分散液（1.0 mg/mL），然后将混合物超声1 h离心后，黑色沉淀物在室温下干燥，然后，将20.0 mg黑色粉末再分散在5.0 mLPBS（pH = 7.4）中。
实施例6. 一种基于海胆状核壳型金@钯纳米球的免疫传感器的制备方法中所述，金纳米棒分散液及氨基化石墨烯负载金纳米棒分散液的制备包括以下步骤：
（1）制备金纳米棒分散液
将氯金酸溶液（250 µL，10 mM）和十六烷基三甲基溴化铵溶液（7.5 mL，100 mM）加入20mL烧瓶中，放置于30 ℃油浴锅中，磁力搅拌10 mim，然后，在搅拌下将新鲜制备的冰冷的硼氢化钠溶液（600 µL，10 mM）快速加入到溶液中，2 min后停止搅拌，得到的棕黄色溶液并在30 ℃保存3 h用于随后的金纳米棒的生长，在生长溶液中，将十六烷基三甲基溴化铵溶液（40.0 mL，100 mM），氯金酸溶液（1.7 mL，10 mM）和硝酸银溶液（250 µL，10 mM）混合搅拌均匀，将抗坏血酸溶液（270 µL，100 mM）缓慢加入到溶液中，最后，将200 µL ~ 500 µL金晶种溶液加入到上述生长溶液，并在静置于30 ℃水浴锅中反应15 h，离心，用超纯水洗涤，将所得到的沉淀重新分散于20.0 mL超纯水，得到金纳米棒分散液并储存在4 ℃的冰箱中；
（2）制备氨基化石墨烯负载金纳米棒分散液
向20.0 mg制备的氨基化石墨烯加入15.0 mL金纳米棒分散液（1.0 mg/mL），然后将混合物超声1 h，离心后，黑色沉淀物在室温下干燥，然后，将20.0 mg黑色粉末再分散在5.0mL PBS（pH = 7.4）中。
实施例7. 一种基于海胆状核壳型金@钯纳米球的免疫传感器的制备方法中所述，海胆状核壳型金@钯纳米球标记的人附睾蛋白4检测抗体分散液的制备包括以下步骤：
（1）制备金纳米球分散液
将氯金酸溶液（0.5 mL，0.01 M），柠檬酸钠溶液（0.5 mL，0.01 M）和超纯水（19.0 mL）依次加入至50 mL烧瓶中，然后将新鲜制备的冰冷的硼氢化钠溶液（0.6 mL，0.1 M），加入至上述溶液中，磁力搅拌2 min然后停止搅拌，保存在室温下3 h，得到柠檬酸钠稳定的种子溶液，将氯金酸溶液（1.2 mL，0.01 M）和新鲜制备的抗坏血酸溶液（0.25 mL，0.1 M）与十六烷基三甲基溴化铵溶液（45.0 mL，0.08 M）依次加入至100 mL烧瓶中，然后在剧烈搅拌下加入柠檬酸钠稳定的晶种溶液（10.0 mL），将混合溶液保存在室温下反应5 h，得到金纳米球分散液；
（2）制备海胆状核壳型金@钯纳米球分散液
将氯代十六烷基吡啶溶液加至50 mL烧瓶中，在65 ℃油浴下，将四氯钯酸钠溶液（100µL，10 mM）和1.0 mL ~ 5.0 mL金纳米球依次加到上述烧瓶中，然后，注入新鲜制备的抗坏血酸溶液（200 µL，100 mM），在磁力搅拌下搅拌2 min后停止，将所得溶液反应30 min，离心（8000 rpm，5 min）收集黑色沉淀物，再分散在水中以供进一步使用；
（3）制备海胆状核壳型金@钯纳米球标记的人附睾蛋白4检测抗体分散液
取3.0 ~ 8.0 mg海胆状核壳型金@钯纳米球分散到1.0 mL、pH = 7.0的磷酸 盐缓冲液中，加入1.0 ~ 2.0 mL、10.0 ~ 20.0 µg/mL的人附睾蛋白4抗体检测分散液，置于4 ℃恒温振荡培养箱中振荡孵化8 ~ 12 h后，在1000 rpm转速下离心0.5 ~ 1.5 min，得到下层沉淀，加入1.0 mL、pH = 7.0的磷酸盐缓冲溶液离心洗涤1次，将下层沉淀重新分散于1.0 mL、pH = 7.0的磷酸盐缓冲溶液中，分散均匀，得到海胆状核壳型金@钯纳米球标记的人附睾蛋白4检测抗体分散液，放置于4 ℃下保存。
实施例8. 一种基于海胆状核壳型金@钯纳米球的免疫传感器的制备方法中所述，海胆状核壳型金@钯纳米球标记的人附睾蛋白4检测抗体分散液的制备包括以下步骤：
（1）制备金纳米球分散液
将氯金酸溶液（0.5 mL，0.01 M），柠檬酸钠溶液（0.5 mL，0.01 M）和超纯水（19.0 mL）依次加入至50 mL烧瓶中，然后将新鲜制备的冰冷的硼氢化钠溶液（0.6 mL，0.1 M），加入至上述溶液中，磁力搅拌2 min然后停止搅拌，保存在室温下3 h，得到柠檬酸钠稳定的种子溶液，将氯金酸溶液（1.2 mL，0.01 M）和新鲜制备的抗坏血酸溶液（0.25 mL，0.1 M）与十六烷基三甲基溴化铵溶液（45.0 mL，0.08 M）依次加入至100 mL烧瓶中，然后在剧烈搅拌下加入柠檬酸钠稳定的晶种溶液（10.0 mL），将混合溶液保存在室温下反应5.0 h，得到金纳米球分散液；
（2）制备海胆状核壳型金@钯纳米球分散液
将氯代十六烷基吡啶溶液加至50 mL烧瓶中，在65 ℃油浴下，将四氯钯酸钠溶液（100µL，10 mM）和1.0 mL ~ 5.0 mL金纳米球依次加到上述烧瓶中，然后，注入新鲜制备的抗坏血酸溶液（200 µL，100 mM），在磁力搅拌下搅拌2 min后停止，将所得溶液反应30 min，离心（8000 rpm，5 min）收集黑色沉淀物，再分散在水中以供进一步使用；
（3）制备海胆状核壳型金@钯纳米球标记的人附睾蛋白4抗体检测分散液
取4.0 mg海胆状核壳型金@钯纳米球分散到1.0 mL、pH = 7.0的磷酸 盐缓冲液中，加入1.0 ~ 2.0 mL、10.0 ~ 20.0 µg/mL的人附睾蛋白4检测抗体分散液，置于4 ℃恒温振荡培养箱中振荡孵化8 ~ 12 h后，在1000 rpm转速下离心0.5 ~ 1.5 min，得到下层沉淀，加入1.0 mL、pH = 7.0的磷酸盐缓冲溶液离心洗涤1次，将下层沉淀重新分散于1.0 mL、pH =7.0的磷酸盐缓冲溶液中，分散均匀，得到海胆状核壳型金@钯纳米球标记的人附睾蛋白4检测抗体分散液，放置于4 ℃下保存。
实施例9. 一种基于海胆状核壳型金@钯纳米球的免疫传感器的制备方法中所述，海胆状核壳型金@钯纳米球标记的人附睾蛋白4检测抗体分散液的制备包括以下步骤：
（1）制备金纳米球分散液
将氯金酸溶液（0.5 mL，0.01 M），柠檬酸钠溶液（0.5 mL，0.01 M）和超纯水（19.0 mL）依次加入至50 mL烧瓶中，然后将新鲜制备的冰冷的硼氢化钠溶液（0.6 mL，0.1 M），加入至上述溶液中，磁力搅拌2 min然后停止搅拌，保存在室温下3 h，得到柠檬酸钠稳定的种子溶液，将氯金酸溶液（1.2 mL，0.01 M）和新鲜制备的抗坏血酸溶液（0.25 mL，0.1 M）与十六烷基三甲基溴化铵溶液（45.0 mL，0.08 M）依次加入至100 mL烧瓶中，然后在剧烈搅拌下加入柠檬酸钠稳定的晶种溶液（10.0 mL），将混合溶液保存在室温下反应5 h，得到金纳米球分散液；
（2）制备海胆状核壳型金@钯纳米球分散液
将氯代十六烷基吡啶溶液加至50 mL烧瓶中，在65 ℃油浴下，将四氯钯酸钠溶液（100µL，10 mM）和1.0 mL ~ 5.0 mL金纳米球依次加到上述烧瓶中，然后，注入新鲜制备的抗坏血酸溶液（200 µL，100 mM），在磁力搅拌下搅拌2 min后停止，将所得溶液反应30 min，离心（8000 rpm，5 min）收集黑色沉淀物，再分散在水中以供进一步使用；
（3）制备海胆状核壳型金@钯纳米球标记的人附睾蛋白4检测抗体分散液
取6.0 mg海胆状核壳型金@钯纳米球分散到1.0 mL、pH = 7.0的磷酸盐缓冲液中，加入1.0 ~ 2.0 mL、10.0 ~ 20.0 µg/mL的人附睾蛋白4检测抗体分散液，置于4 ℃恒温振荡培养箱中振荡孵化8 ~ 12 h后，在1000 rpm转速下离心0.5 ~ 1.5 min，得到下层沉淀，加入1.0 mL、pH = 7.0的磷酸盐缓冲溶液离心洗涤1次，将下层沉淀重新分散于1.0 mL、pH =7.0的磷酸盐缓冲溶液中，分散均匀，得到海胆状核壳型金@钯纳米球标记的人附睾蛋白4检测抗体分散液，放置于4 ℃下保存。
实施例10. 所构建的免疫传感器，用于人附睾蛋白4抗原的检测，检测步骤如下：
（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的传感器为工作电极，在10 mL、50 mmol/L、pH = 7.4的磷酸盐缓冲溶液中进行测试；
（2）用时间-电流法对分析物进行检测，输入电压为-0.4 V，取样间隔0.1 s，运行时间400 s；
（3）当背景电流趋于稳定后，每隔50 s向10 mL、50 mmol/L、pH = 7.4的磷酸盐缓冲溶液中注入10 µL、5 mol/L的双氧水溶液，记录电流变化；
（4）根据所得电流强度与人附睾蛋白4抗原浓度之间的线性关系，绘制工作曲线，测得其线性范围为1 pmol/mL ~ 50 nmol/mL，检测限为0.33 pmol/mL。
糖链抗原CA125的检测：
绘制工作曲线步骤同实例10，按照绘制工作曲线的方法对糖链抗原CA125进行样品分析，测得其线性范围为6.0 pmol/mL ~ 30 nmol/mL，检测限为2 pmol/mL。

Claims (6)

1.一种基于海胆状核壳型金@钯纳米球的免疫传感器的制备方法，其特征包括以下几个步骤：
（1）将直径为3.0 ~ 5.0 mm的玻碳电极用氧化铝抛光粉抛光成镜面，在无水乙醇中超声清洗干净；
（2）取6.0 µL、0.5 ~ 4.0 mg/mL的氨基化石墨烯负载金纳米棒分散液滴加到电极表面，室温下晾干，用超纯水冲洗电极表面，晾干；
（3）继续将6.0 µL、5.0 ~ 15.0 µg/mL的人附睾蛋白4捕获抗体滴加到电极表面，4 ℃冰箱中干燥；
（4）继续将3.0 µL、1.0 ~ 2.0 wt%的BSA溶液滴加到电极表面，用以封闭电极表面上非特异性活性位点，pH = 7.0磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；
（5）滴加6.0 µL、1 nM ~ 50 nM的一系列不同浓度的人附睾蛋白4抗原溶液，pH = 7.0磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；
（6）将6.0 µL、1.0 ~ 4.0 mg/mL的海胆状核壳型金@钯纳米球标记的人附睾蛋白4抗体检测分散液滴涂于电极表面，静置于4 ℃冰箱中30 ~ 40 min，用pH = 7.0的磷酸盐缓冲液冲洗，置于4 ℃冰箱中晾干，制得一种检测人附睾蛋白4抗原的电流型免疫传感器的工作电极。
2.如权利要求1所述的一种基于海胆状核壳型金@钯纳米球的免疫传感器的制备方法，所述氨基化石墨烯的制备，步骤如下：
（1）制备氧化石墨烯
将4.0 g石墨和1.0 g硝酸钠置于2000 mL烧杯中，在冰水浴环境中磁力搅拌下缓慢加入192 mL浓硫酸，随后缓慢加入24.0 g高锰酸钾并剧烈搅拌，冰水浴下反应1 h，然后向该混合物转移至35 ℃油浴锅中反应2 h，升温至55 ℃，反应1.5 h，然后将160 mL去离子水逐滴加入上述混合液并不停地用玻璃棒搅拌，再加入400 mL去离子水，最后将双氧水（20.0mL，30%）加入混合液中，反应10 min，静置过夜，取下层沉淀透析一周，经超声波分散（140W，1.0 h），离心（6000 rpm，10 min）收集上清液并冷冻干燥24 h得到氧化石墨烯；
（2）制备氨基化石墨烯分散液
在超声处理下将100.0 mg氧化石墨烯加入到40.0 mL乙二醇中，超声1 h，将1.0 mL浓氨水加入上述溶液中，得到深棕色溶液，随后把混合溶液转移至高压反应釜中，在180 ℃下进行溶剂热反应10 h，反应后，过滤沉淀物，用蒸馏水重复洗涤至中性，冷冻干燥24 h，得到片状氨基化石墨烯固体，再次分散于5.0 mL去离子水中，得到氨基化石墨烯分散液，保存于4 ℃为进一步使用。
3.如权利要求1所述的一种基于海胆状核壳型金@钯纳米球的免疫传感器的制备方法，所述金纳米棒分散液及氨基化石墨烯负载金纳米棒分散液的制备，步骤如下：
（1）制备金纳米棒分散液
将氯金酸溶液（250 µL，10 mM）和十六烷基三甲基溴化铵溶液（7.5 mL，100 mM）加入20mL烧瓶中，放置于30 ℃油浴锅中，磁力搅拌10 min，然后，在搅拌下将新鲜制备的冰冷的硼氢化钠溶液（600 µL，10 mM）快速加入到溶液中，2 min后停止搅拌，得到的棕黄色溶液并在30 ℃保存3 h用于随后的金纳米棒的生长，在生长溶液中，将十六烷基三甲基溴化铵溶液（40.0 mL，100 mM），氯金酸溶液（1.7 mL，10 mM）和硝酸银溶液（250 µL，10 mM）混合搅拌均匀，将抗坏血酸溶液（270 µL，100 mM）缓慢加入到溶液中，最后，将200 µL ~ 500 µL金晶种溶液加入到上述生长溶液，并在静置于30 ℃水浴锅中反应15 h，离心，用超纯水洗涤，将所得到的沉淀重新分散于20 mL超纯水，得到金纳米棒分散液并储存在4 ℃的冰箱中；
（2）制备氨基化石墨烯负载金纳米棒分散液
向20.0 mg制备的氨基化石墨烯加入5.0 mL ~ 15.0 mL金纳米棒分散液（1.0 mg/mL），然后将混合物超声1 h，离心后，黑色沉淀物在室温下干燥，然后，将20.0 mg黑色粉末再分散在5.0 mL PBS（pH = 7.4）中。
4.如权利要求1所述的一种基于海胆状核壳型金@钯纳米球的免疫传感器的制备方法，所述海胆状核壳型金@钯纳米球标记的人附睾蛋白4检测抗体分散液的制备，步骤如下：
（1）制备金纳米球分散液
将氯金酸溶液（0.5 mL，0.01 M），柠檬酸钠溶液（0.5 mL，0.01 M）和超纯水（19.0 mL）依次加入至50 mL烧瓶中，然后将新鲜制备的冰冷的硼氢化钠溶液（0.6 mL，0.1 M），加入至上述溶液中，磁力搅拌2 min然后停止搅拌，保存在室温下3 h，得到柠檬酸钠稳定的种子溶液，将氯金酸溶液（1.2 mL，0.01 M）和新鲜制备的抗坏血酸溶液（0.25 mL，0.1 M）与十六烷基三甲基溴化铵溶液（45.0 mL，0.08 M）依次加入至100 mL烧瓶中，然后在剧烈搅拌下加入柠檬酸钠稳定的晶种溶液（10.0 mL），将混合溶液保存在室温下反应5 h，得到金纳米球分散液；
（2）制备海胆状核壳型金@钯纳米球分散液
将氯代十六烷基吡啶溶液加至50 mL烧瓶中，在65 ℃油浴下，将四氯钯酸钠溶液（100µL，10 mM）和1.0 mL ~ 5.0 mL金纳米球依次加到上述烧瓶中，然后，注入新鲜制备的抗坏血酸溶液（200 µL，100 mM），在磁力搅拌下搅拌2 min后停止，将所得溶液反应30 min，离心（8000 rpm，5 min）收集黑色沉淀物，再分散在水中以供进一步使用；
（3）制备海胆状核壳型金@钯纳米球标记的人附睾蛋白4检测抗体分散液
取3.0 ~ 8.0 mg海胆状核壳型金@钯纳米球分散到1.0 mL、pH = 7.0的磷酸盐缓冲液中，加入1.0 ~ 2.0 mL、10.0 ~ 20.0 µg/mL的人附睾蛋白4检测抗体分散液，置于4 ℃恒温振荡培养箱中振荡孵化8 ~ 12 h后，在1000 rpm转速下离心0.5 ~ 1.5 min，得到下层沉淀，加入1.0 mL、pH = 7.0的磷酸盐缓冲溶液离心洗涤1次，将下层沉淀重新分散于1.0 mL、pH = 7.0的磷酸盐缓冲溶液中，分散均匀，得到海胆状核壳型金@钯纳米球标记的人附睾蛋白4检测抗体分散液，放置于4 ℃下保存。
5.如权利要求1所述的一种基于海胆状核壳型金@钯纳米球的免疫传感器的制备方法的制备，用于人附睾蛋白4抗原的检测，检测步骤如下：
（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的传感器为工作电极，在10 mL、50 mmol/L、pH 5.84 ~ 8.04的磷酸盐缓冲溶液中进行测试；
（2）用时间-电流法对分析物进行检测，输入电压为-0.4 V，取样间隔0.1 s，运行时间400 s；
（3）当背景电流趋于稳定后，每隔50 s向10 mL、50 mmol/L、pH = 7.4的磷酸盐缓冲溶液中注入10 µL、5 mol/L的双氧水溶液，记录电流变化。
6.根据权利要求1、2、3、4和5所述的人附睾蛋白4抗原，其特征在于，所述卵巢癌标志物选自下列之一：人附睾蛋白4抗原HE4、糖链抗原CA125。
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