CN102517288A - 赭曲霉毒素a核酸适体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种与赭曲霉毒素A高特异性和高亲和力结合的核酸适体及其应用，该核酸适体可以用于赭曲霉毒素A的检测分析和分离富集，具有特异性好、亲和力高、品质均一、稳定性好、开发周期短、生产成本低、使用方便的特点。本发明还涉及所述核酸适体序列的衍生序列，包括修饰后的序列。

Description

赭曲霉毒素A核酸适体及其应用

(一)技术领域：

本发明属于生物技术领域，涉及利用分子生物学技术----SELEX技术设计和制备一种与赭曲霉毒素A高特异性和高亲和力结合的赭曲霉毒素A核酸适体及其应用。

(二)背景技术：

赭曲霉毒素是由真菌产生的一组结构类似的有毒的次级代谢产物，有A、B、C、D四种化合物，其中毒性最大、分布最广、产毒量最高、对农作物污染最严重、与人类健康关系最密切是赭曲霉毒素A(ochratoxin A，OTA)。OTA是由vender Merve于1965年首次从赭曲霉中分离的到的一种真菌毒素，其化学结构为苯甲酸异香豆素，主要由青霉属某些菌株和赭曲霉及黑曲霉产生，广泛存在于谷物、咖啡豆、豆类、葡萄干、啤酒、葡萄汁等各类食物和饲料中，谷物及其副产品是OTA的主要来源。OTA主要危害人和动物的肾脏，具有免疫抑制毒性、神经毒性和致畸性，并于1993年被国际癌症研究机构列为可能的人类致癌物。

OTA的定性分析方法有微柱法，因灵敏度较低已极少应用；定量分析方法有薄层色谱法(TLC)、高效薄层色谱法(HPTLC)、高效液相法(HPLC)、荧光比色法和酶联免疫吸附法(ELISA)等，其中TLC法为我国检测小麦、玉米和大豆中OTA的国家标准检测方法，HPLC法是谷物、宠物食品、咖啡、啤酒、葡萄汁/干、牛奶、肾脏及其它肉类食品、人和动物组织液中OTA的较灵敏检测方法，而灵敏、高效、便捷的OTA检测方法当属ELISA、RIA等免疫学方法，特别是ELISA，由于简单的样品预处理过程而广泛应用于谷物、饲料、动物组织和血清中OTA的测定。在ELISA分析中，抗体与待测OTA反应的专一性是影响检测结果准确与否的重要因素。研究结果显示，抗OTA单克隆抗体与其同系物OTC的交叉反应率为15～20％，商品化检测OTA的

ELISA试剂盒所用抗体与OTC和OTB的交叉反应率分别为44％和14％，这无疑会大大影响检测结果的准确度，因此获得高特异性抗OTA的抗体是建立其免疫学检测法的基础。核酸适体(aptamer)是一种比抗体具有更高特异性的配基，甚至能识别单抗所不能区分的靶标分子单个取代基修饰的极细微差别，加之对于OTA这种毒性小分子，其体外筛选、体外制备的特点能够有效克服抗体制备周期长、生产成本高、技术难度大、批间差异大、克隆株(细胞)难以有效保存的缺点，因此，核酸适体在OTA这种拥有复杂结构类似物的毒性小分子的快速检测中具有良好的应用前景。

(三)发明内容：

本发明的目的在于提供一种采用新一代SELEX技术筛选得到的能够与赭曲霉毒素A高特异性和高亲和力结合的结构转换信号适体，并提供赭曲霉毒素A核酸适体在赭曲霉毒素A检测分析和样品分离富集中的应用方法；具有简便、快速、经济等特点，与其他组合化学库如随机肽库、抗体库和噬菌体表面展示文库相比，从寡核苷酸文库中筛选出的适体具许多优势。

本发明的技术方案：一种赭曲霉毒素A核酸适体，其特征在于为核苷酸序列

GCATCACTACAGTCATTACGCATCGAGCAGGAGACCAGAGGGCGCAGCTACTGAGTGGTATCGTGTGAAGTGCTGTCCC或其互补的核苷酸序列所示的DNA分子。

所述赭曲霉毒素A核酸适体的衍生物具有相同功能用途。

所述赭曲霉毒素A核酸适体的衍生物为核苷酸序列进行氨基化或巯基化或同位素化修饰。

所述赭曲霉毒素A核酸适体的衍生物为核苷酸序列结合生物素或酶或地高辛或荧光物质或纳米发光材料。

一种赭曲霉毒素A核酸适体的应用，其特征在于将赭曲霉毒素A核酸适体用于赭曲霉毒素A的检测分析，包括以下步骤：

(1)竞争板准备：50μg/ml手臂分子氨基丙基三乙氧基硅烷或多聚赖氨酸100μl于4℃包被过夜，交联剂次亚苯基二异硫氰酸盐或戊二醛活化6h，200-2000pmol/ml NH₂-引物100μl偶联，0.2mol/L乙醇胺或甘氨酸封闭2h，硼氢化钠还原，1％BSA封闭，PBS洗涤后备用；

(2)检测步骤：

①赭曲霉毒素A核酸适体5-10pmol，94℃3min、冰上5min变性；

②与0-100pmol靶标混匀，总体积100μl，加入板中，室温孵育30min；

③吸取50μl加入荧光板中，加入1∶200 OliGreen 100μl，作用5min；

④测定荧光值(Ex：485nm，Em：525nm)。

标准曲线：通过6次重复试验，以荧光数值为纵坐标，以标准浓度为横坐标，做标准曲线。

灵敏度计算：通过6次重复试验，检测的标靶含量为0ng/ml±3*STDV。

重复性：标样重复测定5次，计算其测定离散度CV值。

回收率：以玉米甲醇提取物稀释50倍为样品，加入低、中、高浓度标准，重复测定3次，计算其回收率。

OTA检测试剂盒：检测灵敏度：1.14ng/ml，重复性：CV＜6％

以玉米匀浆甲醇提取物为样品1∶50稀释，回收率见表：

一种赭曲霉毒素A核酸适体的应用，其特征在于将赭曲霉毒素A核酸适体用于从样品中分离、富集赭曲霉毒素A，包括以下步骤：

(1)将偶联有赭曲霉毒素A核酸适体的磁颗粒与待分离的含赭曲霉毒素A的溶液充分混合；

(2)用磁分离器富集磁颗粒，并清洗，然后将赭曲霉毒素A从偶联有核酸适体的磁颗粒上解离，得到赭曲霉毒素A单组份。

一种赭曲霉毒素A核酸适体的互补序列的应用，其特征在于应用于赭曲霉毒素A检测分析中，包括以下步骤：

①赭曲霉毒素A检测层析试纸条，其基本结构组成包括：支撑垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫等；

②胶体金结合垫上含有核酸适体与其互补序列组装的纳米颗粒聚集体(经生物素标记)6μl，硝酸纤维素膜上含有1-10mg/ml链霉亲和素2μl的检测线；

③检测时，将试纸条吸收板端插入待测样品的溶液中，约20s，液体完全湿润连接板并进入膜，取出纸条，放在平台上让液体继续流动，若待测液中无靶标，聚集体较大，不能随液流进入硝酸纤维素膜，不显色，若待测液中有靶标赭曲霉毒素A存在，可导致组装的聚集体解离而形成分散的纳米颗粒，分散的纳米颗粒随液流进入纤维素膜，纳米颗粒上的生物素标记物与膜上链霉亲和素结合，显红色，是为阳性结果，且显色程度与靶标浓度呈正比关系。

本发明一种赭曲霉毒素A核酸适体的特性评测：

1、荧光定量PCR法评价赭曲霉毒素A核酸适体的活性：

充分洗涤组装(通过其互补序列实现)有赭曲霉毒素A核酸适体的磁颗粒，然后用终浓度1μM的赭曲霉毒素A进行竞争，室温反应30min。以竞争反应产物为模板进行荧光定量PCR反应，采用Invitrogen公司的试剂盒PlatinumSYBR Green qPCR SuperMix-UD6，20μl体系中含模板2μl、引物P1、P2各20pmol，退火温度65℃。同时设置以溶剂甲醇作为竞争物的对照组。

结果：

可见赭曲霉毒素A核酸适体对赭曲霉毒素A具有特异性亲和能力。

2、染料法评价赭曲霉毒素A核酸适体的活性：

充分洗涤组装(通过其互补序列实现)有赭曲霉毒素A核酸适体的磁颗粒，然后用终浓度1μM的赭曲霉毒素A进行竞争，室温反应30min。Oligreen染料用结合缓冲液按1∶200稀释后，等比例加入竞争反应液中，室温避光反应2-5min，用480nm光激发，测定520nm处的发射光。同时设置以甲醇作为竞争物的对照组和结合缓冲液本底对照组。

结果本底对照组未检测到发射光，实验组荧光强度显著高于甲醇对照组，可见赭曲霉毒素A核酸适体对赭曲霉毒素A具有特异性亲和能力。

3、经基团修饰的赭曲霉毒素A核酸适体的活性评价：

依荧光定量PCR法评价赭曲霉毒素A核酸适体的活性的方法，用荧光定量PCR法分别进行氨基化赭曲霉毒素A核酸适体、巯基化赭曲霉毒素A核酸适体、同位素化赭曲霉毒素A核酸适体、生物素标记的赭曲霉毒素A核酸适体、HRP标记的赭曲霉毒素A核酸适体、AP标记的赭曲霉毒素A核酸适体、地高辛标记的赭曲霉毒素A核酸适体、TAMRA标记的赭曲霉毒素A核酸适体、以及纳米发光材料Y₂SiO₅:Eu标记的赭曲霉毒素A核酸适体的活性评价。

结果：

可见氨基化赭曲霉毒素A核酸适体、巯基化赭曲霉毒素A核酸适体、同位素化赭曲霉毒素A核酸适体、生物素标记的赭曲霉毒素A核酸适体、HRP标记的赭曲霉毒素A核酸适体、AP标记的赭曲霉毒素A核酸适体、地高辛标记的赭曲霉毒素A核酸适体、TAMRA标记的赭曲霉毒素A核酸适体、以及纳米发光材料Y₂SiO₅:Eu标记的赭曲霉毒素A核酸适体对赭曲霉毒素A均具有特异性亲和能力。

本发明的优点是：1)本身是寡核苷酸，分子量较小，可以化学合成，节约成本；2)具有比抗体更高的亲和性和特异性；3)便于标记且可以在不同部位有选择性的标记；4)重复性和稳定性好，且易于保存，即对高温和剧烈条件不敏感。因此，核酸适体技术具有良好的应用前景，特别是在检测分析领域。

(四)具体实施方式：

实施例：一种赭曲霉毒素A核酸适体，其特征在于为核苷酸序列

GCATCACTACAGTCATTACGCATCGAGCAGGAGACCAGAGGGCGCAGCTACTGAGTGGTATCGTGTGAAGTGCTGTCCC或其互补的核苷酸序列所示的DNA分子。

本发明中用于SELEX的单链DNA随机库及引物由Takara公司合成，两端为固定序列，中间为35个碱基的随机序列：5’GCATCACTACAGTCATTACGCATCG-(N35)-ATCGTGTGAAGTGCTGTCCC 3’，库容量为1014以上，引物1：5’GCATCACTACAGTCATTACGCA-3’，引物2：5’GGGACAGCACTTCACACGAT 3’，引物3：5’GCGTAATGACAAAAAAAAAAACAT-C6-NH23’，引物4：5’Biotin-GGGACAGCACTTCACACGAT 3’。赭曲霉毒素A购自ALEXIS公司，磁珠购于invitrogen公司，寡核苷酸的纯化试剂购于Qiagen公司，PCR试剂盒和T载体购于普洛麦格(Promega)公司。

一种赭曲霉毒素A核酸适体的筛选制备：

将初始文库通过互补序列偶联于磁颗粒上，以溶剂为反筛分子、赭曲霉毒素A为筛选分子进行筛选。在赭曲霉毒素A存在下，与其有结合能力的寡核苷酸序列从磁颗粒上解离，经PCR扩增后，采用亲和分离纯化法制备次级文库，重复筛选8轮，克隆测序，获得赭曲霉毒素A的单克隆核酸适体。

一种赭曲霉毒素A核酸适体的应用，其特征在于将赭曲霉毒素A核酸适体用于赭曲霉毒素A的检测分析，包括以下步骤：

(1)竞争板准备：多聚赖氨酸(50μg/ml，CBS)100μl于4℃包被过夜，戊二醛(2.5％，PBS)活化6h，NH2-引物(2000pmol/ml，PBS)100μl偶联，乙醇胺(0.2mol/L，pH8.0)封闭2h，硼氢化钠还原，BSA(1％，PBS)封闭，PBS洗涤后备用；

(2)检测步骤：

①赭曲霉毒素A核酸适体5-10pmol，94℃3min、冰上5min变性；

②与靶标(0-100pmol)混匀，总体积100μl，加入板中，室温孵育30min；

③吸取50μl加入荧光板中，加入100μl OliGreen(1∶200，TAE)，作用5min；

④测定荧光值(Ex：485nm，Em：525nm)。

标准曲线：通过6次重复试验，以荧光数值为纵坐标，以标准浓度为横坐标，做标准曲线。

灵敏度计算：通过6次重复试验，检测的标靶含量为0ng/ml±3*STDV。

重复性：标样重复测定5次，计算其测定离散度CV值。

回收率：以玉米甲醇提取物稀释50倍为样品，加入低、中、高浓度标准，重复测定3次，计算其回收率。

OTA检测试剂盒：检测灵敏度：1.14ng/ml，重复性：CV＜6％

以玉米匀浆甲醇提取物为样品1∶50稀释，回收率见表：

一种赭曲霉毒素A核酸适体的应用，其特征在于将赭曲霉毒素A核酸适体用于从样品中分离、富集赭曲霉毒素A，包括以下步骤：

将偶联有赭曲霉毒素A核酸适体的磁颗粒与待分离的含赭曲霉毒素A的溶液充分混合，用磁分离器富集磁颗粒，并清洗，然后将赭曲霉毒素A从偶联有核酸适体的磁颗粒上解离，得到赭曲霉毒素A单组份。

一种赭曲霉毒素A核酸适体的互补序列的应用，其特征在于应用于赭曲霉毒素A检测分析中，包括以下步骤：

①赭曲霉毒素A检测层析试纸条，其基本结构组成包括：支撑垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫等；

②胶体金结合垫上含有核酸适体与其互补序列组装的纳米颗粒聚集体(经生物素标记)6μl，硝酸纤维素膜上含有10mg/ml链霉亲和素2μl的检测线；

③检测时，将试纸条吸收板端插入待测样品的溶液中，约20s，液体完全湿润连接板并进入膜，取出纸条，放在平台上让液体继续流动，若待测液中无靶标，聚集体较大，不能随液流进入硝酸纤维素膜，不显色，若待测液中有靶标赭曲霉毒素A存在，可导致组装的聚集体解离而形成分散的纳米颗粒，分散的纳米颗粒随液流进入纤维素膜，纳米颗粒上的生物素标记物与膜上链霉亲和素结合，显红色，是为阳性结果，且显色程度与靶标浓度呈正比关系。

Claims (6)

1.一种赭曲霉毒素A核酸适体，其特征在于为核苷酸序列

GCATCACTACAGTCATTACGCATCGAGCAGGAGACCAGAGGGCGCAGCTACTGAGTGGTATCGTGTGAAGTGCTGTCCC或其互补的核苷酸序所示的DNA分子。

2.根据权利要求1所述一种赭曲霉毒素A核酸适体，其特征在于与所述赭曲霉毒素A核酸适体具有相同功能用途的衍生物为核苷酸序列进行氨基化或巯基化或同位素化修饰。

3.根据权利要求1所述一种赭曲霉毒素A核酸适体，其特征在于与所述赭曲霉毒素A核酸适体具有相同功能用途的衍生物为核苷酸序列结合生物素或酶或地高辛或荧光物质或纳米发光材料。

4.一种权利要求1所述赭曲霉毒素A核酸适体的应用，其特征在于用于赭曲霉毒素A的检测分析。

5.一种权利要求1所述赭曲霉毒素A核酸适体的应用，其特征在于用于从样品中分离、富集赭曲霉毒素A

6.一种权利要求2或3所述赭曲霉毒素A核酸适体衍生物的应用，其特征在于应用于赭曲霉毒素A检测分析和分离富集中。