CN109387554A

CN109387554A - 一种赭曲霉素a的无酶免疫传感器的制备及其检测方法

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Publication number: CN109387554A
Application number: CN201710650260.7A
Authority: CN
Inventors: 张静; 张迎阳; 刘钢桥
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2017-08-02
Filing date: 2017-08-02
Publication date: 2019-02-26

Abstract

本发明涉及一种赭曲霉素A（OTA）的无酶免疫传感器的制备及其检测方法，属于免疫分析化学技术领域。本发明在玻碳电极表面层层组装石墨烯和聚乙二醇，构筑高密度OTA抗原传感界面，合成金纳米粒子并制备金纳米粒子探针，采用间接竞争免疫分析原理，包被OTA抗原和OTA目标抗原竞争OTA抗体形成免疫复合物，将金纳米粒子探针与免疫复合物进行反应，电极表面键合的金纳米粒子氧化生成AuCl₄ ^‑，通过电化学测定AuCl₄ ^‑还原峰峰电流值的大小达到检测OTA的目的。本发明有利于高灵敏在线检测OTA，样品不必提纯处理，简单快速，检测体系无需酶的使用，降低了检测成本。

Description

一种赭曲霉素A的无酶免疫传感器的制备及其检测方法

技术领域

本发明涉及一种赭曲霉素A的无酶免疫传感器的制备及其检测方法，属于免疫分析化学技术领域。

背景技术

赭曲霉毒素（Ochratoxins，OTs）是对人类健康威胁最大的霉菌毒素之一。赭曲霉毒素包含有赭曲霉毒素 A（OTA）、赭曲霉毒素 B（OTB）、赭曲霉毒素 C （OTC）等 7 种结构类似的化合物，其中以赭曲霉毒素 A（OTA）毒性最大，在农作物中分布最广泛，对人畜的影响最大。世界卫生组织(WHO)的国际癌症研究机构（IARC）于 1993 年将 OTA 列为可能引起人类癌症的物质即ⅡB 类致癌物。OTA 的毒性作用主要表现为肾脏毒性、肝脏毒性、遗传毒性、致畸性、致癌性、致突变作用、神经毒性和免疫毒性。世界卫生组织食品添加剂联合专家委员会（JECFA）和联合国粮食及农业组织于 1991 年拟定了 OTA 每人每周最大允许摄入量为 112 ng/kg（按体重计），最小有毒剂量为每日 8 μg/kg，在随后的会议当中，又将每周最大允许摄入量降低到 100 ng/kg。此外，许多相关国际组织和机构都制定了不同的限量标准，对OTA 的在粮食作物中的污染进行监测和控制，以保证食品安全。此外，许多相关国际组织和机构都制定了不同的限量标准，对 OTA 在食品和粮食作物中的污染进行监测和控制，以保证食品安全。因此，OTA的鉴定和定量检测在环境分析中具有重要的意义。

目前粮食作物中的OTA的检测技术大多采用基于实验室分析的高效液相色谱、液相色谱-质谱及气象色谱-质谱联机检测方法，样品前处理过程复杂、耗时长，需要专业技术人员操作，检测费用高。

本发明将具有优良性能的石墨烯和聚乙二醇用于OTA的电化学免疫传感器的制备，并针对OTA高灵敏定量检测的需求，引入金纳米粒子的信号放大功能，构建超灵敏的OTA的电化学免疫分析方法，实现了OTA的无酶检测，降低了成本。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的OTA检测方法的灵敏度低、检出限高和成本高的问题，提供一种OTA的无酶免疫传感器的制备及其检测方法，实现OTA的高灵敏、低成本而在线检测。

本发明的技术方案：一种OTA的无酶免疫传感器的制备及其检测方法，包括石墨烯修饰电极的制备，聚乙二醇的修饰，包被OTA抗原的修饰，金纳米粒子探针的制备，抗体和样品混合液的温育，抗体浓度的优化，金纳米粒子探针和免疫复合物的反应，电化学检测方法的构建，电化学检测条件的优化，标准曲线的绘制，实际样品的检测；

（1）石墨烯修饰电极的制备：

a、0.5 mg 石墨烯分散在 1 mL 乙醇中，超声10分钟，得到0.5 mg/mL 石墨烯分散液；

b、在直径为3 mm玻碳电极表面修饰5 mL 0.5 mg mL^-1石墨烯分散液，放入干燥器干燥处理。

（2）聚乙二醇的修饰：

在步骤（1）制备的石墨烯修饰电极表面滴涂5 μL 2 mg/mL 聚乙二醇分散液，用于固定OTA，清洗晾干，保存于4 ^oC备用。

（3）包被OTA抗原的修饰：

在步骤（2）制备的电极表面滴加10 μL 300 μg/L OTA抗原，在湿盒中温育1小时后，用0.01 M pH 7.4 （0.05% Tween-20）磷酸缓冲溶液（PBST）淋洗修饰电极，滴涂10 μL 5% 牛血清蛋白用于封闭电极上的未结合的活性位点，保存于4 ^oC备用。

（4）金纳米粒子探针的制备：

a、将50mL 0.01%氯金酸加热至沸，剧烈搅拌下向其中迅速加入1.75mL 1%柠檬酸三钠溶液，继续反应10 min，即可得到粒径13 nm 金纳米粒子溶液；

b、取步骤（4）a得到的金纳米粒子溶液用0.1 M K₂CO₃调至pH 9.0后，加入25 μL 1mg/mL羊抗鼠抗体，于室温搅拌2 h；

c、将上述混合液先过滤，再用0.01 M (pH 7.4) 磷酸缓冲溶液离心洗涤三次；随后沉淀物用含1% 牛血清蛋白的磷酸缓冲溶液分散，即得所需金纳米粒子标记羊抗鼠抗体（金纳米粒子探针），保存于4 ^oC备用。

（5）OTA抗体和样品混合液的温育：

5 mL 不同浓度的OTA标准溶液或样品混合制备温育液。将温育液滴到步骤（3）制备的修饰电极表面，将其置于25 ^oC 湿盒中温育1 h，小心地用0.01 M pH 7.4 PBST冲洗，保存于4 ^oC备用。

（6）OTA抗体浓度的优化：

对OTA抗体的浓度进行优化，采用稀释100倍数的OTA抗体为最佳抗体浓度。

（7）金纳米粒子探针和免疫复合物的反应：

将10 mL步骤（4）制备的金纳米粒子探针的分散液滴涂到根据步骤（5）制备的电极表面，将其置于25 ^oC 湿盒中温育1 h，小心地用0.01 M pH 7.4 PBST冲洗，保存于4 ^oC备用。

（8）电化学检测方法的构建：

电化学检测OTA体系采用经典三电极工作体系：工作电极、参比电极和对电极，工作电极为根据权利要求9制备的修饰电极，对电极为铂丝电极，参比电极为饱和甘汞电极，测定液为2 mL 0.1 M HCl溶液。

（9）电化学检测条件的优化：

对电化学检测时的氧化电位和氧化时间进行优化，1.40 V为最佳氧化电位，30 s为最佳氧化时间。

（10）标准曲线的绘制：

利用间接竞争免疫原理，将不同浓度的OTA标准液加入到稀释100倍的OTA抗体溶液中，温育液中OTA与电极表面固定OTA竞争结合OTA抗体形成免疫复合物。电极上形成的免疫复合物，捕获金纳米粒子探针，金纳米粒子在0.1 M HCl中氧化生成AuCl₄ ^-，随后，AuCl₄ ^-在电极表面还原，建立还原峰峰电流值-OTA浓度标准曲线。

（11）实际样品的检测：将步骤1-10制备的OTA免疫传感器和构建的电化学检测体系用于两个小麦样品中OTA浓度，根据测定到的还原峰峰电流值对应标准曲线得出样品中OTA的浓度。

本发明的有益成果：在玻碳电极表面层层组装石墨烯和聚乙二醇，构筑高密度OTA抗原免疫传感界面，合成金纳米粒子并构筑金纳米粒子探针，采用间接竞争免疫分析原理，包被OTA抗原和OTA目标抗原竞争OTA抗体免疫复合物，将金纳米粒子探针与免疫复合物进行反应，通过电化学测定金纳米粒子还原峰峰电流值的大小达到检测OTA的目的。该方法简单快速，成本低，灵敏度高，其检测限为8 ng/L，利于OTA的在线检测。

附图说明

图1为不同温育OTA浓度（0.02，0.05，0.1，0.5，1，5，8，10 mg/L）时OTA传感器脉冲伏安图（曲线从上到下）。

图2为金纳米粒子的还原峰峰电流值与OTA浓度的标准曲线图。

具体实施方式

现在结合附图和以下实施例对本发明作进一步详细的说明，但应了解的是，这些实施例仅为例示说明之用，而不应被解释为本发明实施的限制。

实验过程中使用的水均为去离子水，OTA与OTA抗体购于伊普瑞斯科技有限公司，羊抗鼠抗体和牛血清蛋白购于武汉博士德生物工程有限公司，石墨烯购于南京先丰纳米材料科技有限公司，所有其它试剂均为分析纯，实验均在25℃下进行。

实施例1: 石墨烯修饰电极的制备

实施例2:金纳米粒子及其标记羊抗鼠抗体的制备

制备直径13 nm 金纳米粒子溶液的具体方法为：50 mL 0.01%氯金酸加热至沸，剧烈搅拌下向其中迅速加入1.75 mL 1%柠檬酸三钠溶液，继续反应10 min，即可生成砖红色的金纳米粒子溶液。将其搅拌冷却至室温后，4℃保存于玻璃瓶中备用。

1 mL的上述金纳米粒子溶液用0.1 M K₂CO₃调至pH 9.0后，加入25 μL 1 mg/mL 羊抗鼠抗体，于室温搅拌2h。过滤后用0.01 M (pH 7.4) 磷酸缓冲溶液离心洗涤三次；随后沉淀物用300 μL含1% 牛血清蛋白的磷酸缓冲溶液分散。制得的金纳米粒子标记抗体可在4℃保存一周左右而无明显活性降低。

实施例3：OTA免疫传感器的制备和检测步骤

直径3 mm的玻碳电极分别经过0.3 μm，0.05 μm的Al₂O₃粉末上抛光后，依次在乙醇，去离子水中超声彻底洗涤，得到平滑光洁的电极表面。在晾干的电极上修饰5 μL 0.5 mg/mL石墨烯分散液，将修饰电极放入干燥器中干燥处理。在修饰电极表面滴加5 μL 2 mg/mL聚乙二醇-20000，修饰电极于4℃饱和水蒸气环境中放置过夜，通过物理吸附形成一层聚乙二醇薄膜。

在上述修饰电极表面滴加10 μL 300 μg/L OTA抗原，25℃湿盒中物理吸附1 h。用0.01 M pH 7.4 （0.05% Tween-20） PBS（PBST）淋洗修饰电极后，用含5% 牛血清蛋白的0.01 M pH 7.4 磷酸缓冲溶液封堵修饰电极1 h。用0.01 M pH 7.4 PBST淋洗该修饰电极，所得OTA免疫传感器保存于4 °C待用。

5 mL 不同浓度的OTA标准溶液或样品与5 mL 稀释100倍的OTA抗体混合制备温育液。如图1所示，将温育液滴到上述OTA免疫传感器表面，将其置于25 ^oC湿盒中温育1 h，小心地用0.01 M pH 7.4 PBST冲洗，保存于4 ^oC备用。将10 mL的金纳米粒子探针滴涂到传感器表面，将其置于25 ^oC 湿盒中温育1 h，小心地用0.01 M pH 7.4 PBST冲洗，保存于4 ^oC准备检测。电化学检测OTA体系采用经典三电极工作体系：工作电极、参比电极和对电极，工作电极为制备的修饰电极，对电极为铂丝电极，参比电极为饱和甘汞电极，测定液为2 mL 0.1M HCl溶液。电化学检测采用示差脉冲伏安法，扫描电位从0.6 V到0.1 V，脉冲振幅50 mV、脉冲宽度100 ms。

实施例4：电化学免疫传感器的工作曲线的绘制

将浓度为0.02, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 5 和 10 μg/L的OTA标准液加入到稀释100倍的OTA抗体溶液中。温育液中OTA与电极表面固定的OTA竞争结合OTA抗体形成免疫复合物。电极上形成的免疫复合物捕获金纳米粒子探针，金纳米粒子在0.1 M HCl中氧化生成AuCl₄ ^-，随后，AuCl₄ ^-在电极表面还原。还原峰峰电流值随着温育液OTA浓度的增加而减小（图1）。如图2所示，还原峰峰电流值的降低与温育溶液中待测OTA浓度对数在0.02 μg/L-10 μg/L范围内成正比，线性相关系数为0.997，该免疫传感器的检出限为8 ng/L。

实施例5：实际样品的检测

实际样品为两个发霉的小麦样品，将小麦样品粉碎至20目，取1 g样品放入样品管中，加入抽提液5 mL，震荡3分钟，1500 rpm离心5分钟，取上清液，取上清液0.5 mL备用。5 μL稀释了一定倍数的样品与5 μL 稀释了100倍的OTA抗体混合，混合液滴到OTA免疫传感器上，随后10 µL金纳米粒子探针溶液滴在免疫传感器表面。用该方法测得OTA的溶度为0.035 ±0.0006 μg/L和 0.068 ± 0.001 μg/L，用回收率实验来鉴定所提出方法的可靠性，所得回收率均分别为97.0 ± 1.8% 和 99.8 ± 2.1%，说明此方法准确度很好，该方法能用于小麦样品中OTA免疫分析。

Claims

1.一种赭曲霉素A（OTA）的无酶免疫传感器的制备方法，其特征在于包括石墨烯修饰电极的制备，聚乙二醇的修饰，包被OTA抗原的修饰；具体制备方法如下：

（1）石墨烯修饰电极的制备：

b、在直径为3 mm玻碳电极表面修饰5μL 0.5 mg mL^-1石墨烯分散液，放入干燥器干燥处理；

（2）聚乙二醇的修饰：

在石墨烯修饰电极表面滴涂5 μL 2 mg/mL 聚乙二醇，用于固定OTA，清洗晾干，保存于4 ^oC备用；

（3）包被OTA抗原的修饰：

在工作电极表面滴加10 μL 300 μg/L OTA抗原，湿盒温育1小时后，用0.01 M pH 7.4（0.05% Tween-20）磷酸缓冲溶液（PBST）淋洗修饰电极，滴涂10 μL 5% 牛血清蛋白，封闭电极上的非特异性活性位点，保存于4 ^oC备用。

2.利用权利要求1制得的OTA无酶免疫传感器检测OTA的方法，其特征在于包括金纳米粒子探针的制备，抗体和样品溶液的温育，抗体浓度的优化，金纳米粒子探针和免疫复合物的反应，电化学检测方法的构建，检测条件的优化，标准曲线的绘制，实际样品的检测。

3.根据权利要求2构建的OTA无酶免疫传感器检测OTA的方法，其特征在于金纳米粒子探针的制备：

a、将50 mL 0.01%氯金酸加热至沸，剧烈搅拌下向其中迅速加入1.75 mL 1%柠檬酸三钠溶液，继续反应10 min，即可得到粒径13 nm 金纳米粒子溶液；

b、取权利要求6步骤a得到的金纳米粒子溶液用0.1 M K₂CO₃调至pH 9.0后，加入25 μL1 mg/mL羊抗鼠抗体，于室温搅拌2 h；

c、将上述混合液用0.01 M (pH 7.4) 磷酸缓冲溶液离心洗涤三次；随后沉淀物用含1%牛血清蛋白的磷酸缓冲溶液分散，即得所需金纳米粒子标记羊抗鼠抗体（金纳米粒子探针），保存于4 ^oC备用。

4.根据权利要求2构建的OTA的无酶免疫传感器检测OTA的方法，其特征在于OTA抗体和样品的温育：

5μL不同浓度的OTA标准溶液或样品与5 μL 稀释一定倍数OTA抗体混合制备温育液；将温育液滴到OTA免疫传感器表面，将其置于25 ^oC 温育1 h，小心地用0.01 M pH 7.4 PBST冲洗，保存于4 ^oC备用。

5.根据权利要求2构建的OTA的无酶免疫传感器检测OTA的方法，其特征在于OTA抗体的优化：

6.根据权利要求2构建的OTA的无酶免疫传感器检测OTA的方法，其特征在于金纳米粒子探针和免疫复合物的反应：

将10μL的金纳米粒子探针滴涂到根据权利要求7 制备的修饰电极表面，将其置于25 ^oC湿盒中温育1 h，小心地用0.01 M pH 7.4 PBST冲洗，保存于4 ^oC备用。

7.根据权利要求2构建的OTA的无酶免疫传感器检测OTA的方法，其特征在于电化学检测方法的构建：

电化学检测OTA体系采用经典三电极工作体系：工作电极、参比电极和对电极，工作电极为根据权利要求9制备的修饰电极，对电极为铂丝电极，参比电极为饱和甘汞电极，测定液为2 mL 0.1 M HCl溶液；对电化学检测时的氧化电位和氧化时间进行优化，1.40 V为最佳氧化电位，30 s为最佳氧化时间。

8.根据权利要求2构建的OTA的无酶免疫传感器检测OTA的方法，其特征在于标准曲线的绘制：

利用间接竞争免疫原理，将不同浓度的OTA标准液加入到稀释100倍的OTA抗体溶液中；温育液中OTA与修饰电极表面固定的OTA竞争结合OTA抗体形成免疫复合物；电极上形成的免疫复合物捕获金纳米粒子探针，金纳米粒子在0.1 M HCl中氧化生成AuCl₄ ^-，随后，AuCl₄ ^-在电极表面还原，建立还原峰峰电流值-OTA浓度标准曲线。

9.根据权利要求2构建的OTA的无酶免疫传感器检测OTA的方法，其特征在于实际样品的检测：将权利要求1和权利要求2制备的免疫传感器和构建的电化学检测体系用于小麦样品中OTA浓度，根据测定到的还原峰峰电流值对应标准曲线得到样品中OTA的浓度。