CN108593920A

CN108593920A - 一种检测玉米赤霉烯酮的免疫传感器及其制备方法

Info

Publication number: CN108593920A
Application number: CN201810415517.5A
Authority: CN
Inventors: 韩铮; 聂冬霞; 赵志辉; 范凯; 蒋可秋; 黄晴雯
Original assignee: Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2018-05-03
Filing date: 2018-05-03
Publication date: 2018-09-28
Anticipated expiration: 2038-05-03
Also published as: CN108593920B

Abstract

本发明公开了一种用于检测玉米赤霉烯酮的免疫传感器，其由如下方法制备得到的：(1)玻碳电极的预处理：玻碳电极用氧化铝粉末抛光成镜面，然后依次在无水乙醇和丙酮中超声清洗、晾干；(2)玻碳电极的处理：向上述玻碳电极上滴涂二硫化钼和硫堇复合物的分散液，晾干；然后滴涂铂纳米粒子修饰的ZEN单克隆抗体溶液，晾干；在0.5％‑10％的牛血清白蛋白溶液中浸泡、封闭，得到所需的免疫传感器。本发明提供的免疫传感器灵敏、快速、适用范围广，能够适用于血液、尿液等生物样本中ZEN的快速检测，可推广至医院与体检机构，为与ZEN相关的疾病判断提供快速、可靠的依据。

Description

一种检测玉米赤霉烯酮的免疫传感器及其制备方法

技术领域

本发明涉及测试或分析材料安全技术领域，具体地说涉及一种检测玉米赤霉烯酮的免疫传感器及其制备方法。

背景技术

玉米赤霉烯酮(ZEN)是一种由多种镰刀菌种产生的具有雌激素活性的二羟基苯甲酸内酯类代谢产物，在玉米、小麦、高粱、大米等谷物中广泛存在。ZEN的结构与内源性雌激素相似，可以与雌激素受体进行特异性结合，从而诱发一系列的生殖毒性和致畸作用；也可引起体内脂质过氧化，对肝脏和肾脏造成损伤；此外，ZEN还具有一定的致癌性、免疫毒性、致畸性等毒性作用。ZEN性质稳定，在粮食的贮藏、加工以及烹调期间不易分解，所以极易残留在各种加工原料中，在食用这些原料加工后的产品，ZEN会随之迁移至人体。通过前期调查研究发现，260个正常人群的血液中3份含ZEN，18份尿液中含有ZEN，给人类的健康造成了巨大的潜在风险。

目前关于ZEN风险评价的方法主要有两种：一为测定谷物等食品中ZEN的含量结合消费者的膳食调查获得人体污染物暴露量，这种评价方法简便，但是由于ZEN来源多种多种，包括不同食品、空气、水、皮肤接触等，因此这种方法一般不够准确可靠；第二种为测定血液和尿液中ZEN的含量，通过人体代谢系数，计算污染物的暴露量。第二种方法准确可靠，但是由于血液和尿液中ZEN的含量非常低，一般为ng级，因此，检测技术的准确、灵敏、可靠成为此种风险评价方法的瓶颈。

现有的关于ZEN的检测方法主要有薄层色谱法、酶联免疫吸附法、高效液相色谱法和质谱法等。薄层色谱法成本低、操作简单，但目测半定量受主观影响较大；酶联免疫吸附法特异性强、样品预处理简便、分析时间短，但酶活性易受操作条件影响，且易出现假阳性；高效液相色谱法和质谱法具有良好的灵敏度、准确性和稳定性，适用于各种含有复杂成分的样本，是较普遍使用的检测手段，但是该法受到设备、人员和环境的制约，此种方法只在科研院所和检测机构中常见，不适合基层应用和推广，且需要经过复杂的前处理手段来保证结果的准确性，无法实现快速检测、现场即时分析。

因此，需要开发一种价格相对低廉、无须进行复杂前处理、不依赖昂贵大型设备且具有高灵敏度和准确性的快速检测手段，可以即时、有效地对血液和尿液等生物样本中的ZEN快速检测，以对ZEN造成的安全风险进行有效的监测和防控。

发明内容

本发明的目的首先在于提供一种检测玉米赤霉烯酮的免疫传感器，该免疫传感器的工作原理为：

利用经典的电化学三电极系统，以玻碳电极为工作电极，先以二硫化钼与硫堇复合物作为基底材料和信号物质，然后固定铂纳米粒子修饰的ZEN单克隆抗体，最后用1％牛血清白蛋白溶液封闭，将样品提取液加到工作液中即可实现快速检测。

本发明的一种检测玉米赤霉烯酮的免疫传感器，是由如下方法制备得到的：

(1)玻碳电极的预处理：玻碳电极用氧化铝粉末抛光成镜面，然后依次在无水乙醇和丙酮中超声清洗、晾干；

(2)玻碳电极的处理：

向上述玻碳电极上滴涂二硫化钼和硫堇复合物的分散液，晾干；

然后滴涂铂纳米粒子修饰的ZEN单克隆抗体溶液，晾干；

在0.5％-10％牛血清白蛋白溶液中浸泡、封闭，得到所需的免疫传感器；

其中所述的二硫化钼和硫堇复合物的分散液是通过如下方法制备得到的：

向N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中加入硫堇和二硫化钼粉末，两者质量比为0.5:1～4:1,室温下超声1～8小时；经1000～3000rpm离心后，收集上层液体，在5000～9000rpm下离心，收集到的固体用DMF洗至无色，氮气吹干；复合物在DMF中重新分散，使其浓度为0.1～10mg/mL；

其中所述的铂纳米粒子修饰的ZEN单克隆抗体溶液为：

用0.01～0.1mol/L的磷酸盐缓冲液(pH 7.4)稀释ZEN单克隆抗体至1～50μg/mL，将氯铂酸(10～50mmol/L)加入到稀释后的抗体中，然后加入氢氧化钠溶液(0.1～2mol/L)调节pH至7～9；在密封避光条件下搅拌10～15小时，随后超滤富集，重新用0.01～0.1mol/L的磷酸盐缓冲液(pH 7.4)定容至所需浓度；

本发明还提供了上述方法制备的用于检测玉米赤霉烯酮的免疫传感器。

本发明还提供了上述免疫传感器的应用，其可用于检测玉米赤霉烯酮，尤其是用于血液和尿液中检测玉米赤霉烯酮，具体的检测方法包括如下步骤：

(1)生物样本前处理：取血液或尿液样本，加入3～10倍体积的甲酸/乙腈(0.5/99.5～5/95，v/v)溶液，涡旋2min，在4℃条件下10000～15000rpm离心，取上层清液备用做检测；

(2)采用CHI660A电化学工作站和三电极检测装置检测：

饱和甘汞电极作为参比电极，铂丝电极作为对电极，上述免疫传感器(处理后的玻碳电极)作为工作电极；

工作液为0.01～0.1mol/L的磷酸盐缓冲液(pH 5.5～7.5)；

运用方波伏安法扫描(电压：-0.4V～0V，扫描速率：20～200mV/s)，在工作液中的初始峰值电流为I₀，随后将待检溶液加入到工作液中，二者体积比为1：1000～1：25，搅拌20s，静置20min，测得峰值电流为I，两个峰值电流的差值(ΔI＝I₀-I)与ZEN浓度的对数(lgC_ZEN)在一定范围内呈线性相关，根据测得的ΔI即可计算出工作液中ZEN的浓度。

本发明的有益效果主要体现在：

(1)首次建立了一种基于二硫化钼与硫堇复合物的用于快速检测血液和尿液中ZEN的免疫传感器及检测方法；

(2)首次采用少层二硫化钼和硫堇复合物快速检测真菌毒素，少层二硫化钼和硫堇复合物具有双重作用，既作为基底材料，有利于后续抗体的固定，又是信号物质，减少检测中多余试剂的引入；

(3)首次在抗体上修饰金属纳米粒子，以简单的步骤放大电化学信号；

(4)采用经典三电极系统，使用的均是常规电极和材料，材料合成方法简便，一般实验人员经过简单培训即可使用，实用性强；

(5)本发明的检测方法，无须依赖昂贵的大型仪器，生物样本无须经过复杂前处理，检测过程仅需20min，可推广到一般单位与科研机构；

(6)一次合成的二硫化钼与硫堇复合物可以制造500个以上的免疫传感器，一次合成的铂纳米粒子修饰的单克隆抗体可以制备50个以上的免疫传感器，在合成了所需材料的前提下，制造一个免疫传感器仅需85min；

(7)本发明的免疫传感器灵敏、快速、适用范围广，能够适用于血液、尿液等生物样本中ZEN的快速检测，可推广至医院与体检机构，为与ZEN相关的疾病判断提供快速、可靠的依据。

附图说明

图1为实施例1中免疫传感器的工作电极结构图。

图2为实施例1中免疫传感器构建过程的电化学阻抗谱表征图。

曲线代表的含义是：(a)玻碳电极；(b)负载了二硫化钼与硫堇复合物的玻碳电极；(c)负载了铂纳米粒子修饰的单克隆抗体和二硫化钼与硫堇复合物的玻碳电极；(d)负载了铂纳米粒子修饰的单克隆抗体和二硫化钼与硫堇复合物且经过了牛血清白蛋白封闭后的电极；(e)最终吸附上了ZEN的电极

图3为实施例1中免疫传感器的工作曲线。

三条曲线分别表示在空白工作液、含1ng/mL ZEN的工作液和含5ng/mL ZEN的工作液中的方波伏安法扫描图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

材料来源：

二硫化钼购自阿法埃莎(中国)化学有限公司，纯度99％，粒径2μm；

硫堇购自赛默飞世尔科技公司(比利时)；

ZEN单克隆抗体购自艾博抗(上海)贸易有限公司，浓度为0.5mg/mL的鼠单克隆抗体；

氯铂酸购自上海阿达玛斯有限公司，重量百分比含量为37％的分析纯六水合氯铂酸；

玻碳电极购自上海辰华仪器有限公司，直径3mm；

氧化铝粉末购自上海辰华仪器有限公司，粒径1μm、0.3μm和0.05μm；

100kDa超滤管购自默克公司(德国)；

牛血清白蛋白购自碧云天公司(中国)；

ZEN、黄曲霉毒素B1(AFB1)、黄曲霉毒素B2(AFB2)、T-2毒素(T-2)、赭曲霉毒素A(OTA)和脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)标准品购自Romer国际贸易(北京)有限公司；

CHI660A电化学工作站(上海辰华仪器有限公司)；

血液和尿液样本：由南京军区南京总医院提供。

实施例1

(一)制备免疫传感器

第一步，合成二硫化钼和硫堇复合物的分散液：

向1mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中加入15mg硫堇和10mg二硫化钼粉末，室温下超声4小时。经2000rpm离心20min后，收集上层液体，在6000rpm下离心20min，收集到的固体用DMF小心洗至基本无色，50℃下氮气吹干，在DMF中重新分散，浓度为2mg/mL；

第二步，合成铂纳米粒子修饰的ZEN单克隆抗体：

用0.01mol/L的磷酸盐缓冲液(pH 7.4)将ZEN单克隆抗体稀释至10μg/mL；在搅拌条件下将16μL氯铂酸(20mmol/L)缓慢加入到360μL稀释后的抗体中，30s内加入8μL氢氧化钠溶液(0.5mol/L)。

在密封避光条件下搅拌13小时，随后利用100kDa超滤管超滤富集，在14000rpm离心15min，翻转超滤管内管，1000rpm离心2min收集抗体富集液，重新用0.01mol/L的磷酸盐缓冲液(pH 7.4)定容至400μL；

第三步，玻碳电极的预处理：

玻碳电极依次用1μm、0.3μm和0.05μm的氧化铝粉末抛光成镜面，蒸馏水冲洗，然后依次在无水乙醇和丙酮中超声清洗5min，晾干准备修饰；

第四步，免疫传感器的制备：

向上述玻碳电极上滴涂3.5μL二硫化钼和硫堇复合物分散液，晾干；随后滴涂7μL铂纳米粒子修饰的ZEN单克隆抗体溶液，晾干；最后在4℃条件下，在1％牛血清白蛋白溶液中浸泡40min，封闭非活性位点，得到免疫传感器，于4℃保存备用；

图1为免疫传感器的表面结构示意图，主要由四部分组成：

1-玻碳电极(直径为3mm)、2-二硫化钼与硫堇复合物、4-铂纳米粒子修饰的ZEN单克隆抗体和3-封闭物牛血清白蛋白。

免疫传感器构造步骤的电化学表征：如图2的电化学阻抗谱所示，每负载上一层物质后，电极表面的导电性降低，阻抗增加。由于二硫化钼与硫堇复合物的导电性不强，而抗体和牛血清白蛋白均为蛋白质，会阻碍电子传递，而目标物ZEN与抗体进行特异性免疫反应成功结合后，进一步阻碍电子传递，因此，阻抗的变化可以表明免疫传感器构造中的每一步均成功，二硫化钼与硫堇复合物、铂纳米粒子修饰的单克隆抗体与牛血清白蛋白均固定到了电极表面。

(二)利用上述免疫传感器快速检测血液和尿液中的ZEN

(1)血液和尿液样本前处理：分别取200μL血液或尿液样本，加入1mL含1％甲酸的乙腈，涡旋2min，在4℃条件下12000rpm离心10min，除去蛋白，取上层清液作为检测(如果浓度较低的样品，可将上层清液吹干，用少量工作液复溶后再做检测)；

(2)采用CHI660A电化学工作站和三电极检测装置进行检测：

饱和甘汞电极作为参比电极，铂丝电极作为对电极，上述步骤中制备得到的免疫传感器作为工作电极：

工作液为0.1mol/L的磷酸盐缓冲液(pH 6.5)；

运用方波伏安法扫描(电压：-0.4V～0V，扫描速率：100mV/s)，在工作液中的初始峰值电流为I₀，随后将样品溶液加入到工作液中，搅拌20s，静置20min，测得峰值电流为I，检测结果基于两个峰值电流的差值(ΔI＝I₀–I)；

结果：

(1)免疫传感器在空白工作液、含1ng/mL ZEN的工作液和含5ng/mL ZEN的工作液中的工作曲线如图3所示，空白工作液中I₀＝7.452μA，含1ng/mL ZEN的工作液中I₁＝6.348μA，ΔI₁＝1.104μA，含5ng/mL ZEN的工作液中I₂＝5.821μA，ΔI₂＝1.631μA。

使用铂纳米粒子修饰的单克隆抗体时，各浓度间信号差异更大，且整体信号被放大，证明铂纳米粒子修饰单克隆抗体可以显著提高方法的灵敏度；

(2)免疫传感器的特异性验证：一些毒素经常与ZEN同时存在(例如黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、单端孢霉烯族类毒素等)，为考察免疫传感器对ZEN的特异性，分别检测只含有ZEN、黄曲霉毒素B1(AFB1)、黄曲霉毒素B2(AFB2)、T-2毒素(T-2)、赭曲霉毒素A(OTA)和脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)的工作液(毒素浓度均为5ng/mL)，ΔI依次为1.631，0.085，0.075，0.088，0.090，0.082μA，可见该免疫传感器对其他毒素响应很低；随后考察竞争性吸附过程，分别检测含有ZEN、ZEN+AFB1、ZEN+AFB2、ZEN+T-2、ZEN+OTA、ZEN+DON和ZEN+AFB1+AFB2+T-2+OTA+DON的工作液(每种毒素的浓度均为5ng/mL)，ΔI依次为1.631，1.712，1.708，1.720，1.712，1.718和1.754μA，可见在工作液中有ZEN与上述一种或多种毒素同时存在，与只有同等浓度ZEN存在的情况下，观察到的ΔI差异很小，在竞争性吸附中该免疫传感器展现出了良好的特异性；

(3)免疫传感器的稳定性验证：根据上述检测方法，同一免疫传感器在工作液中连续扫描20次，仅有少于1％的信号降低；

(4)免疫传感器的重现性验证：用同样的方法制造5根免疫传感器，检测1ng/mL的ZEN，结果的相对标准偏差(RSD)为2.48％；

(5)检测方法的线性与灵敏度验证：在0.01-50ng/mL范围内，本方法具有良好的线性关系，ΔI与工作液中ZEN浓度的对数(lgC_ZEN)呈线性相关，相关系数(R²)为0.9909；检出限为0.005ng/mL；

(6)检测方法的回收率验证：采用基质加标法对方法的回收率进行考察，取空白血液和尿液样本，分别添加低、中、高三个浓度水平(0.05ng/mL，0.2ng/mL和20ng/mL)的ZEN标准品，回收率结果为91.5-95.8％。

综上可见，本发明的免疫传感器及检测方法，可以有效地放大信号，获得较高灵敏度，对血液与尿液等仅含有微量毒素的生物样本中的ZEN进行测定，并且特异性高，选择性好，回收率高，重现性好。一次合成的二硫化钼与硫堇复合物可以制造500个以上的免疫传感器，一次合成的铂纳米粒子修饰的单克隆抗体可以制备50个以上的免疫传感器，在准备好材料的前提下，制造一个免疫传感器仅需85min，样品检测过程仅需20min，与现有检测方法相比，无需依赖昂贵的大型仪器，前处理简单，且在保证结果准确性的同时，实现了快速检测，极大的节省了成本，提高了检测效率。

本发明的保护范围并不限于实施例中所作的描述，不偏离本发明方案中心的修改都属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种制备用于检测玉米赤霉烯酮的免疫传感器的方法，其特征在于包括如下步骤：

(2)玻碳电极的处理：

然后滴涂铂纳米粒子修饰的ZEN单克隆抗体溶液，晾干；

在0.5％-10％牛血清白蛋白溶液中浸泡、封闭，得到所需的免疫传感器。

2.根据权利要求1所述的二硫化钼和硫堇复合物的分散液是通过如下方法制备得到的：

其中所述的铂纳米粒子修饰的ZEN单克隆抗体溶液为：

用0.01～0.1mol/L的磷酸盐缓冲液(pH 7.4)稀释ZEN单克隆抗体至1～50μg/mL，将氯铂酸(10～50mmol/L)加入到稀释后的抗体中，然后加入氢氧化钠溶液(0.1～2mol/L)调节pH至7～9；在密封避光条件下搅拌10～15小时，随后超滤富集，重新用0.01～0.1mol/L的磷酸盐缓冲液(pH 7.4)定容至所需浓度。

3.权利要求1或2所述方法制备得到的用于检测玉米赤霉烯酮的免疫传感器。

4.权利要求3所述免疫传感器的应用，其用于检测血液或尿液中的玉米赤霉烯酮。

5.根据权利要求4所述的免疫传感器的应用，其特征在于其具体的检测方法包括如下步骤：

(2)采用CHI660A电化学工作站和三电极检测装置检测：

工作液为0.01～0.1mol/L的磷酸盐缓冲液(pH 5.5～7.5)；

运用方波伏安法扫描(电压：-0.4V～0V，扫描速率：20～200mV/s)，在工作液中的初始峰值电流为I₀，随后将待检溶液加入到工作液中，二者体积比为1：1000～1：25，搅拌20s，静置20min，测得峰值电流为I，检测结果基于两个峰值电流的差值。