CN103512931B - 一种免标记适配体传感检测超低浓度赭曲霉毒素a的方法 - Google Patents
一种免标记适配体传感检测超低浓度赭曲霉毒素a的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种免标记适配体传感检测超低浓度赭曲霉毒素A的方法，具体步骤为以邻氨基苯硫酚功能化的氧化石墨烯（GO-SH）和氯金酸为起始原料，以柠檬酸钠为还原剂一锅法制备金纳米粒子修饰的功能化还原氧化石墨烯（Au-S-rGO），以Au-S-rGO为载体负载经巯基修饰的单链DNA3得到DNA3-Au-S-rGO。然后在金电极表面修饰经巯基修饰的单链DNA1，并通过碱基互补配对将适配体（DNA2）修饰到电极表面，然后将该传感界面与不同浓度的OTA反应。优点为：提供一种制备工艺简单，灵敏度高，测量范围宽，成本低的定量检测OTA的方法，解决现有检测成本高、检测方案复杂、检测时间过长、灵敏度较低的难题。
Description
技术领域
本发明涉及一种纳米金修饰的巯基化还原氧化石墨烯复合材料的合成方法及其作为标记物用于超低浓度赭曲霉毒素A（ochratoxin A，OTA）检测的电化学适配体传感器的制备方法，属于生物分子识别和纳米材料辅助信号放大技术领域。
背景技术
OTA是由曲霉和青霉菌代谢产生的一种具有多种毒性的真菌毒素，稳定性强，不易降解，广泛存在于粮食、饲料和谷类食物中。动物食用了含有OTA的饲料会导致体内毒素残留从而使肉制品被污染，这些残留的OTA也可以经由食物链进入人体，从而对人类健康及农业经济发展造成严重威胁。研究资料表明，OTA具有肾毒性、肝毒性、免疫毒性、基因毒性等，并且主要是通过促进膜的过氧化反应，抑制线粒体的呼吸作用和影响细胞信号传导通路中蛋白及关键因子的转录表达等来达到致毒效应。在已报道的真菌毒素中，OTA对人类的危害性仅次于黄曲霉毒素，国际癌症研究机构将其定义为2B类致癌物。
目前存在的OTA的检测方法有很多，主要包括薄层层析法、高效液相色谱法、免疫测定法等。薄层层析法的优点是方法简单，使用的试剂价格便宜，但是存在灵敏度较差，所需试剂繁多，检测周期长，重现性不好和无法实现自动化等缺点，已不能满足现代检测的要求。色谱法可以用于定性、定量检测，且检测结果相对准确、可靠，灵敏度高，重现性好，但是所用仪器价格昂贵，操作复杂且不适合用于大批量样品的检测，而且不能用于现场的快速检测。现场快速筛选方法以酶联免疫吸附法较多。但这种方法是基于抗原-抗体的亲和反应，以抗体作为识别分子，但由于抗体容易受到外界环境尤其是温度的影响，限制了该方法的推广。另一方面，抗体制备也需经过动物实验或者细胞实验，繁琐耗时，制备成本高，检测成本也高。
本发明以核酸适配体为识别元件用于OTA的电化学阻抗法检测。首先将金电极表面修饰上经巯基修饰的DNA、适配体及DNA功能化的金纳米粒子修饰的还原氧化石墨烯复合材料，大大提高了传感器的灵敏度和检测线性范围。该检测体系以修饰的金电极为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，铂电极为对电极，以电化学阻抗图谱为检测信号，通过对不同浓度OTA标准品检测，建立标准曲线，以达到对含OTA的样品进行定量检测的目的。
发明内容
技术问题：本发明旨在发明一种集免标记、高灵敏度、高选择性、简单易操作等优点为一体的电化学适配体传感器，提供一种制备工艺简单，灵敏度高，测量范围宽，成本低的定量检测OTA的方法，解决现有检测成本高、检测方案复杂、检测时间过长、灵敏度较低的难题。
技术方案：以邻氨基苯硫酚功能化的氧化石墨烯（GO-SH）和氯金酸为起始原料，以柠檬酸钠为还原剂一锅法制备金纳米粒子修饰的还原氧化石墨烯（Au-S-rGO)，以Au-S-rGO为载体负载经巯基修饰的DNA3得到DNA3-Au-S-rGO。然后在金电极表面修饰经巯基修饰的单链DNA1，并通过碱基互补配对将适配体（DNA2）修饰到电极表面，然后将该传感界面与不同浓度的OTA反应，由于在OTA存在的情况下，本发明中所述适配体与OTA会发生特异性结合而从电极表面脱离，残留的适配体将与DNA3发生杂交反应，进而将DNA3-Au-S-rGO捕获在电极表面形成传感界面。由于Au-S-rGO表面可以通过两种方式（基于π-π作用的吸附和Au-S的共价键合）负载大量的DNA3，少量的适配体就可以将大量的DNA3修饰在电极表面。而DNA链上的磷酸骨架所带的负电荷排斥带有同种电荷的氧化还原探针[Fe(CN)6]3−/4−，阻碍了[Fe(CN)6]3−/4−在界面上的电子传递，从而导致电荷转移电阻（Rct ）增大。通过对不同浓度的OTA标准品进行电化学阻抗法检测，建立阻抗值与OTA浓度之间的关系，以达到对含OTA的样品进行定量检测的目的。
具体的技术解决方案如下：
（1）氧化石墨烯表面巯基化：首先通过Hummers法制备氧化石墨烯（GO），然后将GO与1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）按质量比1:20:20在乙醇溶液中混合，室温下反应8 h，并不断进行搅拌。再将过量的邻氨基苯硫酚加入到上述反应体系中室温下继续搅拌12 h，邻氨基苯硫酚的加入量为：按GO：邻氨基苯硫酚质量比为1：40加入，反应结束后，用乙醇洗涤，离心后弃去上清液，用无水乙醇和水分别洗涤、离心数次，真空干燥后得到巯基化的氧化石墨烯（GO-SH）。
（2）金纳米粒子修饰的GO-SH复合材料的合成：称取步骤（1）中得到的GO-SH，超声分散在二次蒸馏水中，其中按每20 mL二次蒸馏水加入10 mg步骤（1）中得到的GO-SH，然后转移到三孔烧瓶中搅拌状态下加热回流0.5 h。再将新鲜配制的柠檬酸钠溶液（25 mg·mL– 1）缓慢加入到三孔烧瓶中，其中按每20 mL二次蒸馏水加入5 mL新鲜配制的柠檬酸钠溶液，继续加热回流2.5 h。最后将氯金酸溶液（2 wt%）加入到上述反应物中，其中按每20 mL二次蒸馏水加入150 μL氯金酸溶液，继续加热回流0.5 h后，停止加热，搅拌状态下冷却至室温。经水洗、离心后得到金纳米粒子修饰的GO-SH复合材料（Au-S-rGO），并重新分散在二次蒸馏水中备用。
（3）单链HS-DNA3修饰的Au-S-rGO的制备：将100 mM
HS-DNA3储备液加入到步骤（2）中得到的Au-S-rGO分散液（2 mg·mL– 1）中，其中按每1 mL步骤（2）中得到的Au-S-rGO分散液加入45 μL HS-DNA3，室温孵育、振荡24 h，然后加入2 M NaCl溶液，按每1 mL步骤（2）中得到的Au-S-rGO分散液加入100 μL NaCl溶液，继续振荡24 h，反应结束后，用二次蒸馏水洗、离心若干次，将产物（DNA3-Au-S-rGO）重新分散在Tris-HCl缓冲溶液中备用。
（4）金电极表面预处理：将金盘电极依次用1 μm、0.05 μm的氧化铝粉末进行打磨处理，然后在二次蒸馏水中超声清洗3 min，再在0.1 M H2SO4溶液中进行循环伏安扫描，扫描电位区间为-0.2 ~ 1.6 V，扫速为0.05 V s-1，直至出现重复的伏安峰为止。清洗电极、氮气吹干备用。
（5）电化学适配体传感器界面的修饰过程：首先将预处理的裸金电极浸入在5 μM的HS-DNA1溶液中，室温下反应6 h，接着用0.05 M Tris-HCl缓冲溶液和二次蒸馏水淋洗，氮气吹干；然后将电极浸没在0.01 mM
6-巯基己醇（MCH）中，室温条件下反应2 h，得到表面封闭过的电极，接着用Tris-HCl缓冲液和二次蒸馏水淋洗后氮气吹干；再将电极浸入到OTA核酸适配体（DNA2，5 μM）溶液中，室温条件下反应6 h，得到OTA核酸适配体修饰的电极，同样用Tris-HCl缓冲液和二次蒸馏水淋洗电极，氮气吹干，得到电化学适配体修饰的金电极（DNA2/DNA1-Au）。
（6）对OTA标准品进行检测，建立标准曲线：将修饰好的电化学传感界面置于不同浓度的OTA标准品溶液中反应，标准品溶液浓度依次为0、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、1、10、50 ng
mL-1，温育时间为2 h，将电极用Tris-HCl缓冲液和二次蒸馏水淋洗，氮气吹干；再将5 μL DNA3-Au-S-rGO滴涂在电极表面室温反应6 h，最后用Tris-HCl缓冲液和二次蒸馏水淋洗，氮气吹干，得到rGO-S-Au -DNA3/DNA2/DNA1-Au。将电化学适配体传感器作为工作电极，Ag/AgCl作为参比电极，铂丝作为对电极，置于 10 mL
0.1 M PBS 缓冲液中（0.1 M PBS （pH 7.4）+ 5 mM
[Fe(CN)6]3−/4− + 0.1 M KCl），扫描电化学阻抗图谱（EIS），根据阻抗值与对应的OTA标准品浓度建立标准曲线。
上述实验所涉及的：
1．单链 DNA1序列：5'–HS–TGT CCG ATG CTC–3'；
2．适配体 DNA2序列：5'–GAT CGG GTG TGG GTG GCG
TAA AGG GAG CAT CGG ACA–3'；
3．单链 DNA3序列：5'–CCA CAC CCG ATC–SH–3';
4．OTA 检测的标准曲线是指该传感器在与不同浓度的OTA进行反应后，再与DNA3-Au-S-rGO反应，并扫得其交流阻抗图谱，根据不同浓度下阻抗值制得的标准曲线。
有益效果：
1. 本发明通过先对GO表面进行巯基化制备了金纳米粒子修饰的还原氧化石墨烯（Au-S-rGO）；大量的HS-DNA3通过两种方式固定在Au-S-rGO表面，为免标记阻抗法检测提供了信号放大平台；
2. 本发明基于适配体对目标分子的特异性识别检测真菌毒素，因此不需要对样品进行分离纯化，并以电化学阻抗法作为检测手段，大大降低了小分子毒素检测的成本；
3. 本发明所提出的信号放大方法和检测模式实现了对OTA的灵敏检测，在0.001 ~ 50 ng mL-1的浓度区间内，OTA与R ct呈现良好的线性关系，检出限可达1 pg mL-1；
附图说明
图 1为（A）GO，（B）Au-S-rGO的透射电镜图；
图 2为检测不同浓度OTA所得到的阻抗值：0（a）、0.001（b）、0.005（c）、 0.01（d）、0.05（e）、0.1（f）、1（g）、10（h）、50（i）和 80（j） ng
mL-1（A）和OTA浓度与EIS值的线性关系图（B）；
图 3为电化学适配体传感器的组装示意图。
具体实施方式
实施例
1
：
还原氧化石墨烯复合材料的制备
（1）氧化石墨烯表面巯基化：首先通过Hummers法制备氧化石墨烯（GO），然后将25 mg GO与0.5 g 1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和0.5 g N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）在50 mL乙醇溶液中混合，室温下反应8 h，并不断进行搅拌。然后将1.0 g邻氨基苯硫酚加入到上述反应体系中室温下继续搅拌12 h，反应结束后，用乙醇洗涤，离心后弃去上清液，用无水乙醇和二次蒸馏水分别洗涤、离心数次，真空干燥后得到巯基化的氧化石墨烯（GO-SH）。
（2）金纳米粒子修饰的GO-SH复合材料的合成：称取10 mg GO-SH超声分散在20 mL二次蒸馏水中，然后转移到三孔烧瓶中搅拌状态下加热回流0.5 h。再将5 mL新鲜配制的柠檬酸钠溶液（25 mg mL– 1）缓慢加入到三孔烧瓶中，继续加热回流2.5 h。最后将150 μL氯金酸溶液（2 wt%）加入到上述反应物中，继续加热回流0.5 h后，停止加热，搅拌状态下冷却至室温。经二次蒸馏水洗、离心后得到金纳米粒子修饰的GO-SH复合材料（Au-S-rGO），其透射电镜图如图1所示，并重新分散在5 mL二次蒸馏水中备用。
（3）单链HS-DNA3修饰的Au-S-rGO的制备：将45 μL 100 mM
HS-DNA3储备液加入到1 mL
Au-S-rGO分散液中（2 mg mL– 1），室温孵育、振荡24 h，然后加入100 μL 2 M NaCl溶液，继续振荡24 h，反应结束后，二次蒸馏水洗、离心若干次，将产物（DNA3-Au-S-rGO）重新分散在5 mL
Tris-HCl缓冲溶液中备用。
电化学适配体传感界面的修饰
（4）金电极表面预处理：将金盘电极依次用 1 μm、0.05 μm 的氧化铝粉末进行打磨处理，然后在二次蒸馏水中超声清洗 3 min，再在0.1 M H2SO4溶液中进行循环伏安扫描，扫描电位区间为-0.2 ~ 1.6 V，扫速为 0.05 V s-1，直至出现重复的伏安峰为止。清洗电极、氮气吹干备用。
（5）电化学适配体传感器界面的修饰过程：首先将预处理的裸金电极浸入在5 μM的HS-DNA1溶液中，室温下反应6 h，接着用0.05 M Tris-HCl缓冲溶液和二次蒸馏水淋洗，氮气吹干；然后将电极浸没在 0.01 mM
6-巯基己醇（MCH）中，室温条件下反应2 h，得到表面封闭过的电极，接着用Tris-HCl缓冲液和二次蒸馏水淋洗后氮气吹干；再将电极浸入到OTA核酸适配体（DNA2，5 μM）溶液中，室温条件下反应6 h，得到OTA核酸适配体修饰的电极，同样用Tris-HCl缓冲液和二次蒸馏水淋洗电极，氮气吹干，得到电化学适配体修饰的金电极（DNA2/DNA1-Au）。
建立赭曲霉毒素
A
检测的标准曲线
（6）对OTA标准品进行检测，建立标准曲线：将修饰好的电化学传感界面置于不同浓度的OTA 标准品溶液中反应，标准品溶液浓度依次为0、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、1、10、50 ng
mL-1，温育时间为2 h，将电极用Tris-HCl缓冲液和二次蒸馏水淋洗，氮气吹干；再将5 μL DNA3-Au-S-rGO滴涂在电极表面室温反应6 h，最后用Tris-HCl缓冲液和二次蒸馏水淋洗，氮气吹干，得到rGO-S-Au -DNA3/DNA2/DNA1-Au（组装示意图如图 3所示）。将电化学适配体传感器作为工作电极，Ag/AgCl作为参比电极，铂丝作为对电极，置于10 mL
0.1 M PBS 缓冲液中（0.1 M PBS （pH 7.4） + 5 mM
[Fe（CN）6]3−/4− +
0.1 M KCl），扫描电化学阻抗图谱（EIS），根据阻抗值与对应的OTA标准品浓度建立标准曲线。（结果如图2所示）
上述实验所涉及的：
1．单链DNA1序列：5'–HS–TGT CCG ATG CTC–3'；
2．适配体DNA2序列：5'–GAT CGG GTG TGG GTG GCG
TAA AGG GAG CAT CGG ACA–3'；
3．单链DNA3序列：5'–CCA CAC CCG ATC–SH–3'；
4．OTA检测的标准曲线是指该传感器在与不同浓度的OTA进行反应后，再与DNA3-Au-S-rGO反应，并扫得其交流阻抗图谱，根据不同浓度下阻抗值制得的标准曲线。
Claims (1)
1.一种免标记适配体传感检测超低浓度赭曲霉毒素A的方法，按下述步骤进行：以邻氨基苯硫酚功能化的氧化石墨烯GO-SH和氯金酸为起始原料，以柠檬酸钠为还原剂一锅法制备Au-S-rGO，以Au-S-rGO为载体负载经巯基修饰的DNA3单链得到DNA3-Au-S-rGO；然后在金电极表面修饰经巯基修饰的单链DNA1，并通过碱基互补配对将适配体DNA2修饰到电极表面，然后将该传感界面与不同浓度的赭曲霉毒素A反应；
其中：单链 DNA1序列：5'–HS–TGT CCG ATG CTC–3'；适配体 DNA2序列：5'–GAT CGG GTG TGG GTG GCG
TAA AGG GAG CAT CGG ACA–3'； 单链 DNA3序列：5'–CCA CAC CCG ATC–SH–3'；
其具体步骤按照下述方法进行：
（1）氧化石墨烯表面巯基化：首先通过Hummers法制备GO，然后将GO与1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐 （EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）按质量比1:20:20在乙醇溶液中混合，室温下反应8 h，并不断进行搅拌；再将过量的邻氨基苯硫酚加入到上述反应体系中室温下继续搅拌12 h，邻氨基苯硫酚的加入量为：按GO：邻氨基苯硫酚质量比为1：40加入，反应结束后，用乙醇洗涤，离心后弃去上清液，用无水乙醇和二次蒸馏水分别洗涤、离心数次，真空干燥后得到巯基化的氧化石墨烯GO-SH；
（2）金纳米粒子修饰的氧化石墨烯GO-SH复合材料的合成：称取步骤（1）中得到的氧化石墨烯GO-SH，超声分散在二次蒸馏水中，其中按每20 mL二次蒸馏水加入10 mg步骤（1）中得到的氧化石墨烯GO-SH，然后转移到三孔烧瓶中搅拌状态下加热回流0.5 h；再将新鲜配制的浓度为25 mg·mL– 1柠檬酸钠溶液缓慢加入到三孔烧瓶中，其中按每20 mL二次蒸馏水加入5 mL新鲜配制的柠檬酸钠溶液，继续加热回流2.5 h；最后将浓度为2 wt%的氯金酸溶液加入到上述反应物中，其中按每20 mL二次蒸馏水加入150 μL氯金酸溶液，继续加热回流0.5 h后，停止加热，搅拌状态下冷却至室温；经二次蒸馏水洗、离心后得到Au-S-rGO，并重新分散在二次蒸馏水中备用；
（3）单链HS-DNA3修饰的Au-S-rGO的制备：将100 mM
HS-DNA3储备液加入到步骤（2）中得到的浓度为2 mg·mL– 1Au-S-rGO分散液中，其中按每1 mL步骤（2）中得到的Au-S-rGO分散液中加入45 μL HS-DNA3，室温孵育、振荡24 h，然后加入2 M NaCl溶液，按每1 mL步骤（2）中得到的Au-S-rGO分散液中加入100 μL NaCl溶液，继续振荡24 h，反应结束后，用二次蒸馏水洗、离心若干次，将产物DNA3-Au-S-rGO重新分散在Tris-HCl缓冲溶液中备用；
（4）金电极表面预处理：将金盘电极依次用1 μm、0.05 μm的氧化铝粉末进行打磨处理，然后在二次蒸馏水中超声清洗3 min，再在0.1 M H2SO4溶液中进行循环伏安扫描，扫描电位区间为-0.2 ~ 1.6 V，扫速为0.05 V s-1，直至出现重复的伏安峰为止；清洗电极、氮气吹干备用；
（5）电化学适配体传感界面的修饰过程：首先将预处理的裸金电极浸入在5 μM的HS-DNA1溶液中，室温下反应6 h，接着用0.05 M Tris-HCl缓冲溶液和二次蒸馏水淋洗，氮气吹干；然后将电极浸没在0.01 mM
6-巯基己醇（MCH）中，室温条件下反应2 h，得到表面封闭过的电极，接着用Tris-HCl缓冲液和二次蒸馏水淋洗后氮气吹干；再将电极浸入到5 μM 赭曲霉毒素A核酸适配体DNA2溶液中，室温条件下反应6 h，得到赭曲霉毒素A核酸适配体修饰的电极，同样用Tris-HCl缓冲液和二次蒸馏水淋洗电极，氮气吹干，得到电化学适配体修饰的金电极DNA2/DNA1-Au；
（6）对赭曲霉毒素A标准品进行检测，建立标准曲线：将修饰好的电化学传感界面置于不同浓度的赭曲霉毒素A标准品溶液中反应，标准品溶液浓度依次为0、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、1、10、50 ng
mL-1，温育时间为2 h，将电极用Tris-HCl缓冲液和二次蒸馏水淋洗，氮气吹干；再将5 μL DNA3-Au-S-rGO滴涂在电极表面室温反应6 h，最后用Tris-HCl缓冲液和二次蒸馏水淋洗，氮气吹干，得到rGO-S-Au -DNA3/DNA2/DNA1-Au；将电化学适配体传感器作为工作电极，Ag/AgCl作为参比电极，铂丝作为对电极，置于 10 mL
0.1 M PBS 缓冲液中，缓冲液为0.1 M PBS pH 7.4 + 5 mM [Fe(CN)6]3−/4− + 0.1 M KCl，扫描电化学阻抗图谱EIS，根据阻抗值与对应的赭曲霉毒素A标准品浓度建立标准曲线。
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| CN102912020A (zh) * | 2012-10-20 | 2013-02-06 | 江南大学 | 一种测定赭曲霉毒素a的适配体传感器的构建方法 |
-
2013
- 2013-07-26 CN CN201310320706.1A patent/CN103512931B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101936940A (zh) * | 2010-09-03 | 2011-01-05 | 江南大学 | 一种电化学发光适配体传感器检测赭曲霉毒素a的方法 |
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| "PVP-coated graphene oxide for selective determination of ochratoxin A via quenching fluorescence of free aptamer";Linfeng Sheng et al;《Biosensors and Bioelectronics》;20110202;第3494-3499页 * |
| "核酸适配体识别-荧光法检测赭曲霉素A";段诺等;《分析化学》;20110331;第39卷(第3期);第300-304页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103512931A (zh) | 2014-01-15 |
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