CN107119054A

CN107119054A - 基于核酸适配体特异性检测磺胺嘧啶的生物传感探针试剂盒及其应用

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Publication number: CN107119054A
Application number: CN201710308740.5A
Authority: CN
Inventors: 乐涛; 孙琦; 张磊; 张志浩
Original assignee: Chongqing Normal University
Current assignee: Chongqing Normal University
Priority date: 2017-05-04
Filing date: 2017-05-04
Publication date: 2017-09-01
Anticipated expiration: 2037-05-04
Also published as: CN107119054B

Abstract

发明提供了一种生物素标记磺胺嘧啶核苷酸适配体，其特征在于其特征在于：所述生物素标记磺胺嘧啶核苷酸适配体包括探针；所述探针的核苷酸序列为S‑SDZ No.1。本发明提供的试剂盒及方法具有检测快速、稳定、简单等优点，制得的核酸适体对SDZ残留检测快速、灵敏度高、重复性好，特异性高，在食品安全快速检测中有广阔应用前景。

Description

基于核酸适配体特异性检测磺胺嘧啶的生物传感探针试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于生物学与食品安全分析领域，具体涉及一种磺胺嘧啶残留的生物传感探针及其检测试剂盒制备方法和应用。

技术背景

兽药滥用和违禁使用的现象愈演愈烈，其残留不仅直接影响人类的身体健康(致癌、致畸、致敏、神经毒性)，诱导某些菌种产生耐药性，给人类生态环境造成严重的危害。磺胺嘧啶(Sulfadiazine，SDZ)是人工合成的广谱抗菌药物，对大多数革兰氏阳性菌和阴性菌有抑制作用。由于该类药物对于动物疾病的预防、治疗具有较好的效果，因而在畜牧业生产中被广泛应用。SDZ抗生素的不合理使用而导致其在动物源性食品中残留，通过食物链进入人体，对人体产生一定的毒副作用，具有潜在的致癌性。为了保障动物用药安全性和有效性，以及人类摄食动物性食品后的安全性，很多国家制定了抗生素的最高残留限量(maximum residue limit，MRL)。加拿大、美国、欧盟规定了动物源性食品中磺胺类抗生素总量的最大残留量为0.1mg/kg。我国规定动物性食品中SDZ的MRLs为0.1mg/kg。因此，为了提高动物源食品的安全性，建立高灵敏、高选择的磺胺类抗生素检测方法迫在眉睫。

常规检测SDZ残留的方法有高效液相-质谱联用、气相色谱-质谱联用、薄层色谱法和毛细管电泳法，这些仪器检测方法虽然准确，但样品前处理繁琐、试剂消耗量大、检测时间长、设备昂贵、需专业技术人员进行操作、不适合进行现场快速检测和大量样品的筛选，难以满足高通量多残留快速检测的需要。基于抗原-抗体特异性反应的免疫分析方法，由于灵敏度高、操作简便、成本低且适合现场快速检测而越来越受到重视。但针对SDZ靶标的抗体需要一系列繁琐复杂的动物体内筛选过程，实验周期长，成本高，同时抗体容易变性，对检测环境的要求很高。抗体的制备过程不仅需要使用实验动物，且制备出的抗体很难被重复生产，批间差异明显。因此，亟需开发灵敏、特异、快速的新型靶标识别元件用于磺胺类等抗生素的检测。

适配体(Aptamer)作为一种抗体的替代物，由于其具有靶标范围广，亲和力强，结合强度高，特异性好，制备、修饰方便快速等优点，为抗生素等靶标的特异性检测开辟了新的途经。适配体是一类在体外通过指数级富集的配体系统进化技术(SELEX)筛选出的能与各种目标分子高亲和、高特异结合的单链DNA或RNA片段，可以通过自身折叠形成二级或三级结构使其对特定靶标(如金属离子、小分子、蛋白、细胞等)有很强的亲和力，作为分子识别的元件，而广泛应用于医学临床诊断和治疗。在农产品及食品质量安全领域，已筛选到了针对真菌毒素、重金属离子、农药残留、兽药残留等污染物的适配体，建立了基于核酸适配体的检测方法。

经过对现有技术的检索发现，倪娟佳在《学位论文》公开了“恩诺沙星和磺胺二甲嘧啶核酸适配体的筛选及化学发光检测方法的研究”，筛选出能特异性识别SDZ的核酸适配体，并分别建立了用于牛奶中磺胺二甲嘧啶残留检测的直接竞争化学发光分析方法。结果：其对磺胺二甲嘧啶检测限为0.92ng/ml，IC₅₀为5.61ng/ml，线性范围为1.85-21.57ng/ml。该检测限明显低于目前国家限定的SDZ残留量。但该适配体特异性高，SDZ没有交叉反应。并且该基于适配体的检测方法主要是针对比较简单生物基质的检测，而鸡肉、鸡蛋等复杂基质成分的动物源性食品中若富含盐离子(Na⁺或K⁺)，将可能显著改变反应体系的离子浓度，使得该核酸适配体无法折叠成正确构型，将直接导致核酸适配体无法与靶标结合，从而导致检测方法的失败。使得上述化学发光适配体分析方法应用于动物源性食品临床样品检测时受到了极大限制。

本发明筛选到可以与SDZ高亲和力结合的单链DNA核酸适配体(Aptamer)序列，建立了基于纳米生物素(Biotin)化SDZ适配体传感探针(Biotin-SDZ aptamer)识别的荧光检测方法(检测方法原理见图1)，可用于动物源性食品中SDZ残留的快速、高灵敏度检测，在临床检测中具有十分重要意义。

发明内容

本发明目的：本发明针对现有技术存在的上述不足，提出一种基于核酸适配体特异性检测SDZ残留的生物传感探针及其检测试剂盒制备方法和应用。鉴于SDZ分子的结构特点，设计了改良的琼脂糖磁珠SELEX技术优选SDZ的方法，借助基于SELEX的组合化学技术，筛选得到能特异性识别SDZ靶标的DNA适配体，其特征在于，所述适配体的核苷酸序列如S-SDZ No.1所示。将SDZ核酸适配体(SDZ aptamer)通过纳米生物素(Biotin)粒子固定于其表面，以Biotin-核酸适配体为传感识别探针(Biotin-SDZ aptamer)，利用生物素-链霉亲和素系统，固化适配体探针，竞争识别检测样品中SDZ和辣根过氧化物(HRP)标记SDZ(HRP-SDZ)偶联物，建立了用于SDZ残留检测的直接竞争酶联适体分析法(direct competitiveenzyme-linked aptamer assay，dc-ELAA)，方法的具体原理及应用见图1。该适配体生物传感方法，利用适配体传感探针分别测试不同浓度靶标的标准品溶液，分析荧光增强比例与靶标物浓度之间的线性关系，优化影响探针识别性能的因子，进行探针对SDZ灵敏特异间接测定。

该适配体是SDZ的新型识别元件，具有稳定性良好、灵敏度高、成本低、易制备、易修饰和标记的高特异性的优势。

本发明筛选到可以与SDZ高亲和力结合的单链DNA适配体序列，首次建立一种dc-ELAA传感探针检测鸡肉、鸡蛋等动物源性组织中的SDZ抗生素。

一种基于核酸适配体特异性检测SDZ的生物传感探针试剂盒，包括Biotin标记SDZ核苷酸适配体(Biotin-SDZ aptamer)稀释液、SDZ-HRP稀释液、洗涤液和终止液；其特征在于所述Biotin-SDZ aptamer稀释液包括探针；所述探针的核苷酸序列为S-SDZ No.1。

5′-CGT ACG GTC GAC GCT AGC TTG GCC ATC TTG GCC GGG ATA AGG ATC CAGCCG TTG TAG ATT TGC GGT AGG GAA ACG TAT CAC GTG GAG CTC GGA TCC-3′。

为实现上述目的，本发明的技术方案提供如下：

一种SDZ的核酸适体，其探针中单链DNA片段(如核苷酸序列表中S-SDZ No.1所示)，具体序列如下：5′-CGT ACG GTC GAC GCT AGC TTG GCC ATC TTG GCC GGG ATA AGGATC CAG CCG TTG TAG ATT TGC GGT AGG GAA ACG TAT CAC GTG GAG CTC GGA TCC-3′。

将上述单链DNA片段进行修改或改造得到的核酸适体衍生物也属于本发明的保护范围。

所述Biotin-SDZ aptamer由单链DNA组成，且3'末端或5'末端标标记有Biotin。

所述的核酸适体衍生物为核苷酸序列上结合有Biotin纳米标记物。

所述探针由上述序列所示的单链DNA组成，且5'末端标记有Biotin或3'末端标记有Biotin，所述Biotin标记核酸适配体序如下：5′-Biotin-CGT ACG GTC GAC GCT AGC TTGGCC ATC TTG GCC GGG ATA AGG ATC CAG CCG TTG TAG ATT TGC GGT AGG GAA ACG TATCAC GTG GAG CTC GGA TCC-3′或5′-Biotin-CGT ACG GTC GAC GCT AGC TTG GCC ATC TTGGCC GGG ATA AGG ATC CAG CCG TTG TAG ATT TGC GGT AGG GAA ACG TAT CAC GTG GAGCTC GGA TCC-Biotin-3′。

本发明还提供了一种SDZ的核酸适体的制备方法，包括如下步骤：

(1)将SDZ、磺胺间甲氧嘧啶分别和羧基琼脂糖磁珠偶联

分别将SDZ、磺胺间甲氧嘧啶经活化氨基后，取羧基琼脂糖磁珠与活化的SDZ、磺胺间甲氧嘧啶溶液混合，进行偶联反应；获得SDZ、磺胺间甲氧嘧啶修饰的琼脂糖磁珠偶联物。

(2)单链DNA文库与相应引物

随机文库为全长96bp的单链DNA文库(核苷酸序列表S-SDZ No.2)：5′-CGTACG GTCGAC GCTAGC–N60-CAC GTG GAG CTC GGATCC-3′，N60为60个碱基的随机序列；上游引物(核苷酸序列表S-SDZ No.3)为5′-CGTACG GTC GAC GCTAGC-3′，下游引物(核苷酸序列表S-SDZNo.4)为5′-CAC GTG GAG CTC GGATCC-3′。

(3)SELEX筛选SDZ核酸适体的过程

①文库的变性：将溶解的上述ssDNA文库置于95℃水浴中放置10-20min；

②反筛：取磺胺间甲氧嘧啶修饰的琼脂糖磁珠，与变性的文库混合，室温孵育，反应完毕，离心，保留上层清液，得到反筛未结合文库；并且第一轮不做反筛；

③正筛：取SDZ修饰的琼脂糖磁珠加入上一步骤得到的反筛未结合文库，在室温孵育，反应完毕，离心并弃去上层清液，得到正筛未结合文库；

④洗提结合DNA：将上一步骤得到的正筛未结合文库用NaOH洗提6次；

⑤纯化洗提的DNA：用NAP-5寡核苷酸纯化柱子对NaOH洗提液进行回收纯化，以去除NaOH及其他杂质，得到的筛选产物DNA溶液即为筛选一轮的适体，一轮筛选完毕；

⑥以筛选适体DNA为模板，通过对称PCR、链酶亲和素琼脂糖珠等技术获得大量的DNA，为下一轮筛选做准备；

⑦重复上述步骤1-6,共筛选7轮；

(4)克隆测序

利用第7轮筛选产物通过无标记的上、下游引物进行PCR扩增，然后将PCR产物进行克隆，并随机挑选若干个克隆进行测序；最终选择的核酸适体为上述的核酸适体。

本发明还提供了一种含有上述核酸适体或上述核酸探针的dc-ELAA方法试剂盒。

本发明提供的核酸适体、核酸探针、或含有上述核酸适体、上述核酸探针dc-ELAA试剂盒的应用如下：

(1)鉴定鸡肉、鸡蛋样品中是否存在SDZ；

(2)测定鸡肉、鸡蛋样品中SDZ的浓度。

本发明还提供了一种检测鸡肉、鸡蛋样品中SDZ含量的dc-ELAA试剂盒，包括如下应用操作程序：

(1)平衡：从冷藏环境中取出的试剂及样品，应于室温(20-25℃)平衡约30min。

(2)配液：将PBS浓缩洗涤液用超纯水作20倍稀释成工作浓度洗涤液。

(3)准备酶标板：取96孔包被SAv酶标板，预设置空白、阴性、阳性对照各2孔。酶标板包被方法：取链霉亲和素(SAv)溶解于PBS中，37℃放置1小时。加入戊二酸溶液，混匀。4℃放置2小时，将反应液全量加至处理好的透析袋中，透析。将透析好的链霉亲和素戊二酸复合物用包被缓冲液液稀释1mg/mL,取稀释好的链霉亲和素戊二酸复合物加至酶标板，每孔200μL，混匀，37℃包被过夜。包被酶标板洗涤4次后备用。

(4)加样：将预处理25μL Biotin-SDZ aptamer探针、25μLSDZ-HRP、50μL不同浓度SDZ标准品混合均匀，37℃孵化60min，然后加入到洗涤后的酶标板的凹槽。37℃孵化45min。

(5)洗板：弃去反应液，洗涤3次，拍干。

(6)加底物：每孔再加入显色剂A1和A2各100mL避光显色30min。

(7)洗板：弃去反应液，洗涤3次，拍干。

(8)终止：每孔加50μl终止液，混匀。

(9)测定：10分钟内以酶标仪450nm双波长测定各孔OD值，绘制浓度-吸光度标准曲。

测试待检样品过程，重复上述步骤(1)-(9)：将预处理25μL Biotin-SDZ aptamer探针、25μLSDZ-HRP、50μL待测组织处理样品混合均匀，37℃孵化60min，然后加入到洗涤后的酶标板的凹槽。37℃孵化45min后，弃去反应液，洗涤3次，拍干后每孔再加入显色剂A1和A2各100mL避光显色30min，反应后，用酶标仪测溶液吸光度，与标准曲线比较，得到待测试样中SDZ的含量。

其中：所述SDZ检测试剂盒由如下组分构成：链霉亲和素SAv包被96孔或48孔酶标板1块，阴性对照1瓶，阳性对照1瓶，样品稀释液1瓶，Biotin-SDZ aptamer稀释液1瓶，SDZ-HRP稀释液1瓶，洗涤液1瓶，显色剂A1瓶，显色剂A2瓶，终止液1瓶，说明书1份，不干胶封片3片。

上述酶标板为透明聚苯乙烯96或48孔酶标板，且其各孔包被有浓度为1μg/mL的包被SAv，包被缓冲液为pH4.7～4.9磷酸盐缓冲液稀释；Biotin-SDZ aptamer稀释液为标记上了Biotin的SDZ核苷酸序列的溶液；SDZ-HRP稀释液为做了相适稀释的SDZ-HRP；显色体系为3，3，5，5-四甲基联苯胺(TMB)体系。阴性对照为SDZ标准品，浓度为100ng/mL；阳性对照为100ng/mL磺胺间甲氧嘧啶。

本发明的有益技术效果是：本发明提供的试剂盒及方法具有检测快速、稳定、简单等优点，制得的核酸适体对SDZ残留检测快速、灵敏度高、重复性好，特异性高，在食品安全快速检测中有广阔应用前景。

附图说明

图1：检测SDZ残留的Biotin-SDZ aptamer探针试剂盒及其应用原理；

图2：SDZ aptamer的特异性分析；

图3：利用不同浓度标准品所绘制dc-ELAA标准曲线图；

其中，图1中，aptamer的中文意思是适配体，Biotin的中文意思是生物素，Sulfadiazine(SDZ)的中文意思是磺胺嘧啶，Feed的中文意思是饲料喂养，Injection的中文意思是注射治疗。

图2中，1、SDZ，2、磺胺间甲氧嘧啶，3、磺胺对甲氧嘧啶，4、磺胺二甲氧嘧啶，5、磺胺二甲嘧啶，6、磺胺喹噁啉，7、磺胺甲氧嗪，8、磺胺甲噁唑。

具体实施方式

实施例1制备SDZ的核酸适体

(1)SDZ和磺胺间甲氧嘧啶与琼脂糖磁珠偶联

取10mg SDZ，首先溶于2mL的DMF中，待完全溶解后再加入2mL偶联缓冲液，接着按顺序在溶液中分别加入30mg的NHS(N-羟基硫代琥珀酰亚胺)和26mg的EDC[1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺，再将NHS和EDC完全溶解；溶液放置摇床中，4℃条件下反应15min，活化SDZ中的氨基；2mL氨基琼脂糖磁珠用偶联缓冲液洗涤3次后和上述活化的SDZ溶液混合，放置于摇床中室温条件下反应2h；反应完毕，将反应物用酸碱交替的缓冲溶液洗涤5次，再用PBS洗5次，最后置于PBS中4℃保存；相同的方法用于磺胺间甲氧嘧啶和氨基琼脂糖磁珠的偶联反应；

偶联缓冲溶液：磷酸盐缓冲溶液(0.1mmol/L PBS，Na₂HPO₄，8mmol/L；KH₂PO₄，2mmo1/L；NaCl，140mmol/L；KC1，10mmol/L；pH 7.2)；

酸性缓冲液：0.1M含0.5M NaCl的乙酸-乙酸钠缓冲液(pH＝4.0)；

碱性缓冲液：0.1M含0.5M NaCl的硼酸-四硼酸钠缓冲液(pH＝8.0)。

(2)单链DNA文库与相应引物

随机文库为全长96bp的单链DNA(ssDNA)文库(如核苷酸序列表S-SDZ No.2)：5′-CGT ACG GTC GAC GCT AGC–N60-CAC GTG GAG CTC GGA TCC-3′，两端各18个固定碱基序列，N60为60个碱基的随机序列；上游引物为(核苷酸序列表S-SDZ No.3)5′-CGT ACG GTCGAC GCT AGC-3′，下游引物为(核苷酸序列表S-SDZ No.4)5′-CAC GTG GAG CTC GGA TCC-3′；上游标记引物为5′-TITF-CGT ACG GTC GAC GCT AGC-3′，下游标记引物为5′-biotin-CAC GTG GAG CTC GGA TCC-3′。

(3)SELEX筛选SDZ核酸适体的过程

①文库的变性：将上述的ssDNA文库在离心机离心10min，然后加入0.5mL结合缓冲溶液(20mmol/L Tris-HCl，100mmol/L NaCl，2mmol/L MgCl₂，5mmol/L KC1，0.02％Tween20，l mg/mL酵母tRNA，pH 7.6)，于4℃放置2h使ssDNA完全溶解；溶解的ssDNA文库置于95℃水浴中放置10min，然后拿到室温自然冷却；

②反筛：取一定量的磺胺间甲氧嘧啶修饰的琼脂糖磁珠，用洗涤缓冲液(20mmol/LTris-HCl，100mmol/L NaCl，2mmol/L MgCl₂，5mmol/L KCl，0.02％Tween 20，pH7.6)洗三次；将上一步处理好的文库和洗涤过的磺胺间甲氧嘧啶饰的琼脂糖珠混合，室温下在150rpm转速的摇床中孵育50min；反应完毕，离心，保留上层清液，得到反筛未结合文库；第一轮不做反筛；

③正筛：取一定量的SDZ修饰的琼脂糖珠，用洗涤缓冲液洗三次；然后在琼脂糖磁珠中加入前一步骤得到的反筛未结合文库，摇匀后在室温下，160rpm转速的摇床中孵50min；反应完毕，离心并弃去上层清液，得到正筛未结合文库；

④洗提结合DNA：用洗涤缓冲液洗涤正筛后的SDZ修饰的琼脂糖磁珠3次，便去除未结合的DNA及结合能力弱的DNA；洗涤每次加入0.5mL洗涤缓冲液，室温摇动5min，然后离心，弃去上清；再用NaOH洗提2次，每次加0.25mL的2mol/L NaOH，置于95℃水浴中l0min，然后离心保留上清；共得到洗提液0.5mL；

⑤纯化洗提的DNA：将洗提得到的含DNA的NaOH溶液加入到寡核苷酸纯化柱子进行脱盐，然后收集0.5-1.5mL之间的滤液；得到的筛选产物DNA滤液即为筛选一轮的适体，一轮筛选完毕；

⑥以筛选产物DNA为模板，通过对称PCR、链酶亲和素琼脂糖磁珠等技术获得大量的DNA，为下一轮做准备；

⑦重复上述步骤1-6，进行反复的筛选，直至筛选完成。

通过7轮的筛选之后，文库中能与SDZ结合的DNA已达到饱和。

(4)克隆测序

利用第7轮筛选产物通过无标记的上、下游引物进行PCR扩增，然后将PCR产物进行克隆，随机挑选若干个克隆进行测序。

实施例2平衡解离常数的测定试验

合成测序得到的核酸适配体，用荧光方法测定其平衡解离常数Kd。将合成的5'-FAM标记的核酸适体用结合缓冲液配置成不同浓度梯度溶液(0.05，0.1，0.2，0.4，0.8，0.16，0.32和0.64μmol/L)取10μLSDZ修饰的琼脂糖珠，将200μL不同浓度梯度的5'-FAM标记的核酸适体和10μLSDZ修饰的琼脂糖珠混合，室温孵育反应30min，离心分离弃去未结合DNA；再将琼脂糖磁珠用结合缓冲液洗涤3次，每次用200μL结合缓冲液；再在95℃用100μL的2mol/L NaOH溶液洗提和SDZ结合的DNA，洗提2次，共得200μL洗提液；将不同的洗提液稀释相同的倍数，然后置于96孔黑色荧光测定板，用酶标仪测定荧光强度；荧光强度对核酸适体的浓度作图，通过方程式Y＝B max X/(Kd+X)拟合出SDZ适配体的解离常数。实验测定的Kd结果发现，筛选得到的适配体与SDZ的亲和力较高，Kd最低，为0.16μmol，拟合曲线的R²＝0.9746，说明拟合良好。由SDZ酸适体的Kd值可知，SDZ和核酸适体的结合能力较强。由于解离常数越低，亲和力越高，因此，选择该适配体进行下一步特异性研究。

实施例3适配体特异性试验

取SDZ、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺甲氧嗪和磺胺甲噁唑标准储备液，用结合缓冲液稀释至终浓度5μmol/L。取5μg核酸适配体溶解于100μL结合缓冲液中，95℃变性再迅速置于冰上10min,然后置室温5min。取配制好的上述SDZ等标准品溶液100μL至预处理好的核酸适配体溶液中，37℃孵化30min。然后将上述混合溶液加入SDZ-琼脂糖磁珠偶联物，37℃孵化30min。取出孵化后的上清，用NanoDrop测定上清中的ssDNA的浓度。参考组选用不含药物的结合缓冲液与预处理好的核酸适配体孵育(操作同步骤上述)，再将此孵化液加至DZ-琼脂糖磁珠偶联物，37℃孵化30min。最后取出孵化后的上清，用NanoDrop测定上清中的ssDNA的浓度，每个实验重复3次。

结果如图2所示，适配体对SDZ的特异性很高，对结构类似物(磺胺间甲氧嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺甲氧嗪和磺胺甲噁唑)均无结合。将结果进行T检验，发现核酸适配体对于SDZ的比值与其他7种药物的比值的差异显著(P<0.05，进一步证明了该结果的准确性。使用随机文库作为对照组，结果表明随机文库对这7种药物均无结合。

实施例4基于SDZ残留dc-ELAA检测方法的建立

(1)取链霉亲和素(SAv)溶解于PBS中，37℃放置1小时。加入戊二酸溶液，混匀。4℃放置2小时，将反应液全量加至处理好的透析袋中，透析。将透析好的链霉亲和素戊二酸复合物用包被缓冲液液稀释1mg/mL,取稀释好的链霉亲和素戊二酸复合物加至酶标板，每孔200μL，混匀，37℃包被过夜。包被酶标板洗涤4次后备用。

(2)将预处理25μL Biotin-SDZ aptamer探针、25μLSDZ-HRP、50μL不同浓度的SDZ溶液(用PBS将标准品稀释成不同浓度：0,0.03,0.1,0.3,1,3,10,30和100μg/L)标准品混合均匀，37℃孵化60min，然后加入到洗涤后的酶标板的凹槽。37℃孵化45minn后，弃去反应液，洗涤3次，拍干后每孔再加入显色剂A1和A2各100mL避光显色30min，反应后，用酶标仪测溶液吸光度，绘制标准曲线；

(3)测试待检样品过程，重复上述步骤(2)：将预处理25μL Biotin-SDZ aptamer探针、25μLSDZ-HRP、50μL待测组织处理样品混合均匀，37℃孵化60min，然后加入到洗涤后的酶标板的凹槽。37℃孵化45min后，弃去反应液，洗涤3次，拍干后每孔再显色剂A1和A2各100mL避光显色30min，反应后，用酶标仪测溶液吸光度，与标准曲线比较，得到待测试样中SDZ的含量。

标准曲线如图2所示。以不同浓度标准品与空白标准品相对光密度值的百分率(B/B0％)为纵坐标，以标准品不同浓度的常用对数值作为横坐标，绘制检测试纸条的标准曲线，求回归方程，进行相关回归分析，标准曲线结果见图3。通过对检测限值进行统计学分析，确定传感探针的检测限。通过计算得到最低检测线为：0.12ng/mL，标准曲线灵敏度(IC₅₀)为：3.2ng/mL。

实施例5基于SDZ残留检测的Biotin-SDZ aptamer探针试剂盒的组装

SDZ检测试剂盒的构成：链霉亲和素SAv包被96孔或48孔酶标板1块，阴性对照1瓶，阳性对照1瓶，样品稀释液1瓶，Biotin-SDZ aptamer稀释液1瓶，SDZ-HRP稀释液1瓶，洗涤液1瓶，显色剂A1瓶，显色剂A2瓶，终止液1瓶，说明书1份，不干胶封片3片。

Biotin-SDZ aptamer的制备：Biotin-SDZ aptamer序列如下：5′-Biotin-CGT ACGGTC GAC GCT AGC TTG GCC ATC TTG GCC GGG ATA AGG ATC CAG CCG TTG TAG ATT TGCGGT AGG GAA ACG TAT CAC GTG GAG CTC GGA TCC-3′。以上Biotin-SDZ aptamer由重庆若丰生物科技有限公司合成。Biotin-SDZ aptamer使用浓度为20nM。

SDZ-HRP稀释液的配制：SDZ-HRP由重庆师范大学食品质量与安全快速检测协同创新中心制备，浓度为1:2000稀释。

显色剂A1为：柠檬酸钠44.82克，柠檬酸3.2克，30％H₂O₂0.6mL，超纯水定容至1000mL。

显色剂A2为：TMB 0.4克，柠檬酸1.9克，乙二胺四乙酸钠0.6g，丙三醇100mL，超纯水定容至1000mL。

终止液：浓硫酸56mL，超纯水定容至1000mL。

本发明的SDZ检测试剂盒的应用及操作程序：

(4)加样：将预处理25μL Biotin-SDZ aptamer探针、25μLSDZ-HRP、50μL不同浓度SDZ标准品混合均匀，37℃孵化30min，然后加入到洗涤后的酶标板的凹槽。37℃孵化45min。

(5)洗板：弃去反应液，洗涤3次，拍干。

(6)加底物：每孔再加入显色剂A1和A2各100mL避光显色30min。

(7)洗板：弃去反应液，洗涤3次，拍干。

(8)终止：每孔加50μl终止液，混匀。

实施例6试剂盒的特异性试验

用SDZ残留检测dc-ELAA方法分别检测系列浓度的SDZ，并绘制竞争抑制标准曲线，根据标准曲线计算SDZ的IC₅₀值。同样，计算其它磺胺类药物(磺胺间甲氧嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺甲氧嗪和磺胺甲噁唑)的IC₅₀值。以SDZ的交叉反应率为100％，计算与其它磺胺类药物的交叉反应率。同时用SDZ残留检测dc-ELAA方法分别检测浓度1000ng/mL的其它药物，如磺胺间甲氧嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺甲氧嗪和磺胺甲噁唑。确定SDZ残留检测dc-ELAA方法的特异性。

根据标准曲线计算SDZ的IC₅₀值为3.2ng/mL。以磺胺间甲氧嘧啶的交叉反应率为100％，其它磺胺类药物的交叉反应率见表1。

表1 dc-ELAA方法与磺胺类药物的交叉反应率

结果表明dc-ELAA方法与磺胺间甲氧嘧啶(0.8％)、磺胺对甲氧嘧啶(0.5)、磺胺二甲氧嘧啶(0.3)交叉反应率很低，与磺胺二甲基嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺甲氧嗪和磺胺甲噁唑的交叉反应＜0.1％。说明dc-ELAA方法具有好的特异性。

实施例7试剂盒添加回收试验

向经高效液相色谱法检测不含SDZ的空白样品(鸡肉、鸡肝和鸡蛋)中，使其SDZ含量分别为5ng/g、10ng/g、50ng/g，每个滴度设5个重复，样品经预处理后，用dc-ELAA检测方法进行检测，根据标准曲线计算SDZ含量及其回收率。

结果见表2。结果表明，SDZ在不同样品中回收率在77.4-115.5％范围内，变异系数均小于15％。

表2 SDZ在动物源性食品中的回收率

SEQUENCE LISTING

<110> 重庆师范大学

<120> 基于核酸适配体特异性检测磺胺嘧啶的生物传感探针试剂盒及其应用

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 96

<212> DNA

<213> S-SDZ No.1

<220>

<221> misc_feature

<400> 1

cgtacggtcg acgctagctt ggccatcttg gccgggataa ggatccagcc gttgtagatt 60

tgcggtaggg aaacgtatca cgtggagctc ggatcc 96

<210> 2

<211> 96

<212> DNA

<213> S-SDZ No.2

<220>

<221> misc_feature

<222> (19)..(53)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 2

cgtacggtcg acgctagcnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60

nnnnnnnnnn nnnnnnnnca cgtggagctc ggatcc 96

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> S-SDZ No.3

<220>

<221> misc_feature

<400> 3

cgtacggtcg acgctagc 18

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> S-SDZ No.4

<220>

<221> misc_feature

<400> 4

cacgtggagc tcggatcc 18

Claims

1.一种生物素标记磺胺嘧啶核苷酸适配体，其特征在于其特征在于：所述生物素标记磺胺嘧啶核苷酸适配体包括探针；所述探针的核苷酸序列为S-SDZ No.1。

2.根据权利要求1所述的生物素标记磺胺嘧啶核苷酸适配体，其特征在于：所述生物素标记磺胺嘧啶核苷酸适配体由单链DNA组成，且3'末端或5'末端标标记有生物素。

3.根据权利要求1所述的生物素标记磺胺嘧啶核苷酸适配体，其特征在于：所述生物素标记磺胺嘧啶核苷酸适配体的制备方法包括如下步骤：

1)将磺胺嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶分别和羧基琼脂糖磁珠偶联；分别将磺胺嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶经活化氨基后，取羧基琼脂糖磁珠与活化的磺胺嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶溶液混合，进行偶联反应；分别获得磺胺嘧啶修饰的琼脂糖磁珠偶联物、磺胺间甲氧嘧啶修饰的琼脂糖磁珠偶联物；

2)单链DNA文库与相应引物准备：随机文库为全长96bp的单链DNA文库的核苷酸序列为S-SDZ No.2，其中，N60为60个碱基的随机序列；上游引物的核苷酸序列为S-SDZ No.3，下游引物的核苷酸序列为S-SDZ No.4；

3)SELEX筛选磺胺嘧啶核酸适体；

4)克隆测序获得生物素标记磺胺嘧啶核苷酸适配体。

4.根据权利要求3所述的生物素标记磺胺嘧啶核苷酸适配体，其特征在于：所述SELEX筛选磺胺嘧啶核酸适体的步骤为：

1)文库变性：将溶解的上述ssDNA文库置于95℃水浴中放置10-20min；

2)反筛：取磺胺间甲氧嘧啶修饰的琼脂糖磁珠偶联物，与变性的文库混合，室温孵育，反应完毕，离心，保留上层清液，得到反筛未结合文库；并且第一轮不做反筛；

3)正筛：取磺胺嘧啶修饰的琼脂糖磁珠偶联物加入上一步骤得到的反筛未结合文库，在室温孵育，反应完毕，离心并弃去上层清液，得到正筛未结合文库；

4)洗提结合DNA：将上一步骤得到的正筛未结合文库用NaOH洗提6次；

5)纯化洗提的DNA：用NAP-5寡核苷酸纯化柱子对NaOH洗提液进行回收纯化，以去除NaOH及其他杂质，得到的筛选产物DNA溶液即为筛选一轮的适体，一轮筛选完毕；

6)以筛选适体DNA为模板，通过对称PCR、链酶亲和素琼脂糖珠等技术获得大量的DNA，为下一轮筛选做准备；

7)重复上述步骤1-6，共筛选7轮。

5.根据权利要求4所述的的基于核酸适配体特异性检测磺胺嘧啶的生物传感探针试剂盒，其特征在于：所述克隆测序获得生物素标记磺胺嘧啶核苷酸适配体为：利用权利要求4所述的第7轮筛选产物通过无标记的上、下游引物进行PCR扩增，然后将PCR产物进行克隆，并随机挑选若干个克隆进行测序；最终选择的核酸适体为生物素标记磺胺嘧啶核苷酸适配体。

6.一种基于核酸适配体特异性检测磺胺嘧啶的生物传感探针试剂盒，其特征在于：包括生物素标记磺胺嘧啶核苷酸适配体的稀释液和辣根过氧化物酶标记磺胺嘧啶亲和素稀释液。

7.基于核酸适配体特异性检测磺胺嘧啶的生物传感探针试剂盒的使用方法，其特征在于：包括如下步骤：

1)取链霉亲和素溶解于PBS中，37℃放置1小时。加入戊二酸溶液，混匀；4℃放置2小时，将反应液全量加至处理好的透析袋中，透析；将透析好的链霉亲和素戊二酸复合物用包被缓冲液液稀释1mg/mL,取稀释好的链霉亲和素戊二酸复合物加至酶标板，每孔200μL，混匀，37℃包被过夜；包被酶标板洗涤4次后备用；

2)将预处理25μL生物素标记磺胺嘧啶核苷酸适配体探针、25μL磺胺嘧啶-辣根过氧化物酶、50μL不同浓度磺胺嘧啶标准品混合均匀，37℃孵化60min，然后加入到洗涤后的酶标板的凹槽；37℃孵化45min后，弃去反应液，洗涤3次，拍干后每孔再加入显色剂A1和A2各100mL避光显色30min，反应后，用酶标仪测溶液吸光度，绘制浓度-吸光度标准曲线；

3)测试待检样品过程，重复上述步骤2)：将预处理25μL生物素标记磺胺嘧啶核苷酸适配体探针、25μL磺胺嘧啶-辣根过氧化物酶、50μL待测组织处理样品混合均匀，37℃孵化60min，然后加入到洗涤后的酶标板的凹槽；37℃孵化45min后，弃去反应液，洗涤3次，拍干后每孔再加入显色剂A1和A2各100mL避光显色30min，反应后，用酶标仪测溶液吸光度，与标准曲线比较，得到待测试样中磺胺嘧啶的含量。

8.基于核酸适配体特异性检测磺胺嘧啶的生物传感探针试剂盒在鸡肉、鸡肝和鸡蛋等动物源性组织测试样品中磺胺嘧啶的定性检测的应用。

9.基于核酸适配体特异性检测磺胺嘧啶的生物传感探针试剂盒在鸡肉、鸡肝和鸡蛋等动物源性组织测试样品中磺胺嘧啶的定量检测的应用。