CN110806439B - 一种同时检测玉米赤霉烯酮和伏马毒素b1的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种同时检测玉米赤霉烯酮(ZEN)和伏马毒素B1(FB1)的方法,还公开了一种用于同时检测玉米赤霉烯酮和伏马毒素B1的适配体传感器,该适配体传感器是由如下方法制备:(1)向玻碳电极覆盖还原性二硫化钼和金纳米粒子复合物(rMoS2‑Au)纳米材料,晾干;(2)随后在电极上滴涂玉米赤霉烯酮核酸适配体(AP1)和伏马毒素B1核酸适配体(AP2)的混合溶液,1~10μmol/L,v/v,1/1,进行孵育1~10h,用1mg/mL BSA封闭;(3)最后,滴涂自主研制的5'端修饰金纳米粒子和硫堇的ZEN核酸适配体部分互补序列(CP1‑Au‑Thi)溶液与5'端修饰金纳米粒子和二茂铁基己硫醇的FB1核酸适配体部分互补序列(CP2‑Au‑FC6S)溶液的混合溶液,1~10μmol/L,v/v,1/1,进行孵育1~10h,即得到所需的适配体传感器。本发明提供的方法,适用于玉米及饲料等农产品中ZEN和FB1的快速同时检测,有效防止超标ZEN和FB1农产品流入市场,保障人民群众的饮食安全。
Description
技术领域
本发明涉及农作物测试与分析领域,具体地说涉及一种用于同时检测玉米赤霉烯酮(ZEN)和伏马毒素B1(FB1)的方法。
背景技术
玉米赤霉烯酮(ZEN)是一种由多种镰刀菌种产生的具有雌激素活性的二羟基苯甲酸内酯类代谢产物,在玉米、小麦、高粱、大米等谷物中广泛存在。ZEN的结构与内源性雌激素相似,可以与雌激素受体进行特异性结合,从而诱发一系列的生殖毒性和致畸作用;也可引起体内脂质过氧化,对肝脏和肾脏造成损伤;此外,ZEN还具有一定的致癌性、免疫毒性、致畸性等毒性作用。
伏马菌素主要是由串珠镰刀菌、轮枝镰刀菌和多育镰刀菌等在一定温度和湿度条件下产生的一类次级代谢产物。伏马毒素B1(FB1)纯品为白色针状结晶,易溶于水、甲醇和乙腈及其混合物。FB1对一般的加热处理很稳定,100℃蒸煮30min也不能破坏其结构,在多数食品加工过程中均比较稳定,成为伏马毒素的研究重点。FB1会导致一系列的严重疾病,如人类食管癌和神经管型缺陷病。此外,高剂量和长时间的FB1作用能够引起细胞调亡类型的DNA损伤,也可能存在潜在的遗传毒性。
世界范围内,在玉米、小麦、花生及饲料等农副产品中ZEN和FB1的污染情况严重。作物中ZEN和FB1含量受许多环境因素的影响,如收获前和收获期间的温度、湿度、干旱情况等。ZEN和FB1性质稳定,在粮食的贮藏、加工以及烹调期间不易分解,极易残留在各种加工原料中,食用了由这些原料加工的产品后,ZEN和FB1会随之迁移至人体,给人类的健康造成极大危害。因此,建立准确、快速的检测手段是保证食品安全和人类健康的必要条件。
现有的关于ZEN和FB1的检测方法主要有薄层色谱法、酶联免疫吸附法、高效液相色谱法和质谱法等。薄层色谱法成本低、操作简单,但目测半定量受主观影响较大;酶联免疫吸附法特异性强、样品预处理简便、分析时间短,但酶活性易受操作条件影响,且易出现假阳性;高效液相色谱法和质谱法具有良好的灵敏度、准确性和稳定性,适用于各种含有复杂成分的样本,是较普遍使用的检测手段,但是该法受到设备、人员和环境的制约,此种方法只在科研院所和检测机构中常见,不适合基层应用和推广,且需要经过复杂的前处理手段来保证结果的准确性,无法实现快速检测、现场即时分析。
因此,需要开发一种价格相对低廉、无须进行复杂前处理、不依赖昂贵大型设备且具有高灵敏度和准确性的快速检测手段,可以即时、有效地同时对玉米等农作物中的ZEN和FB1快速检测,以对ZEN和FB1造成的安全风险进行有效的监测和防控。
发明内容
本发明的目的首先在于提供一种同时检测玉米赤霉烯酮(ZEN)和伏马毒素B1(FB1)的适配体传感器的制备方法,该方法包括如下步骤:
(1)向玻碳电极覆盖还原性二硫化钼和金纳米粒子复合物(rMoS2-Au)纳米材料,晾干;
(2)随后在电极上滴涂玉米赤霉烯酮核酸适配体(AP1)和伏马毒素B1核酸适配体(AP2)混合溶液(1~10μmol/L,v/v,1/1)进行孵育1~10h,用1mg/mL BSA封闭;
(3)最后,滴涂5'端修饰金纳米粒子和硫堇的ZEN核酸适配体部分互补链(CP1-Au-Thi)溶液与5'端修饰金纳米粒子和二茂铁基己硫醇的FB1核酸适配体部分互补链序列(CP2-Au-FC6S)溶液的混合溶液(1~10μmol/L,v/v,1/1)进行孵育1~10h,即得到所需的适配体传感器;
其中,rMoS2-Au纳米材料是通过以下方法制备得到的:
向N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中加入单层二硫化钼(MoS2)和三水合氯金酸(HAuCl4·3H2O),使得两者浓度分别为0.1~1mg/mL、0.1%~2%,室温下超声处理10~60min后,得到MoS2和HAuCl4·3H2O复合物的分散液;将该分散液(1~10μL)滴到玻碳电极上,晾干,然后在NaCl溶液(0.1~1mol/L)中电化学还原,即得;
其中所述CP1-Au-Thi溶液是通过如下方法制备得到的:
用TE缓冲液(pH 4.0~8.0)将CP1(ZEN核酸适配体部分互补链)稀释到1~10μmol/L,取0.5~5mL CP1溶液与1~10mL金纳米粒子分散液轻微振荡1~20h,室温静置后离心5~60min(3000~10000rpm)后去除上层清液,将沉淀物重新分散于0.1~5mL TE溶液中;加入1~10mL Thi溶液(1~20mmol/L),轻微振荡1~20h,室温静置后离心5~60min(3000~10000rpm),去除上层清液,将沉淀物重新分散于0.1~5mL TE缓冲溶液中,即制得CP1-Au-Thi溶液;
其中所述CP2-Au-FC6S溶液是通过如下方法制备得到的:
用TE缓冲液(pH 4.0~8.0)将CP2(FB1核酸适配体部分互补链)稀释到1~10μmol/L,取0.5~5mL CP2溶液与1~10mL金纳米粒子分散液轻微振荡1~20h,室温静置后离心5~60min(3000~10000rpm),去除上层清液,将沉淀物重新分散于0.1~5mL TE溶液中;加入1~10mL FC6S溶液(1~20mmol/L),轻微振荡1~20h,室温静置后离心5~60min(3000~10000rpm),去除上层清液,将沉淀物重新分散于0.1~5mL TE缓冲溶液中,即制得CP2-Au-FC6S溶液;
其中所述用来制备CP1-Au-Thi和CP2-Au-FC6S的金纳米粒子分散液是通过如下方法制备得到的:
将0.1~10mLHAuCl4·3H2O(1~50mmol/L)与10~50mL超纯水在搅拌状态下加热至沸腾后,迅速加入0.1~10mL柠檬酸钠溶液(0~1mol/L),几分钟后溶液呈酒红色后即停止加热,自然冷却至室温,即制得所需金纳米粒子分散液。
其中在玻碳电极进行处理前,最好对玻碳电极进行预处理,预处理的具体步骤为:玻碳电极用氧化铝粉末抛光成镜面,然后依次在无水乙醇和丙酮中超声清洗、晾干。
本发明还提供了用上述方法制备的一种同时检测ZEN和FB1的适配体传感器。
本发明的一种同时检测玉米赤霉烯酮和伏马毒素B1的适配体传感器,其是通过在玻碳电极上进行如下处理得到:
向玻碳电极覆盖rMoS2-Au纳米材料,晾干;
随后在电极上滴涂1~10μmol/L AP1和AP2混合溶液(v/v,1/1)进行孵育1~10h,用1mg/mL BSA封闭;
最后,滴涂1~10μmol/L CP1-Au-Thi和CP2-Au-FC6S混合溶液(v/v,1/1)进行孵育1~10h,即得到所需的适配体传感器。
本发明还提供了上述适配体传感器的应用,其可用于同时检测ZEN和FB1,尤其是用于玉米中的ZEN和FB1检测;
本发明还提供了一种同时检测ZEN和FB1的方法,其具体的检测方法包括如下步骤:
(1)样本前处理:取玉米粉末样本,加入3~10倍体积的乙腈/水/甲酸(60/39.5/0.5~90/5/5,v/v/v)溶液,涡旋2min,在4℃条件下离心5~20min(1000~5000rpm),取上层清液,加入相同体积的乙腈/水/甲酸(49/50/1~9.5/90/0.5,v/v/v);涡旋混匀,过0.22μm滤膜;最后吸取10~200μL于1~10mL PBS(pH 4.0~8.0)中用于检测ZEN和FB1;
(2)采用电化学工作站和三电极体系检测装置检测:饱和甘汞电极作为参比电极,铂丝电极作为对电极,本发明的上述适配体传感器(处理后的玻碳电极)作为工作电极;
工作液为0.01~0.1mol/L的磷酸盐缓冲液(pH 4.0~8.0);
运用示差脉冲法扫描(电压:-1.0V~1.0V,扫描速率:20~200mV/s),在工作液中ZEN的初始峰值电流为I1,FB1的初始峰值电流为I2,随后将待检样本溶液加入到工作液中,待检溶液与工作液的体积比为1:1000~1:25,静置5min,测得ZEN的峰值电流为I3,FB1的峰值电流为I4,检测结果基于两个峰值电流的差值(ΔIZEN=I3-I1,ΔIFB1=I4-I2),ΔIZEN和ΔIFB1分别与ZEN浓度的对数(logCZEN)、FB1浓度的对数(logCFB1)在一定范围内呈线性相关,根据测得的ΔIZEN和ΔIFB1即可计算出工作液中ZEN和FB1的浓度,随后根据加入的待检样本溶液体积换算出待检溶液中ZEN和FB1的浓度。
本发明提供的一种同时检测ZEN和FB1的适配体传感器的工作原理为:
利用经典的电化学三电极系统,以玻碳电极为工作电极,rMoS2-Au作为基底材料,然后将AP1和AP2通过金硫键固定在电极上,用1mg/mL BSA封闭,然后孵育CP1-Au-Thi和CP2-Au-FC6S混合溶液,最后将样品提取液加到工作液中即可实现快速同时检测。
本发明的有益效果主要体现在:
(1)首次建立了一种以rMoS2-Au为基底材料,以AP1和AP2为电化学分子识别元件,以Thi和FC6S电化学信号指示剂,快速同时检测玉米中ZEN和FB1的适配体传感器及检测方法;
(2)首次将rMoS2-Au用在真菌毒素检测上,rMoS2-Au作为基底材料,不仅可以放大信号,促进电子的传递速率,而且有利于后续核酸适配体的固定;
(3)采用经典三电极系统,使用的均是常规电极和材料,材料合成方法简便,一般实验人员经过简单培训即可使用,实用性强;
(4)本发明的检测方法,无须依赖昂贵的大型仪器,样本无须经过复杂前处理,检测过程仅需20min,可推广到一般单位与科研机构;
(5)本发明的免疫传感器灵敏、快速、适用范围广,能够适用于玉米等农副产品中ZEN和FB1的快速同时检测,可推广至农副产品检测中心等检测机构,降低ZEN和FB1中毒风险。
附图说明
图1为实施例1中适配体传感器的工作电极结构示意图。
图2为实施例1中适配体传感器构建过程的循环伏安表征图。
曲线代表的含义是:
(a)玻碳电极;
(b)负载了rMoS2-Au的玻碳电极;
(c)负载了AP1、AP2和BSA的玻碳电极;
(d)负载了AP1、CP1、AP2、CP2和BSA的玻碳电极;
(e)最后置于含ZEN和FB1的标准溶液中的玻碳电极;
图3为实施例1中适配体传感器的工作曲线。
三条曲线分别表示在工作液(0ng/mL)、含0.1ng/mL ZEN和FB1的工作液和含10ng/mL ZEN和FB1的工作液中的示差脉冲法扫描图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步描述,但本发明的保护范围并不仅限于此:
材料来源:
MoS2购自南京先丰纳米材料科技有限公司,单层率大于90%,片径:0.2~5μm,厚度:~1nm;
Thi(硫堇)购自赛默飞世尔科技公司(比利时);
FC6S(二茂铁基己硫醇)购自上海泰坦科技股份有限公司;
HAuCl4·3H2O购自上海泰坦科技股份有限公司,纯度大于99.9%;
氧化铝粉末购自上海辰华仪器有限公司,粒径1μm、0.3μm和0.05μm;
DMF、NaCl、H2SO4、BSA购自碧云天公司(中国);
ZEN、FB1、α-玉米赤霉酮(α-ZOL)、伏马毒素B2(AFB2)、黄曲霉毒素B1(AFB1)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)、T-2毒素(T-2)和赭曲霉毒素A(OTA)标准品购自Romer国际贸易(北京)有限公司;
ZEN和FB1核酸适配体(AP)及核酸适配体部分互补链序列(CP),1×TE缓冲液均购自生工生物工程(上海)股份有限公司,浓度均为100μmol/L;
ZEN核酸适配体(AP1)序列:
5′-SH-TCATCTATCTATGGTACATTACTATCTGTAATGTGATATG-3′
ZEN核酸适配体部分互补链(CP1)序列:5′-SH-GTAATGTACCAT-3′
FB1核酸适配体(AP2)序列:
5′-SH-ATACCAGCTTATTCAATTAATCGCATTACCTTATACCAGCTTATT
CAATTACGTCTGCACATACCAGCTTATTCAATTAGATAGTAAGTGCAATCT-3′
FB1核酸适配体部分互补链(CP2)序列:5′-SH-AATTGAATAAGCTGG-3′
CHI660A电化学工作站:上海辰华仪器有限公司;
三电极体系(上海辰华仪器有限公司):以玻碳电极(直径3mm)作为工作电极,饱和甘汞电极作为参比电极,铂丝电极作为对电极;
玉米样本:购自上海超市,普通市售。
实施例1制备适配体传感器
第一步,金纳米粒子分散液的制备:
将1mL 10mmol/L HAuCl4·3H2O与37mL超纯水在搅拌状态下加热至沸腾后,迅速加入1mL 0.1mol/L柠檬酸钠溶液,溶液呈酒红色后即停止加热,自然冷却至室温,即制得所需金纳米粒子分散液。
第二步,CP1-Au-Thi的制备:
用TE缓冲液(pH 8.0)将AP1稀释至2μmol/L,取1mL AP1溶液与4mL金纳米粒子分散液轻微振荡过夜8h,室温静置后离心10min(5000rpm)后去除上层清液,将沉淀物重新分散于1mL TE溶液中。加入1mL 10mmol/L Thi溶液,轻微振荡过夜8h,室温静置,离心10min(5000rpm)后去除上层清液,将沉淀物重新分散于1mL TE溶液中,即制得CP1-Au-Thi溶液。
第三步,CP2-Au-FC6S的制备:
用TE缓冲液(pH 8.0)将CP2稀释至2μmol/L,取1mL CP2溶液与4mL金纳米粒子分散液轻微振荡过夜8h,室温静置后,离心10min(5000rpm),去除上层清液,将沉淀物重新分散于1mL TE溶液中。加入1mL 10mmol/L FC6S溶液,轻微振荡过夜8h,室温静置后离心10min(5000rpm),去除上层清液,将沉淀物重新分散于1mL TE溶液中,即制得CP2-Au-FC6S溶液。
第四步,玻碳电极的预处理:
玻碳电极依次用1μm、0.3μm和0.05μm的氧化铝粉末抛光成镜面,蒸馏水冲洗,然后依次在无水乙醇和丙酮中超声清洗5min,室温置干;将洁净的玻碳电极在0.05mol/L H2SO4溶液中利用循环伏安法进行活化(电压:0V~2V,扫描速率:50mV/s,扫描圈数:5圈),超纯水冲洗后室温置干。
第五步,玻碳电极的处理:
向DMF中加入单层MoS2和HAuCl4·3H2O,最终得到1%HAuCl4·3H2O和0.3mg/mL单层MoS2溶液,超声处理30min后,得到单层MoS2和HAuCl4·3H2O复合物的分散液。
将MoS2和HAuCl4·3H2O复合物的分散液(7μL)滴涂在上述电极上,室温置干后在0.5mol/LNaCl中进行循环伏安法电化学还原(电压:1.1V~-1.1V,扫描速率:50mV/s,扫描圈数:6圈),还原后用超纯水轻轻冲洗该电极,室温置干后得到以rMoS2-Au复合纳米材料为基底材料的电极。
第六步,适配体传感器的制备:
将所购买的100μmol/L的AP1和AP2溶液分别用TE缓冲液稀释到4μmol/L。然后配置AP1和AP2混合溶液(2μmol/L,1/1,v/v),最后向上述玻碳电极上滴涂该AP1和AP2混合溶液10μL,37℃孵育2h;随后滴涂5μL1mg/mL BSA封闭20min;
最后,滴涂10μL CP1-Au-Thi和CP2-Au-FC6S混合溶液(2μmol/L,1/1,v/v),37℃孵育2h,于4℃保存备用;
图1为本实施例中适配体传感器的工作电极结构示意图。
适配体传感器构造步骤的电化学表征,如图2的电化学循环伏安表征图所示。只有玻碳电极时的循环伏安图如曲线a所示;当通过电还原将rMoS2-Au复合纳米材料覆盖在玻碳电极上时,由于rMoS2-Au的导电性强,故能促进电子传递(曲线b)。由于AP1、AP2和BSA都不导电,因此阻碍了电子的传递(曲线c)。当孵育上CP1-Au-Thi和CP2-Au-FC6S混合溶液时,导电性增加,这是因为Au、Thi以及FC6S能促进电子的传递(曲线d)。将上述电极浸入含有ZEN和FB1的溶液中时,由于形成AP1-ZEN and AP2-FB1复合物,使电流减小(曲线e)。因此,电化学循环伏安表征图可以表明适配体传感器构造中的每一步均成功,rMoS2-Au、AP1、AP2和BSA、CP1-Au-Thi和CP2-Au-FC6S均固定到了电极表面。
实施例2利用实施例1的适配体传感器同时检测玉米中的ZEN和FB1
(1)玉米样本前处理:将购买的两份市售玉米样本(编号1和2)磨粉,分别称取2g加入8mL乙腈/水/甲酸(79/20/1,v/v/v),涡旋2min,在4℃条件下离心10min(3000rpm),取上层清液,加入相同体积的乙腈/水/甲酸(20/79/1,v/v/v),过0.22μm滤膜,待测。其中玉米样品1和2各做3个平行;
(2)采用CHI660A电化学工作站和三电极检测装置检测:
在4℃条件下吸取100μL样品于1.9mL 0.01mol/L PBS(pH 6.0)中检测ZEN和FB1
(3)采用CHI660A电化学工作站和三电极检测装置进行检测:
饱和甘汞电极作为参比电极,铂丝电极作为对电极,上述步骤中制备得到的适配体传感器作为工作电极:
工作液为0.1mol/L的磷酸盐缓冲液(pH 6.0);
运用示差脉冲法扫描(电压:-0.6V~0.6V,扫描速率:50mV/s),在工作液中ZEN的初始峰值电流为I1,FB1的初始峰值电流为I2,随后将待检溶液加入到工作液中,待检溶液与工作液的体积比为1:20,静置5min,测得ZEN的峰值电流为I3,FB1的峰值电流为I4,检测结果基于两个峰值电流的差值(ΔIZEN=I3-I1,ΔIFB1=I4-I2),ΔIZEN和ΔIFB1分别与ZEN浓度的对数(logCZEN)、FB1浓度的对数(logCFB1)在一定范围内呈线性相关,根据测得的ΔIZEN和ΔIFB1即可计算出工作液中ZEN和FB1的浓度,随后根据加入的待检溶液体积换算出待检溶液中ZEN和FB1的浓度。
结果:
(1)该适配体传感器在空白工作液、含0.1ng/mL ZEN和FB1的工作液和含10ng/mLZEN和FB1的工作液中的工作曲线如图3所示,空白工作液中ZEN的初始峰值电流I1=-36.07μA,FB1的初始峰值电流I2=-32.62μA。含0.1ng/mL ZEN和FB1的工作液中,ZEN的峰值电流I3=-20.99μA,FB1的峰值电流I4=-13.14μA,即:ΔIZEN-1=I3-I1=15.08μA,ΔIFB1-1=I4-I2=19.08μA。含10ng/mL ZEN和FB1的工作液中,ZEN的峰值电流I5=-17.84μA,FB1的峰值电流I6=-8.72μA,即:ΔIZEN-2=I5-I1=18.23μA,ΔIFB1-2=I6-I2=23.90μA。
(2)适配体传感器的特异性验证:实际玉米样品当中会有一些毒素经常与ZEN和FB1同时存在(例如黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、单端孢霉烯族类毒素等),为考察免疫传感器对ZEN的特异性,分别检测只含有ZEN、FB1、α-ZOL、FB2、AFB1、DON、T-2和OTA的工作液(毒素浓度均为1ng/mL),ZEN和FB1的ΔI(μA)依次为(19.60,0.46),(0.51,22.34),(0.52,0.47),(0.90,0.29),(0.52,0.52),(0.27,0.27),(0.47,0.53),(0.52,0.35);当分别检测含有ZEN+FB1、ZEN+FB1+α-ZOL、ZEN+FB1+FB2、ZEN+FB1+AFB1、ZEN+FB1+DON、ZEN+FB1+T-2、ZEN+FB1+OTA和ZEN+FB1+α-ZOL+FB2+AFB1+DON+T-2+OTA的工作液(每种毒素的浓度均为1ng/mL),ZEN和FB1的ΔI(μA)依次为(19.20,22.65),(19.33,22.85),(18.87,22.88),(19.13,22.88),(19.11,22.69),(19.94,22.71),(20.02,22.74),(19.92,22.89)。由此可见,在工作液中有ZEN和FB1与上述一种或多种毒素同时存在,与只有同等浓度ZEN存在的情况下,观察到的ΔI差异很小,在竞争性吸附中该免疫传感器展现出了良好的特异性;
(3)适配体传感器的稳定性验证:根据上述检测方法,同一适配体传感器在工作液中连续扫描20次,仅有少于1%的信号降低;
(4)适配体传感器的重现性验证:用同样的方法制造5根免疫传感器,检测1ng/mL的ZEN和FB1,结果的相对标准偏差(RSD)为3.3%和3.0%;
(5)检测方法的线性与灵敏度验证:在0.001~100ng/mL范围内,本方法具有良好的线性关系,ΔI与工作液中ZEN浓度的对数(logCZEN)呈线性相关,相关系数(R2)为0.9911;检出限为0.0005ng/mL;在0.001~10ng/mL范围内,本方法具有良好的线性关系,ΔI与工作液中FB1浓度的对数(logCFB1)呈线性相关,相关系数(R2)为0.9906;检出限为0.0005ng/mL;
(6)检测方法的回收率验证:采用基质加标法对方法的回收率进行考察,取空白玉米样本,分别添加低、中、高三个浓度水平的ZEN标准品(0.05ng/mL,0.5ng/mL,5ng/mL和50ng/mL)和FB1标准品(0.05ng/mL,0.5ng/mL,2.5ng/mL和5ng/mL),回收率结果为95.94~105.18%和93.77~102.40%。
(7)实际玉米样品检测结果:玉米样品1中ZEN的检测结果为73.3±2.8ng/mL,测得FB1的值为665.5±8.5ng/mL;玉米样品2中ZEN的检测结果为83.9±2.1ng/mL,测得FB1的值为40.4±1.7ng/mL(n=3)。
综上可见,本发明的适配体传感器及检测方法,可以有效地放大信号,获得较高灵敏度,对玉米等农作物中的ZEN和FB1进行同时测定,并且特异性高,选择性好,回收率高,重现性好。样品检测过程仅需20min,与现有检测方法相比,无需依赖昂贵的大型仪器,前处理简单,且在保证结果准确性的同时,实现了快速检测,极大的节省了成本,提高了检测效率。
本发明的保护范围并不限于实施例中所作的描述,不偏离本发明方案中心的修改都属于本发明的保护范围。
Claims (5)
1.一种同时检测玉米赤霉烯酮ZEN和伏马毒素B1FB1的适配体传感器的制备方法,其特征在于该方法包括如下步骤:
(1)向玻碳电极覆盖还原性二硫化钼和金纳米粒子复合物rMoS2-Au纳米材料,晾干;
(2)随后在电极上滴涂玉米赤霉烯酮核酸适配体AP1和伏马毒素B1核酸适配体AP2的混合溶液,1 ~ 10 μmol/L,v/v,1/1,进行孵育1 ~ 10 h,用1 mg/mL BSA封闭;
(3)最后,滴涂5'端修饰金纳米粒子和硫堇的ZEN核酸适配体部分互补序列CP1-Au-Thi溶液与5'端修饰金纳米粒子和二茂铁基己硫醇的FB1核酸适配体部分互补序列CP2-Au-FC6S溶液的混合溶液,1 ~ 10 μmol/L,v/v,1/1,进行孵育1 ~ 10 h,即得到所需的适配体传感器;
其中,rMoS2-Au纳米材料是通过以下方法制备得到的:
向N, N-二甲基甲酰胺DMF中加入单层二硫化钼MoS2和三水合氯金酸HAuCl4·3H2O,使得两者浓度分别为0.1 ~ 1 mg/mL、0.1-2%,室温下超声处理10 ~ 60 min后,得到MoS2和HAuCl4·3H2O复合物的分散液;将该分散液滴到玻碳电极上,晾干,然后在NaCl溶液中电化学还原,即得;
其中所述CP1-Au-Thi溶液是通过如下方法制备得到的:
用TE缓冲液pH 4.0 ~ 8.0将ZEN核酸适配体部分互补链CP1稀释到1 ~ 10 μmol/L,取0.5 ~ 5 mL CP1溶液与1 ~ 10 mL金纳米粒子分散液轻微振荡1-20 h,室温静置后离心5 ~60 min,3000 ~ 10000 rpm,后去除上层清液,将沉淀物重新分散于0.1 ~ 5 mL TE溶液中;加入1 ~ 10 mL Thi溶液,轻微振荡1 ~ 20 h,室温静置后离心5 ~ 60 min,3000 ~ 10000rpm,去除上层清液,将沉淀物重新分散于0.1 ~ 5 mL TE缓冲溶液中,即制得CP1-Au-Thi溶液;
其中所述CP2-Au-FC6S溶液是通过如下方法制备得到的:
用TE缓冲液pH 4.0 ~ 8.0将FB1核酸适配体部分互补链CP2稀释到1 ~ 10 μmol/L,取0.5 ~ 5 mL CP2溶液与1 ~ 10 mL金纳米粒子分散液轻微振荡1 ~ 20 h,室温静置后离心5~ 60 min,3000 ~ 10000 rpm,去除上层清液,将沉淀物重新分散于0.1 ~ 5 mL TE溶液中;加入1 ~ 10 mL FC6S溶液,1 ~ 20 mmol/L,轻微振荡1 ~ 20 h,室温静置后离心5 ~ 60min,3000 ~ 10000 rpm,去除上层清液,将沉淀物重新分散于0.1 ~ 5 mL TE缓冲溶液中,即制得CP2-Au-FC6S溶液。
2.根据权利要求1所述的同时检测玉米赤霉烯酮ZEN和伏马毒素B1 FB1的适配体传感器的制备方法,其特征在于其中所述用来制备CP1-Au-Thi和CP2-Au-FC6S的金纳米粒子分散液是通过如下方法制备得到的:
将0.1 ~ 10 mL HAuCl4·3H2O,1 ~ 50 mmol/L,与10 ~ 50 mL超纯水在搅拌状态下加热至沸腾后,加入0.1 ~ 10 mL柠檬酸钠溶液,0 ~ 1 mol/L,溶液呈酒红色后即停止加热,自然冷却至室温,即制得所需金纳米粒子分散液。
3.根据权利要求1所述的同时检测玉米赤霉烯酮ZEN和伏马毒素B1 FB1的适配体传感器的制备方法,其特征在于还包括对玻碳电极进行预处理,预处理的具体步骤为:玻碳电极用氧化铝粉末抛光成镜面,然后依次在无水乙醇和丙酮中超声清洗、晾干。
4.权利要求1-3任一项所述方法制备得到的同时检测玉米赤霉烯酮ZEN和伏马毒素B1FB1的适配体传感器。
5.一种用于同时检测玉米赤霉烯酮ZEN和伏马毒素B1 FB1的方法,该方法包括如下步骤:
(1)样本前处理:取玉米粉末样本,加入3 ~ 10倍体积的乙腈/水/甲酸,60/39.5/0.5 ~90/5/5,v/v/v,溶液,涡旋2 min,在4 ℃条件下离心5 ~ 20 min,1000 ~ 5000 rpm,取上层清液,加入相同体积的乙腈/水/甲酸,49/50/1 ~ 9.5/90/0.5,v/v/v;涡旋混匀,过0.22 µm滤膜;最后吸取10 ~ 200 μL于1 ~ 10 mL PBS,pH 4.0 ~ 8.0,中用于检测ZEN和FB1;
(2)采用电化学工作站和三电极体系检测装置检测:饱和甘汞电极作为参比电极,铂丝电极作为对电极,权利要求4所述适配体传感器作为工作电极;
工作液为0.01-0.1 mol/L的磷酸盐缓冲液;
运用示差脉冲法扫描,电压:−1.0 V ~ 1.0 V,扫描速率:20 ~ 200 mV/s,在工作液中ZEN的初始峰值电流为I1,FB1的初始峰值电流为I2,随后将待检样本溶液加入到工作液中,待检溶液与工作液的体积比为1:1000 ~ 1:25,静置5 min,测得ZEN的峰值电流为I3,FB1的峰值电流为I4,检测结果基于两个峰值电流的差值ΔIZEN = I3 − I1,ΔIFB1 = I4− I2,ΔIZEN和ΔIFB1分别与ZEN浓度的对数logCZEN、FB1浓度的对数logCFB1在一定范围内呈线性相关,根据测得的ΔIZEN和ΔIFB1即可计算出工作液中ZEN和FB1的浓度,随后根据加入的待检样本溶液体积换算出待检溶液中ZEN和FB1的浓度。
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