CN211426360U - 一种孔雀石绿电化学传感器 - Google Patents
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Abstract
本实用新型公开一种孔雀石绿电化学传感器，该传感器首先合成金纳米棒，在玻碳电极表面固定壳聚糖/金纳米棒，然后加入包被原，使用牛血清蛋白(BSA)封闭未结合的活性位点。加入待测样品和孔雀石绿抗体，再加入金纳米棒标记的二抗和酶。所构建的传感器连接电化学工作站，利用酶催化底物产生电化学信号，可对水产品中孔雀石绿进行定量分析。本实用新型的电化学传感器具有快速、灵敏、特异、准确等优点，具有良好的推广应用前景。
Description
技术领域
本实用新型涉及检测技术领域，尤其涉及一种孔雀石绿电化学传感器。
背景技术
孔雀石绿(Malachite Green，MG)是三苯甲烷类化合物，自1933年起作为治疗寄生虫、细菌、真菌感染的特效药物，在水产养殖业中广泛使用。但自20世纪90年代以来，孔雀石绿及其代谢产物毒副作用才被逐步认识。孔雀石绿具有高毒性、高残留、高致癌和高致畸、致突变等副作用，对人类健康和环境造成严重危害。日本、加拿大、欧盟均规定在食用鱼等水产品中不得检出孔雀石绿，我国在2002年5月将其列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》 (农业部公告193号)中。然而，由于孔雀石绿价格低廉，一些不法商贩仍在非法使用，致使孔雀石绿残留事件时有发生。从2005年起，欧盟、日本等国家和地区曾从我国进口的鳗鱼中检出孔雀石绿残留，不仅影响生态环境和人类的身心健康，还严重影响我国食品质量安全和市场竞争力。
目前对孔雀石绿分析的仪器分析方法耗时、价格昂贵、操作复杂、样品前处理时间长，对操作人员要求高，难以满足现场快速检测的要求。免疫分析方法是近年来发展起来的食品安全检测新技术，该技术可弥补仪器检测法的不足，具有高特异性和极低检测限等优点在临床、生物制药和环境化学等领域得到广泛应用，尤其适合现场筛选和大批量样品快速筛查分析。
实用新型内容
本实用新型的目的在于提供一种基于免疫分析法且检测灵敏度高的孔雀石绿电化学传感器及应用。
为达到以上目的，本实用新型采用如下技术方案。
一种孔雀石绿电化学传感器，包括：电极，其特征在于，在所述电极表面附着有壳聚糖层，在所述壳聚糖层表面附着有金纳米棒层，在所述金纳米棒层表面附着包被原层。
更为优选的是，所述包被原层的未结合位点通过BSA封闭。
更为优选的是，所述包被原层为孔雀石绿与卵清蛋白(OVA)的偶联物。
更为优选的是，所述金纳米棒的长度在10-60nm之间，所述金纳米棒的宽度在5-30nm之间。
更为优选的是，所述电极为玻碳电极。
更为优选的是，所述电化学传感器与待测样品、孔雀石绿抗体HRP- AuNR-Ab2制备步骤如下：共同组成工作电极，所述工作电极接入电化学工作站。
更为优选的是，所述工作电极与铂电极、Ag/AgCl参比电极组成三电极体系。
本实用新型的有益效果是：
本实用新型提供的孔雀石绿电化学传感器，采用金纳米棒作为信号放大探针，使得包被原的吸附量大且排布紧密，从而有效提高检测灵敏度。此外，通过在基底和生物分子上加入金纳米棒，从而有效增加单位二抗上酶的固载量，进一步提高检测灵敏度。经实际测验，本实用新型提供的孔雀石绿电化学传感器对孔雀石绿的检测IC50为0.13ng/kg，线性范围为0.013ng/kg～1.29ng/kg，检测限可达0.0036ng/kg。
附图说明
图1所示为本实用新型提供的孔雀石绿电化学传感器结构示意图。
图2所示为金纳米棒的透射电镜图。
图3所示为检测标准曲线。
附图标记说明：
1；电极，2：壳聚糖层，3：金纳米棒层，4：包被原层，5：牛血清蛋白，6：孔雀石绿抗体，7：孔雀石绿，8：辣根过氧化物酶-金纳米棒-二抗。
具体实施方式
下面结合说明书的附图，对本实用新型的具体实施方式作进一步的描述，使本实用新型的技术方案及其有益效果更加清楚、明确。下面通过参考附图描述实施例是示例性的，旨在解释本实用新型，而不能理解为对本实用新型的限制。
本实用新型的附加方面和优点将在下面的描述部分中变得明显，或通过本实用新型的实践了解到。
如图1所示，一种孔雀石绿电化学传感器，包括：电极1，在所述电极1 表面附着有壳聚糖层2，在所述壳聚糖层2表面附着有金纳米棒层3，在所述金纳米棒层3表面附着包被原层4。
其中，所述电极1为玻碳电极。在其他实施方式中，所述电极为ITO或丝网印刷电极，不限于本实施例。
结合图2所示，所述金纳米棒层3中各金纳米棒的长度在10-60nm之间、宽度在5-30nm之间，以提高信号放大效果及包被原吸附性能。
所述包被原层为孔雀石绿与卵清蛋白(OVA)的偶联物。所述包被原层4的未结合位点通过牛血清蛋白5(BSA)封闭。
下面通过具体的工艺来说明上述孔雀石绿电化学传感器的形成过程及工作原理：
1)金纳米棒的制备：
在28℃水浴锅中将1mL、0.4mmol/L的HAuCl4和1mL、0.2mol/L的CTAB (十六烷基三甲基溴化铵)混匀，磁力搅拌下加入0.6mL、0.01mol/L经过预冷的NaBH4，剧烈搅拌2min，25℃水浴2h后形成金种子溶液。
然后合成生长溶液，分别往烧杯中加入4mL、0.2mol/L的CTAB，4mL、 1mmol/L的HAuCl4，0.1mL、4mmol/L的AgNO3，轻微混匀，缓慢加入0.07mL的 0.08mol/L抗坏血酸，直至溶液变无色。
取12μL金种子溶液加入生长溶液中，27℃保持20h。得到的金纳米棒用去离子水洗2次，7000r/min离心10min，分散在2ml去离子水中。
2)辣根过氧化物酶-金纳米棒-二抗(HRP-AuNR-Ab2)的制备：
用0.1mol/L的K2CO3将金纳米棒溶液的pH调至9.0。金纳米棒溶液中加入1mL、5μg/mL的二抗和1mL、0.5mg/mL的HRP，充分混匀20min后用0.5mL 5％的BSA溶液封闭1h，12000r/min、4℃离心30min，沉淀物用1mL、0.01mol/L、 pH值7.4的PBS((phosphate bufferedsolution，即磷酸盐缓冲液)反复洗涤。最后产物分散于1mL、0.0mol/L、pH值7.4的PBST(磷酸盐吐温缓冲液)中，4℃保存备用。
3)电化学传感器的制备：
1)玻碳电极(直径为2mm)分别经过粒径为0.1μm和0.05μm的三氧化二铝粉抛光至镜面，用去离子水冲洗电极表面，移入超声水浴中清洗5min。最后分别用HNO3和去离子水超声各清洗5min。清洗好的用去离子水冲洗电极表面，氮气吹干备用。
2)取200μL金纳米棒溶液加入50μL、0.2％的壳聚糖(CS)。斡旋震荡混匀后，滴加上述AuNR/CS溶液5μL到经过预处理的玻碳电极表面，室温下晾干。去离子水冲洗游离的AuNR，氮气吹干，滴加5μL一定浓度的包被原，37℃孵育40min。未吸附的包被原用0.01mol/L、pH7.4的PBST冲洗，氮气吹干后用 10μL、10％的BSA溶液孵育30min，封闭未结合位点，防止非特异性吸附。用 0.01mol/L、pH7.4的PBST冲洗电极，置于4℃冰箱中备用。
4)检测实验
实验采用非均相竞争反应模式，先加入待测样品和孔雀石绿抗体6(一抗)，包被原与游离的待测物孔雀石绿7竞争与一抗反应，然后加入辣根过氧化物酶-金纳米棒-二抗8用于捕获一抗，由于偶联了二抗的HRP可催化底物产生电信号，根据电信号与孔雀石绿浓度的关系建立检测方法，可确定待测物的浓度。电信号与孔雀石绿浓度的关系图如图3所示。
具体地，上述制备的电化学传感器与铂电极、Ag/AgCl参比电极组成三电极体系，在4mL、1mmol/L的对苯二酚缓冲液中，在-0.6～0.8V范围内，以100 mV/s的扫描速度进行CV扫描。分4次进行，每次加入5μL、0.48mol/L的H2O2，采用电化学工作站记录CV曲线。在电极表面发生的氧化还原反应，对此过程中还原峰电流值的变化进行检测。
当然，在其他实施方式中，各工艺中的具体参数，如：反应温度、原料用量、清洗次数、清洗时长等都可以根据实际需要进行适当调整，不限于本实施例。
本实施例提供的孔雀石绿电化学传感器，该传感器首先合成金纳米棒，在玻碳电极表面固定壳聚糖/金纳米棒，然后加入包被原，使用牛血清蛋白(BSA) 封闭未结合的活性位点。加入待测样品和孔雀石绿抗体，再加入金纳米棒标记的二抗和酶。所构建的传感器连接电化学工作站，利用酶催化底物产生电化学信号，可对水产品中孔雀石绿进行定量分析。该电化学传感器具有快速、灵敏、特异、准确等优点，具有良好的推广应用前景。
通过上述的结构和原理的描述，所属技术领域的技术人员应当理解，本实用新型不局限于上述的具体实施方式，在本实用新型基础上采用本领域公知技术的改进和替代均落在本实用新型的保护范围，本实用新型的保护范围应由各权利要求项及其等同物限定之。具体实施方式中未阐述的部分均为现有技术或公知常识。
Claims (7)
1.一种孔雀石绿电化学传感器，包括：电极，其特征在于，在所述电极表面附着有壳聚糖层，在所述壳聚糖层表面附着有金纳米棒层，在所述金纳米棒层表面附着包被原层。
2.根据权利要求1所述的一种孔雀石绿电化学传感器，其特征在于，所述包被原层的未结合位点通过BSA封闭。
3.根据权利要求1所述的一种孔雀石绿电化学传感器，其特征在于，所述包被原层为孔雀石绿与卵清蛋白(OVA)的偶联物。
4.根据权利要求1所述的一种孔雀石绿电化学传感器，其特征在于，所述金纳米棒层中各金纳米棒的长度在10-60nm之间，所述金纳米棒的宽度在5-30nm之间。
5.根据权利要求1所述的一种孔雀石绿电化学传感器，其特征在于，所述电极为玻碳电极。
6.根据权利要求1所述的一种孔雀石绿电化学传感器，其特征在于，所述电化学传感器与待测样品、孔雀石绿抗体HRP-AuNR-Ab2共同组成工作电极，所述工作电极接入电化学工作站。
7.根据权利要求6所述的一种孔雀石绿电化学传感器，其特征在于，所述工作电极与铂电极、Ag/AgCl参比电极组成三电极体系。
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| CN201922434620.7U CN211426360U (zh) | 2019-12-30 | 2019-12-30 | 一种孔雀石绿电化学传感器 |
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| CN110954582A (zh) * | 2019-12-30 | 2020-04-03 | 佛山职业技术学院 | 一种孔雀石绿电化学传感器 |
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2019
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