CN106770530A - 一种鳞状细胞癌标志物夹心型免疫传感器的制备方法及应用 - Google Patents

一种鳞状细胞癌标志物夹心型免疫传感器的制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于新型功能材料与生物传感检测技术领域，提供了一种鳞状细胞癌标志物夹心型免疫传感器的制备方法及应用。具体是采用海胆状金钯@氨基化二硫化钼掺杂磺化碳纳米管作为检测抗体标记物，实现了鳞状细胞癌标志物SCCA的检测，具有特异性强，灵敏度高，检测限低，对鳞状细胞癌的检测具有重要的科学意义和应用价值。

Description

一种鳞状细胞癌标志物夹心型免疫传感器的制备方法及应用
技术领域
本发明属于免疫分析和生物传感技术领域，提供了一种鳞状细胞癌标志物夹心型免疫传感器的制备方法及应用。
背景技术
血清中各种肿瘤标志物的灵敏测定对癌症的早期诊断起着重要的作用；
肿瘤标志物的灵敏检测，在临床上对于肿瘤的早期发现，肿瘤高危人群的筛选、良性和恶性肿瘤的鉴别诊断、肿瘤发展程度的判断，肿瘤的治疗效果的观察和评价及肿瘤复发和预后的预测产生极大的影响，因此建立快速、灵敏准确检测肿瘤标志物的分析方法成为了当今的研究热点，引起了大家的广泛关注。。
目前电化学免疫传感器已经广泛用于肿瘤标志物的检测，夹心型电化学免疫传感器结合了高特异性的免疫分析技术和高灵敏的电化学分析技术，具有灵敏度高、制备简单、检测快速、成本低等优点，在临床检验、环境监测、食品安全控制、生物监测等领域都有重要的应用价值。
随着纳米技术的发展，各种纳米粒子广泛的应用于传感器的构建过程中。氧化石墨烯表面有大量的羧基官能团，且具有大的比表面积，良好的电子传递能力和催化性能，能有效吸附固载抗体；负载金纳米粒子的石墨烯具有更好的导电性；二硫化钼是类石墨烯材料，具有很好的催化性能，氨基化二硫化钼掺杂磺化碳纳米管不仅具有碳纳米管及二硫化钼的优良性能，而且经过磺化、氨基化可以使其固载更多的抗体，大大增加测定的灵敏度；海胆状金钯具有大比表面积，不仅可以起固定抗体，防止碳纳米管堆叠的作用，而且枝晶状的钯纳米材料大大增加了与过氧化氢的接触面积，提高了对过氧化氢的催化效果，因此，海胆状金钯@氨基化二硫化钼掺杂磺化碳纳米管对过氧化氢的催化作用呈多重的放大作用，从而提高了传感器的灵敏度，降低了检测限。
发明内容
本发明提供了一种鳞状细胞癌标志物夹心型免疫传感器的制备方法及应用，实现了对鳞状细胞癌标志物的超灵敏检测。
本发明的目的之一是提供一种鳞状细胞癌标志物夹心型免疫传感器的制备方法。
本发明的目的之二是将所制备的一种鳞状细胞癌标志物夹心型免疫传感器应用于鳞状细胞癌标志物的高灵敏、特异性检测。
本发明的技术方案，包括以下步骤。
1. 一种鳞状细胞癌标志物夹心型免疫传感器的制备方法，步骤如下：
（1） 将直径为3 ~ 5mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨，超纯水清洗干净；
（2） 取6 µL、1.0 ~ 2.0mg/mL的Au@GS滴加到电极表面，室温下晾干，用超纯水冲洗电极表面，晾干；
（3） 继续将6 µL、5 ~ 15 µg/mL的鳞状细胞癌标志物捕获抗体滴加到电极表面，超纯水冲洗，4 ℃冰箱中干燥；
（4） 继续将3 µL、1.5 ~ 3.0 mg/mL的BSA溶液滴加到电极表面，用以封闭电极表面上非特异性活性位点，超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；滴加6µL、0.0005 ~ 50ng/mL的一系列不同浓度的鳞状细胞癌抗原溶液，超纯水冲洗电极表面，4℃冰箱中干燥；
（5） 将6 µL、2.0~ 3.0 mg/mL的海胆状金钯@氨基化二硫化钼掺杂磺化碳纳米管检测抗体孵化物溶液，滴涂于电极表面，置于4℃冰箱中晾干，制得一种鳞状细胞癌标志物夹心型免疫传感器。
2.一种鳞状细胞癌标志物夹心型免疫传感器的制备方法，所述Au@GS的制备，步骤如下：
取8 ~ 16 mg氧化石墨烯溶解在10 mL的超纯水中，超声50 ~70 min，依次加入200 µL、质量分数为1%的HAuCl4，20 µL、含1%柠檬酸钠的聚乙二醇溶液，在180℃下反应8 ~ 12h，冷却至室温，离心、超纯水洗涤各三次，所得固体于60˚C真空干燥箱内干燥10 ~ 14 h，制得Au@GS；
所述含1%柠檬酸钠的聚乙二醇溶液是将0.1g柠檬酸钠固体溶解于9.9g聚乙二醇制得。
3.一种鳞状细胞癌标志物夹心型免疫传感器的制备方法，所述海胆状金钯@氨基化二硫化钼掺杂磺化碳纳米管检测抗体孵化物溶液的制备，包括以下步骤：
(1) 氨基化二硫化钼掺杂磺化碳纳米管的制备
将0.5 ~ 1.5 g 碳纳米管置于250mL三口烧瓶中，依次加入60 mL的浓硫酸和20 mL的浓硝酸，在100℃下油浴加热反应2 h，冷却至室温后，将所得悬浊液移入500 mL烧杯，加300mL超纯水稀释，抽滤，用超纯水洗涤至滤液成中性，所得固体在60˚C真空干燥箱内干燥10 ~14 h，制得磺化碳纳米管；
将4 ~ 8 mg上述磺化碳纳米管和15 ~ 30 mg (NH4)2MoS4溶解在15 ~ 30 mL二甲基甲酰胺中，超声30 min后，在210℃条件下反应18 h，冷却至室温，离心、超纯水、无水乙醇分别洗涤三次， 60℃下干燥24 h，得到二硫化钼掺杂磺化碳纳米管；
将0.1 ~ 0.3 g 上述二硫化钼掺杂磺化碳纳米管置于10 mL无水乙醇中超声10 min，在搅拌条件下缓慢加入 0.1 ~ 0.3 mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷， 70℃下搅拌反应1.5 ~ 2h，冷却至室温，离心、超纯水、无水乙醇分别洗涤三次， 60℃下干燥24 h，得到氨基化二硫化钼掺杂磺化碳纳米管；
(2) 海胆状金钯纳米粒子的制备
将1 ~ 2mL、质量分数为1%的 HAuCl4加入到99mL超纯水中，油浴加热到120℃，搅拌30min，然后加入10 mL、质量分数为1%的柠檬酸钠，加热20 ~ 30 min后，制得金纳米粒子溶液；
取10mL 金纳米粒子溶液在8000 ~ 10000 rpm条件下，离心6 ~ 10 min，将所得沉淀物分散在10 mL含0.05 moL.L-1的十六烷基三甲基溴化铵和0.0126 moL.L-1的5-溴水杨酸的混合溶液中，离心，超纯水洗涤三次,再分散到10 mL超纯水中备用；将上述分散好的10 mL溶液和40 ~ 60 mL 1 m moL.L-1的H2PdCl4溶液依次加入到100 mL的圆底烧瓶中，超声1 ~3 min，加入10 ~ 15 mL、10 m moL.L-1的抗坏血酸溶液，倒置10 ~ 30 s，静置6 h，离心、超纯水洗涤三次，室温下干燥24h, 制得海胆状金钯纳米粒子；
将50mg海胆状金钯纳米粒子分散到50mL超纯水中，制得1 mg.mL-1的海胆状金钯纳米粒子溶液备用；
(3) 海胆状金钯@氨基化二硫化钼掺杂磺化碳纳米管检测抗体孵化物溶液的制备
将20 ~ 30 mg上述步骤（1）制备的氨基化二硫化钼掺杂磺化碳纳米管倒入20 ~ 40mL、1 mg.mL-1的海胆状金钯纳米粒子溶液中，超声1 h，过滤，室温下干燥20~24h，制得海胆状金钯@氨基化二硫化钼掺杂磺化碳纳米管；
将4~ 6 mg的海胆状金钯@氨基化二硫化钼掺杂磺化碳纳米管分散到1 ~ 2 mL超纯水中，加入100 μL、80 ~ 120 μg/mL的鳞状细胞癌标志物检测抗体溶液和900 μL、50 mmol/L的pH 7.4磷酸盐缓冲溶液，在4˚C恒温振荡培养箱中振荡孵化12 h；在4˚C下，6000 rpm转速下离心10 ~ 15 min，得到下层沉淀物，加入1 mL、50mmol/L 的pH=7.4磷酸盐缓冲溶液，制得海胆状金钯@氨基化二硫化钼掺杂磺化碳纳米管检测抗体孵化物溶液，4˚C下保存备用。
一种鳞状细胞癌标志物夹心型免疫传感器，用于鳞状细胞癌标志物的检测，步骤如下：
（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的传感器为工作电极，在10 mL、50 mmol/L的pH 5.10 ~ 7.98磷酸盐缓冲溶液中进行测试；
（2）用时间-电流法对分析物进行检测，输入电压为-0.4 V，取样间隔 0.1 s，运行时间400 s；
（3）当背景电流趋于稳定后，每隔50 s向10 mL、50 mmol/L的pH = 7.4磷酸盐缓冲溶液中注入10 μL、5 mol/L的双氧水溶液，记录电流变化。
上述鳞状细胞癌标志物为SCCA
本发明所用原材料均可在化学试剂公司或生物制药公司购买。
本发明的有益成果
（1） 本发明使用了负载金纳米粒子的石墨烯Au@GS作为基底，氧化石墨烯具有大的比表面积、良好的电子传递能力和催化性能，表面含有大量的亲水基团，且羧基能与抗体上的氨基有效结合，实现抗体的固载，金纳米粒子具有良好的导电性能、良好的好生物相容性，以及大的比表面积可以固载抗体，能够加速电子传递，对于提高传感器灵敏度具有重要作用；
（2）采用海胆状金钯@氨基化二硫化钼掺杂磺化碳纳米管作为检测抗体标记物，碳纳米管具有良好的生物相容性和导电性，而氨基化二硫化钼掺杂磺化碳纳米管能加快电子传递，二硫化钼纳米颗粒在碳纳米管上原位还原能有效避免石墨烯片层的堆叠，高度分散的二硫化钼有丰富的催化活性位点，对过氧化氢有良好的催化作用，海胆状金钯具有大比表面积，不仅可以起固定抗体，防止碳纳米管堆叠的作用，而且枝晶状的钯纳米材料大大增加了与过氧化氢的接触面积，提高了对过氧化氢的催化效果对过氧化氢有催化作用，因此，海胆状金钯@氨基化二硫化钼掺杂磺化碳纳米管对过氧化氢的催化作用呈多重的放大作用，从而提高了传感器的灵敏度，降低了检测限；
（3）一种鳞状细胞癌标志物夹心型免疫传感器对鳞状细胞癌标志物SCCA的检测，其线性范围0.0005 ~ 50 ng/mL，检测限最低0.16 pg/mL，表明一种鳞状细胞癌标志物夹心型免疫传感器可以达到准确测定的目的。
具体实施方式
现将本发明通过具体实施方式进一步说明，但不限于此。
实施例1一种鳞状细胞癌标志物夹心型免疫传感器的制备方法，步骤如下：
（1） 将直径为3 mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨，超纯水清洗干净；
（2） 取6 µL、1.0 mg/mL的Au@GS滴加到电极表面，室温下晾干，用超纯水冲洗电极表面，晾干；
（3） 继续将6 µL、5 µg/mL的鳞状细胞癌标志物捕获抗体滴加到电极表面，超纯水冲洗，4 ℃冰箱中干燥；
（4） 继续将3 µL、1.5 mg/mL的BSA溶液滴加到电极表面，用以封闭电极表面上非特异性活性位点，超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；滴加6µL、0.0005 ~ 50ng/mL的一系列不同浓度的鳞状细胞癌抗原溶液，超纯水冲洗电极表面，4℃冰箱中干燥；
（5） 将6 µL、2.0 mg/mL的海胆状金钯@氨基化二硫化钼掺杂磺化碳纳米管检测抗体孵化物溶液，滴涂于电极表面，置于4℃冰箱中晾干，制得一种鳞状细胞癌标志物夹心型免疫传感器。
实施例2一种鳞状细胞癌标志物夹心型免疫传感器的制备方法，步骤如下：
（1） 将直径为4mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨，超纯水清洗干净；
（2） 取6 µL、1.5mg/mL的Au@GS滴加到电极表面，室温下晾干，用超纯水冲洗电极表面，晾干；
（3） 继续将6 µL、10 µg/mL的鳞状细胞癌标志物捕获抗体滴加到电极表面，超纯水冲洗，4 ℃冰箱中干燥；
（4） 继续将3 µL、2.5 mg/mL的BSA溶液滴加到电极表面，用以封闭电极表面上非特异性活性位点，超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；滴加6µL、0.0005 ~ 50ng/mL的一系列不同浓度的鳞状细胞癌抗原溶液，超纯水冲洗电极表面，4℃冰箱中干燥；
（5） 将6 µL、2.5 mg/mL的海胆状金钯@氨基化二硫化钼掺杂磺化碳纳米管检测抗体孵化物溶液，滴涂于电极表面，置于4℃冰箱中晾干，制得一种鳞状细胞癌标志物夹心型免疫传感器。
实施例3 一种鳞状细胞癌标志物夹心型免疫传感器的制备方法，步骤如下：
（1） 将直径为5mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨，超纯水清洗干净；
（2） 取6 µL、2.0mg/mL的Au@GS滴加到电极表面，室温下晾干，用超纯水冲洗电极表面，晾干；
（3） 继续将6 µL、15 µg/mL的鳞状细胞癌标志物捕获抗体滴加到电极表面，超纯水冲洗，4 ℃冰箱中干燥；
（4） 继续将3 µL、3.0 mg/mL的BSA溶液滴加到电极表面，用以封闭电极表面上非特异性活性位点，超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；滴加6µL、0.0005~ 50ng/mL的一系列不同浓度的鳞状细胞癌抗原溶液，超纯水冲洗电极表面，4℃冰箱中干燥；
（5） 将6 µL、3.0 mg/mL的海胆状金钯@氨基化二硫化钼掺杂磺化碳纳米管检测抗体孵化物溶液，滴涂于电极表面，置于4℃冰箱中晾干，制得一种鳞状细胞癌标志物夹心型免疫传感器。
实施例4 Au@GS的制备，步骤如下：
取8 mg氧化石墨烯溶解在10 mL的超纯水中，超声50 min，依次加入200 µL、质量分数为1%的HAuCl4，20 µL、含1%柠檬酸钠的聚乙二醇溶液，在180℃下反应8 h，冷却至室温，离心、超纯水洗涤各三次，所得固体于60˚C真空干燥箱内干燥10h，制得Au@GS；
所述含1%柠檬酸钠的聚乙二醇溶液是将0.1g柠檬酸钠固体溶解于9.9g聚乙二醇制得。
实施例5 Au@GS的制备，步骤如下：
取12 mg氧化石墨烯溶解在10 mL的超纯水中，超声60 min，依次加入200 µL、质量分数为1%的HAuCl4，20 µL、含1%柠檬酸钠的聚乙二醇溶液，在180℃下反应10h，冷却至室温，离心、超纯水洗涤各三次，所得固体于60˚C真空干燥箱内干燥12 h，制得Au@GS；
所述含1%柠檬酸钠的聚乙二醇溶液是将0.1g柠檬酸钠固体溶解于9.9g聚乙二醇制得。
实施例6 Au@GS的制备，步骤如下：
取16 mg氧化石墨烯溶解在10 mL的超纯水中，超声70 min，依次加入200 µL、质量分数为1%的HAuCl4，20 µL、含1%柠檬酸钠的聚乙二醇溶液，在180℃下反应12h，冷却至室温，离心、超纯水洗涤各三次，所得固体于60˚C真空干燥箱内干燥14 h，制得Au@GS；
所述含1%柠檬酸钠的聚乙二醇溶液是将0.1g柠檬酸钠固体溶解于9.9g聚乙二醇制得。
实施例7海胆状金钯@氨基化二硫化钼掺杂磺化碳纳米管检测抗体孵化物溶液的制备，包括以下步骤：
(1) 氨基化二硫化钼掺杂磺化碳纳米管的制备
将0.5g 碳纳米管置于250mL三口烧瓶中，依次加入60 mL的浓硫酸和20 mL的浓硝酸，在100℃下油浴加热反应2 h，冷却至室温后，将所得悬浊液移入500 mL烧杯，加300 mL超纯水稀释，抽滤，用超纯水洗涤至滤液成中性，所得固体在60˚C真空干燥箱内干燥10 h，制得磺化碳纳米管；
将4 mg上述磺化碳纳米管和15 mg (NH4)2MoS4溶解在15 mL二甲基甲酰胺中，超声30min后，在210℃条件下反应18 h，冷却至室温，离心、超纯水、无水乙醇分别洗涤三次， 60℃下干燥24 h，得到二硫化钼掺杂磺化碳纳米管；
将0.1g 上述二硫化钼掺杂磺化碳纳米管置于10 mL无水乙醇中超声10 min，在搅拌条件下缓慢加入 0.1 mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷， 70℃下搅拌反应1.5h，冷却至室温，离心、超纯水、无水乙醇分别洗涤三次， 60℃下干燥24 h，得到氨基化二硫化钼掺杂磺化碳纳米管；
(2) 海胆状金钯纳米粒子的制备
将1 mL、质量分数为1%的 HAuCl4加入到99mL超纯水中，油浴加热到120℃，搅拌30min，然后加入10 mL、质量分数为1%的柠檬酸钠，加热20 min后，制得金纳米粒子溶液；
取10mL 金纳米粒子溶液在8000 rpm条件下，离心6min，将所得沉淀物分散在10 mL含0.05 moL.L-1的十六烷基三甲基溴化铵和0.0126 moL.L-1的5-溴水杨酸的混合溶液中，离心，超纯水洗涤三次,再分散到10 mL超纯水中备用；将上述分散好的10 mL溶液和40 mL 1m moL.L-1的H2PdCl4溶液依次加入到100 mL的圆底烧瓶中，超声1min，加入10 mL、10mmoL.L-1的抗坏血酸溶液，倒置10 s，静置6 h，离心、超纯水洗涤三次，室温下干燥24h, 制得海胆状金钯纳米粒子；
将50mg海胆状金钯纳米粒子分散到50mL超纯水中，制得1 mg.mL-1的海胆状金钯纳米粒子溶液备用；
(3) 海胆状金钯@氨基化二硫化钼掺杂磺化碳纳米管检测抗体孵化物溶液的制备
将20 mg上述步骤（1）制备的氨基化二硫化钼掺杂磺化碳纳米管倒入20 mL、1 mg.mL-1的海胆状金钯纳米粒子溶液中，超声1h，过滤，室温下干燥20h，制得海胆状金钯@氨基化二硫化钼掺杂磺化碳纳米管；
将4 mg的海胆状金钯@氨基化二硫化钼掺杂磺化碳纳米管分散到1mL超纯水中，加入100 μL、80μg/mL的鳞状细胞癌标志物检测抗体溶液和900 μL、50 mmol/L的pH 7.4磷酸盐缓冲溶液，在4˚C恒温振荡培养箱中振荡孵化12 h；在4˚C下，6000 rpm转速下离心10 min，得到下层沉淀物，加入1 mL、50mmol/L 的pH=7.4磷酸盐缓冲溶液，制得海胆状金钯@氨基化二硫化钼掺杂磺化碳纳米管检测抗体孵化物溶液，4˚C下保存备用。
实施例8海胆状金钯@氨基化二硫化钼掺杂磺化碳纳米管检测抗体孵化物溶液的制备，包括以下步骤：
(1) 氨基化二硫化钼掺杂磺化碳纳米管的制备
将1.0 g 碳纳米管置于250mL三口烧瓶中，依次加入60 mL的浓硫酸和20 mL的浓硝酸，在100℃下油浴加热反应2 h，冷却至室温后，将所得悬浊液移入500 mL烧杯，加300 mL超纯水稀释，抽滤，用超纯水洗涤至滤液成中性，所得固体在60˚C真空干燥箱内干燥12 h，制得磺化碳纳米管；
将6mg上述磺化碳纳米管和25 mg (NH4)2MoS4溶解在25 mL二甲基甲酰胺中，超声30min后，在210℃条件下反应18 h，冷却至室温，离心、超纯水、无水乙醇分别洗涤三次， 60℃下干燥24 h，得到二硫化钼掺杂磺化碳纳米管；
将0.2g 上述二硫化钼掺杂磺化碳纳米管置于10 mL无水乙醇中超声10 min，在搅拌条件下缓慢加入 0.2 mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷， 70℃下搅拌反应1.8h，冷却至室温，离心、超纯水、无水乙醇分别洗涤三次， 60℃下干燥24 h，得到氨基化二硫化钼掺杂磺化碳纳米管；
(2) 海胆状金钯纳米粒子的制备
将1.5mL、质量分数为1%的 HAuCl4加入到99mL超纯水中，油浴加热到120℃，搅拌30min，然后加入10 mL、质量分数为1%的柠檬酸钠，加热25 min后，制得金纳米粒子溶液；
取10mL 金纳米粒子溶液在9000rpm条件下，离心6 ~ 10 min，将所得沉淀物分散在10mL含0.05 moL.L-1的十六烷基三甲基溴化铵和0.0126 moL.L-1的5-溴水杨酸的混合溶液中，离心，超纯水洗涤三次,再分散到10 mL超纯水中备用；将上述分散好的10 mL溶液和50mL 1 m moL.L-1的H2PdCl4溶液依次加入到100 mL的圆底烧瓶中，超声2min，加入12.5mL、10 m moL.L-1的抗坏血酸溶液，倒置20 s，静置6 h，离心、超纯水洗涤三次，室温下干燥24h, 制得海胆状金钯纳米粒子；
将50mg海胆状金钯纳米粒子分散到50mL超纯水中，制得1 mg.mL-1的海胆状金钯纳米粒子溶液备用；
(3) 海胆状金钯@氨基化二硫化钼掺杂磺化碳纳米管检测抗体孵化物溶液的制备
将25 mg上述步骤（1）制备的氨基化二硫化钼掺杂磺化碳纳米管倒入30 mL、1 mg.mL-1的海胆状金钯纳米粒子溶液中，超声1 h，过滤，室温下干燥22h，制得海胆状金钯@氨基化二硫化钼掺杂磺化碳纳米管；
将5 mg的海胆状金钯@氨基化二硫化钼掺杂磺化碳纳米管分散到1.5mL超纯水中，加入100 μL、100 μg/mL的鳞状细胞癌标志物检测抗体溶液和900 μL、50 mmol/L的pH 7.4磷酸盐缓冲溶液，在4˚C恒温振荡培养箱中振荡孵化12 h；在4˚C下，6000 rpm转速下离心12min，得到下层沉淀物，加入1 mL、50mmol/L 的pH=7.4磷酸盐缓冲溶液，制得海胆状金钯@氨基化二硫化钼掺杂磺化碳纳米管检测抗体孵化物溶液，4˚C下保存备用。
实施例9海胆状金钯@氨基化二硫化钼掺杂磺化碳纳米管检测抗体孵化物溶液的制备，包括以下步骤：
(1) 氨基化二硫化钼掺杂磺化碳纳米管的制备
将1.5 g 碳纳米管置于250mL三口烧瓶中，依次加入60 mL的浓硫酸和20 mL的浓硝酸，在100℃下油浴加热反应2 h，冷却至室温后，将所得悬浊液移入500 mL烧杯，加300 mL超纯水稀释，抽滤，用超纯水洗涤至滤液成中性，所得固体在60˚C真空干燥箱内干燥14 h，制得磺化碳纳米管；
将8 mg上述磺化碳纳米管和30 mg (NH4)2MoS4溶解在30 mL二甲基甲酰胺中，超声30min后，在210℃条件下反应18 h，冷却至室温，离心、超纯水、无水乙醇分别洗涤三次， 60℃下干燥24 h，得到二硫化钼掺杂磺化碳纳米管；
将0.3 g 上述二硫化钼掺杂磺化碳纳米管置于10 mL无水乙醇中超声10 min，在搅拌条件下缓慢加入 0.3 mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷， 70℃下搅拌反应2 h，冷却至室温，离心、超纯水、无水乙醇分别洗涤三次， 60℃下干燥24 h，得到氨基化二硫化钼掺杂磺化碳纳米管；
(2) 海胆状金钯纳米粒子的制备
将2mL、质量分数为1%的 HAuCl4加入到99mL超纯水中，油浴加热到120℃，搅拌30 min，然后加入10 mL、质量分数为1%的柠檬酸钠，加热30 min后，制得金纳米粒子溶液；
取10mL 金纳米粒子溶液在10000 rpm条件下，离心10 min，将所得沉淀物分散在10 mL含0.05 moL.L-1的十六烷基三甲基溴化铵和0.0126 moL.L-1的5-溴水杨酸的混合溶液中，离心，超纯水洗涤三次,再分散到10 mL超纯水中备用；将上述分散好的10 mL溶液和60 mL1 m moL.L-1的H2PdCl4溶液依次加入到100 mL的圆底烧瓶中，超声3 min，加入15 mL、10 mmoL.L-1的抗坏血酸溶液，倒置30 s，静置6 h，离心、超纯水洗涤三次，室温下干燥24h, 制得海胆状金钯纳米粒子；
将50mg海胆状金钯纳米粒子分散到50mL超纯水中，制得1 mg.mL-1的海胆状金钯纳米粒子溶液备用；
(3) 海胆状金钯@氨基化二硫化钼掺杂磺化碳纳米管检测抗体孵化物溶液的制备
将30 mg上述步骤（1）制备的氨基化二硫化钼掺杂磺化碳纳米管倒入40 mL、1 mg.mL-1的海胆状金钯纳米粒子溶液中，超声1 h，过滤，室温下干燥24h，制得海胆状金钯@氨基化二硫化钼掺杂磺化碳纳米管；
将6 mg的海胆状金钯@氨基化二硫化钼掺杂磺化碳纳米管分散到2 mL超纯水中，加入100 μL、120 μg/mL的鳞状细胞癌标志物检测抗体溶液和900 μL、50 mmol/L的pH 7.4磷酸盐缓冲溶液，在4˚C恒温振荡培养箱中振荡孵化12 h；在4˚C下，6000 rpm转速下离心15min，得到下层沉淀物，加入1 mL、50mmol/L 的pH=7.4磷酸盐缓冲溶液，制得海胆状金钯@氨基化二硫化钼掺杂磺化碳纳米管检测抗体孵化物溶液，4˚C下保存备用。
实施例10 鳞状细胞癌标志物SCCA的检测，步骤如下：
（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的传感器为工作电极，在10 mL、50 mmol/L的pH 5.10 ~ 7.98磷酸盐缓冲溶液中进行测试；
（2）用时间-电流法对分析物进行检测，输入电压为-0.4 V，取样间隔 0.1 s，运行时间400 s；
（3）当背景电流趋于稳定后，每隔50 s向10 mL、50 mmol/L的pH = 7.4磷酸盐缓冲溶液中注入10 μL、5 mol/L的双氧水溶液，记录电流变化;
（4）根据所得电流强度与SCCA浓度之间的线性关系，绘制工作曲线，测得线性范围为0.0005 ~ 50 ng/mL，检测限为0.16 pg/mL。

Claims (5)

1.一种鳞状细胞癌标志物夹心型免疫传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1） 将直径为3 ~ 5mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨，超纯水清洗干净；
（2） 取6 µL、1.0 ~ 2.0mg/mL的Au@GS滴加到电极表面，室温下晾干，用超纯水冲洗电极表面，晾干；
（3） 继续将6 µL、5 ~ 15 µg/mL的鳞状细胞癌标志物捕获抗体滴加到电极表面，超纯水冲洗，4 ℃冰箱中干燥；
（4） 继续将3 µL、1.5 ~ 3.0 mg/mL的BSA溶液滴加到电极表面，用以封闭电极表面上非特异性活性位点，超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；滴加6µL、0.0005 ~ 50ng/mL的一系列不同浓度的鳞状细胞癌抗原溶液，超纯水冲洗电极表面，4℃冰箱中干燥；
（5） 将6 µL、2.0~ 3.0 mg/mL的海胆状金钯@氨基化二硫化钼掺杂磺化碳纳米管检测抗体孵化物溶液，滴涂于电极表面，置于4℃冰箱中晾干，制得一种鳞状细胞癌标志物夹心型免疫传感器。
2.如权利要求1所述的一种鳞状细胞癌标志物夹心型免疫传感器的制备方法，所述Au@GS的制备，步骤如下：
取8 ~ 16 mg氧化石墨烯溶解在10 mL的超纯水中，超声50 ~70 min，依次加入200 µL、质量分数为1%的HAuCl4，20 µL、含1%柠檬酸钠的聚乙二醇溶液，在180℃下反应8 ~ 12h，冷却至室温，离心、超纯水洗涤各三次，所得固体于60˚C真空干燥箱内干燥10 ~ 14 h，制得Au@GS；
所述含1%柠檬酸钠的聚乙二醇溶液是将0.1g柠檬酸钠固体溶解于9.9g聚乙二醇制得。
3. 如权利要求1所述的一种鳞状细胞癌标志物夹心型免疫传感器的制备方法，所述海胆状金钯@氨基化二硫化钼掺杂磺化碳纳米管检测抗体孵化物溶液的制备，包括以下步骤：
(1) 氨基化二硫化钼掺杂磺化碳纳米管的制备
将0.5 ~ 1.5 g 碳纳米管置于250mL三口烧瓶中，依次加入60 mL的浓硫酸和20 mL的浓硝酸，在100℃下油浴加热反应2 h，冷却至室温后，将所得悬浊液移入500 mL烧杯，加300mL超纯水稀释，抽滤，用超纯水洗涤至滤液成中性，所得固体在60˚C真空干燥箱内干燥10 ~14 h，制得磺化碳纳米管；
将4 ~ 8 mg上述磺化碳纳米管和15 ~ 30 mg (NH4)2MoS4溶解在15 ~ 30 mL二甲基甲酰胺中，超声30 min后，在210℃条件下反应18 h，冷却至室温，离心、超纯水、无水乙醇分别洗涤三次， 60℃下干燥24 h，得到二硫化钼掺杂磺化碳纳米管；
将0.1 ~ 0.3 g 上述二硫化钼掺杂磺化碳纳米管置于10 mL无水乙醇中超声10 min，在搅拌条件下缓慢加入 0.1 ~ 0.3 mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷， 70℃下搅拌反应1.5 ~ 2h，冷却至室温，离心、超纯水、无水乙醇分别洗涤三次， 60℃下干燥24 h，得到氨基化二硫化钼掺杂磺化碳纳米管；
(2) 海胆状金钯纳米粒子的制备
将1 ~ 2mL、质量分数为1%的 HAuCl4加入到99mL超纯水中，油浴加热到120℃，搅拌30min，然后加入10 mL、质量分数为1%的柠檬酸钠，加热20 ~ 30 min后，制得金纳米粒子溶液；
取10mL 金纳米粒子溶液在8000 ~ 10000 rpm条件下，离心6 ~ 10 min，将所得沉淀物分散在10 mL含0.05 moL.L-1的十六烷基三甲基溴化铵和0.0126 moL.L-1的5-溴水杨酸的混合溶液中，离心，超纯水洗涤三次,再分散到10 mL超纯水中备用；将上述分散好的10 mL溶液和40 ~ 60 mL 1 m moL.L-1的H2PdCl4溶液依次加入到100 mL的圆底烧瓶中，超声1 ~3 min，加入10 ~ 15 mL、10 m moL.L-1的抗坏血酸溶液，倒置10 ~ 30 s，静置6 h，离心、超纯水洗涤三次，室温下干燥24h, 制得海胆状金钯纳米粒子；
将50mg海胆状金钯纳米粒子分散到50mL超纯水中，制得1 mg.mL-1的海胆状金钯纳米粒子溶液备用；
(3) 海胆状金钯@氨基化二硫化钼掺杂磺化碳纳米管检测抗体孵化物溶液的制备
将20 ~ 30 mg上述步骤（1）制备的氨基化二硫化钼掺杂磺化碳纳米管倒入20 ~ 40mL、1 mg.mL-1的海胆状金钯纳米粒子溶液中，超声1 h，过滤，室温下干燥20 ~ 24h，制得海胆状金钯@氨基化二硫化钼掺杂磺化碳纳米管；
将4~ 6 mg的海胆状金钯@氨基化二硫化钼掺杂磺化碳纳米管分散到1 ~ 2 mL超纯水中，加入100 μL、80 ~ 120 μg/mL的鳞状细胞癌标志物检测抗体溶液和900 μL、50 mmol/L的pH 7.4磷酸盐缓冲溶液，在4˚C恒温振荡培养箱中振荡孵化12 h；在4˚C下，6000 rpm转速下离心10 ~ 15 min，得到下层沉淀物，加入1 mL、50mmol/L 的pH=7.4磷酸盐缓冲溶液，制得海胆状金钯@氨基化二硫化钼掺杂磺化碳纳米管检测抗体孵化物溶液，4˚C下保存备用。
4.如权利要求1所述的制备方法制备一种鳞状细胞癌标志物夹心型免疫传感器，用于鳞状细胞癌标志物的检测，步骤如下：
（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的传感器为工作电极，在10 mL、50 mmol/L的pH 5.10 ~ 7.98磷酸盐缓冲溶液中进行测试；
（2）用时间-电流法对分析物进行检测，输入电压为-0.4 V，取样间隔 0.1 s，运行时间400 s；
（3）当背景电流趋于稳定后，每隔50 s向10 mL、50 mmol/L的pH = 7.4磷酸盐缓冲溶液中注入10 μL、5 mol/L的双氧水溶液，记录电流变化。
5.如权利要求1所述的一种鳞状细胞癌标志物夹心型免疫传感器的制备方法制备的传感器，其特征在于，所述鳞状细胞癌标志物为SCCA。
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