CN103674935B - 一种基于杂交链式反应信号放大技术测定赤霉素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于杂交链式反应信号放大技术测定赤霉素的方法，其特征是将赤霉素抗体固定在羧基化磁珠上，在目标物赤霉素存在时，磁珠上赤霉素抗体、胶体金上的赤霉素抗体与赤霉素之间形成夹心式免疫复合体，加入富含G碱基的H1和H2，在胶体金上的DNA1激发杂交链式反应，从而在免疫复合物上形成富含G碱基的DNA长链，在化学发光试剂3,4,5-三甲氧基苯甲酰甲醛的作用下产生化学发光，根据化学发光实现赤霉素的测定。该方法具有高灵敏度，高选择性，低成本，操作简单等特点。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于杂交链式反应信号放大技术测定赤霉素的方法。
背景技术
赤霉素（GA,2,4α,7-三羟基-1-甲基-8-亚甲基赤霉-3-烯-1,10-二羧酸-1,4α-内酯）是普遍存在于高等植物中的一种植物激素，参与调节植物生长发育的多种生理过程，如促进细胞分裂、植株矮化等，现广泛应用于水果、蔬菜的增产、增效等方面。目前我国对赤霉素的最高残留限量未做出规定，但美国、日本等国家规定其在水果、蔬菜中的最高残留限量为0.2mg/kg（赵瑛博,周艳明,忻雪,王岩松.食品科学,2011,32(06):209；吕保英.食品分析大全.北京:高等教育出版社,1997:723）。测定赤霉素的方法主要有荧光光谱法（中华人民共和国浙江进出口商品检验局.SN0350—1995.出口水果中赤霉素残留量的检测方法.北京:中国进出口商品检验局,1998）、酶联免疫法（袁琳.外源赤霉素GA3对大豆光合作用的促进和叶片内源赤霉素GA1+3水平.植物生理与分子生物学学报,2008,28(4):317）、气相色谱法（许庆琴,范哲峰.大口径毛细管气象色谱法快速测定植物组织中的赤霉素.分析科学学报,2000,6:524）、毛细管电泳-质谱（GeLiya,PenCYC,YongJWHet.al..Analysesofgibberellinsbycapillaryelectrophoresis-massspectrometrycombinedwithsolid-phaseextraction[J].JournalofChromatographyA,2007,1159(1/2):242）、毛细管电泳-激光诱导荧光（ChenH,GuoXF,ZhangHS,WangH.Simultaneousdeterminationofphytohormonescontainingcarboxylincrudeextractsoffruitsamplesbasedonchemicalderivatizationbycapillaryelectrophoresiswithlaser-inducedfluorescencedetection.JournalofChromatographyB.2011,879(20):1802）和液相色谱法（周艳明,汤媛,牛森.高效液相色谱法检测草莓中赤霉素残留量的研究.食品工业科技,2009,1:311）等。
这些方法中有些前处理方法太过繁琐，有些方法灵敏度较低。本发明利用纳米金为标记物和磁珠为载体，以杂交链式反应为信号放大技术，实现植物赤霉素的测定，具有方法简单、成本低、灵敏度高的优点。
发明内容
本发明旨在发明一种方法简单、成本低、灵敏度高、选择性高的测定赤霉素的方法。
实现发明目的技术方案是：
一种基于杂交链式反应信号放大技术测定赤霉素的方法，其特征是将赤霉素抗体固定在羧基化磁珠上，在目标物赤霉素存在时，磁珠上赤霉素抗体、胶体金上的赤霉素抗体与GA之间形成夹层式免疫复合体，加入富含G碱基的H1和H2，在胶体金上的DNA1激发杂交链式反应，从而在免疫复合物上形成富含G碱基的DNA长链，在化学发光试剂3,4,5-三甲氧基苯甲酰甲醛（TMPG）的作用下产生化学发光，根据化学发光实现GA的测定。
测定步骤为：
（1）抗体标记磁珠的制备
将0.2mL10mg/mL的羧基化磁珠加入到一小离心管中，用0.4mL0.1M咪唑–HCl缓冲溶液中洗三遍。然后用咪唑–HCl缓冲溶液分散成0.4mL的溶液，再将0.4mL0.25MNHS和0.5MEDC加入该小试管中，在37℃下培养30分钟。然后用0.4mL0.1M的磷酸盐缓冲液（pH=7.4）清洗三遍，再用0.4mL0.1M的磷酸盐缓冲液分散成溶液。将得到的抗体标记磁珠存放在4℃的环境中备用。
(2)抗体和DNA1标记胶体金的制备
首先将5μL10mM的TCEP加入100μL10-6MDNA1溶液中，37℃下培养30分钟，得TCEP活化过的100μL10-6MDNA1溶液。
再将200μL2mg/mL的GA抗体加入到粒径为20nm的1.0mL胶体金（AuNP）溶液中,在室温下培养30分钟。然后，再加入用TCEP活化过的100μL10-6MDNA1溶液。在室温下轻摇16小时后，得抗体和DNA1标记胶体金溶液。再用2.0mL0.1M的磷酸缓冲液（pH=7.4）洗涤三次。并用2.0mL磷酸盐缓冲液进行悬浮处理，并在4℃环境下保存。
（3）水果和蔬菜样品制备过程
将样本切碎、混合，研磨得到均匀的混合物。然后，取10g均匀的混合物放在100mL的锥形瓶中。在锥形瓶中加入25mL乙醇溶液后，将样品进行超声波处理10分钟。再将混合物用孔径为0.45μm的微孔膜过滤。
(4)分析测定
本发明所使用的化学发光测定原理如在图1所示。首先将样品或标准溶液与抗体标记磁珠混合，反应5-30分钟，进行磁分离后，用50μLPBST缓冲液洗涤两遍，并将其悬浮在50μL的PBS溶液中。然后，加入5-20μL抗体和DNA1标记胶体金，在室温下反应30分钟后进行磁分离，并且使用50μLPBST缓冲液洗涤三次。然后加入20μL含0.5μM的H1和H2的混合溶液进行杂交链式反应，在室温下反应10-70分钟后，再用50μLPBST溶液洗涤三遍。然后使其悬浮于40μL磷酸缓冲溶液中。将得到的溶液进行化学发光（hv）检测。
（5）化学发光检测
使用IFFS-E型多功能化学发光检测仪进行化学发光检测。将一个2mL的小玻璃瓶放在化学发光检测仪的光电倍增管暗箱中。然后向小玻璃瓶中加入10μLpH为8.5的四丁基氢氧化铵-磷酸盐缓冲液。接着再加入步骤（4）所得的溶液10μL。再用注射器从光电倍增管顶端小孔中注入100μL30mM的TMPG溶液，引发化学发光反应，根据化学发光强度对样品或标准溶液的浓度进行定量测定。
所述的3,4,5-三甲氧基苯甲酰甲醛（TMPG）按照已报道的方法合成（Kojima,E.;Ohba,Y.;Kai,M.;Ohkura,Y.Anal.Chim.Acta1993,280,157-162）。
所述的三(2-羰基乙基)磷盐酸盐（TCEP，98%），3-吲哚乙酸（IAA）、赤霉素（GA）、细胞分裂素（Kt）和脱落酸（ABA）购于阿法埃莎公司。
所述的赤霉素抗体（Ab）从美国纽约CreativeBiomart公司购买。
所述的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（DEC）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）和牛血清白蛋白（BSA）是从Sigma公司购买的。
所述的羧基化磁珠（粒径为0.4-0.6μm，浓度为8-12mg/mL）（MB）购买于天津市倍思乐色谱技术开发中心。
所述其他化学试剂从国药集团化学试剂有限公司购买。
所有使用的化学用品都是化学纯，所有的溶剂都用二次去离子水离子配置。
在一升水中溶解0.13gKH2PO4和1.93gNa2HPO4获得0.1MpH7.4的磷酸缓冲液。
将0.2gKH2PO4、2.9gNa2HPO4·12H2O,8.0gNaCl和0.2gKCl溶解于一升水中，得到0.15MpH为7.4的磷酸盐缓冲溶液（PBS）。
在磷酸缓冲溶液中加入Tween-20，使Tween-20的体积比为0.05%得PBST溶液。
咪唑-HCl缓冲液：咪唑6.8g，加水约600mL水中，然后用1M盐酸调节pH至7.4，最后加蒸馏水至1升。
四丁基氢氧化铵-磷酸盐缓冲液：取质量浓度10％四丁基氢氧化铵溶液26.4mL，加水800mL后，用lM磷酸溶液调节pH值至8.5，再用水稀释至1升。
DNA从北京赛百盛基因技术有限公司获得。它们的核苷酸序列如下：
DNA1,5’-SH-CCCCAACTCCTCCCAAAAAAAAAAACAAAGTAGTCGAGGCCC-3’；
H1,5’-AGTCGAGGCCCCGGCGTGGGTTAACACGCCGGGGCCTCGACTACTTTG-3’；
H2,5’-TTAACCCACGCCGGGGCCTCGACTCAAAGTAGTCGAGGCCCCGGCGTG-3’。
化学发光强度检测使用IFFS-E多功能化学发光分析仪（西安瑞迈分析仪器有限公司）。TGL-16G型离心机（上海安亭科学仪器有限公司）用于离心分离。
测定时优选使用10μL抗体修饰磁珠，抗体和DNA1修饰胶体金的用量优选为20μL，样品或标准溶液与抗体标记磁珠混合反应时间优选为30分钟，优选70分钟作为杂交链反应时间。
附图说明
图1基于抗体-抗原相互作用和HCR信号放大技术测定GA原理示意图。
图2（A）抗体修饰磁珠用量对化学发光强度的影响；
（B）抗体修饰磁珠用量对化学发光强度的影响；
（C）样品或标准溶液与抗体标记磁珠反应时间对化学发光强度的影响；
（D）杂交链式反应时间对化学发光强度的影响。
图3GA标准曲线
横坐标是GA浓度，单位是ng/mL，纵坐标ICL是体系的化学发光强度；
插图为GA浓度与化学发光强度的线性关系图。
图4不同植物激素的化学发光检测结果
IAA，ABA和Kt的浓度各为100.0ng/mL，GA的浓度为1.0ng/mL。
发明的优点与效果
本发明基于抗体-抗原的相互作用和杂交链式反应（HCR）信号放大技术实现GA的高灵敏度测定。赤霉素抗体被固定在羧基化磁珠上，并利用赤霉素抗体和DNA1标记胶体金作为标记物利用三明治夹心法实现GA的测定。在目标物GA存在时，磁珠上赤霉素抗体、胶体金上的赤霉素抗体与GA之间会形成夹心式免疫复合体。这时加入富含G碱基的H1和H1，在胶体金上的DNA1激发杂交链式反应，从而在免疫复合物上形成富含G碱基的DNA长链。在化学发光试剂TMPG的作用下产生化学发光，根据化学发光实现GA的测定。
目标物植物激素GA的浓度在0.01ng/mL到70.0ng/mL范围内，得到了浓度与化学发光强度的非线性函数关系式。非线性函数关系式为：ICL=-1297.18*exp(-C/0.85)-5821.67*exp(-C/20.95)+7111.00（ICL是化学发光强度，C是赤霉素浓度，单位：ng/mL，n=7,R2=0.9995）。
目标物植物激素GA的浓度在0.03ng/mL~1.0ng/mL范围变化时，得到了浓度与化学发光强度的线性函数关系式。线性函数关系方程式为ICL=1233.69C+28.67（n=7,R2=0.999)。检测限为0.01ng/mL。方法具有高灵敏度，低成本，操作简单等特点。
当利用其它相应的抗体时，这种检测技术还可以测量其他分析物，因此，这样一种简便的技术将会变成一种新的化学发光传感器。这种传感器具有高灵敏度和选择性的特点。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步说明本发明，但不构成对发明的进一步限制。
实施例1-6为赤霉素标准样品条件优选试验，实例7为实际样品测试和加标准样回收试验。
实施例1抗体修饰磁珠用量对化学发光强度的影响
按照技术方案进行抗体修饰磁珠的用量对化学发光强度的影响试验，试验结果如图2（A）所示，当抗体修饰磁珠的用量从2μL增加到10μL时化学发光强度逐渐增强。再增大抗体修饰磁珠的用量，化学发光强度缓慢减弱，故本发明优选使用10μL抗体修饰磁珠。
实施例2抗体和DNA1修饰胶体金用量对化学发光强度的影响
进行抗体和DNA1修饰胶体金的用量对化学发光强度的影响程度试验，当抗体修饰磁珠的用量保持在10μL时，抗体和DNA1修饰胶体金的用量从5μL增加到15μL时，化学发光强度不断增加。继续增加抗体和DNA1修饰胶体金的用量，化学发光强度逐渐增大，最终在20μL时化学发光强度达到最大值，然后，就一直保持在这个水平，几乎不变，试验结果如图2（B）。这是因为当抗体和DNA1修饰胶体金的量为20μL时，反应就达到饱和。因此，20μL就是抗体和DNA1修饰胶体金的最适宜用量。因此，本发明抗体和DNA1修饰胶体金的用量优选为20μL。
实施例3标准溶液与抗体标记磁珠反应时间对化学发光强度的影响
在标准溶液与抗体标记磁珠反应从5分钟到30分钟之间变化时，化学发光强度急剧增强，随后，趋于平稳，结果如图2（C）所示。再继续增加反应时间并不会引起化学发光强度的显著增强。因此，本发明样品与抗体标记磁珠反应时间优选为30分钟。
实施例4杂交链式反应时间对化学发光强度的影响
当杂交链式反应时间从10分钟到70分钟变化时，化学发光强度迅速增强，随后几乎保持不变。试验结果如图2（D），表明在70分钟后，引发剂DNA1的识别结束，H1与H2的杂交放大效果趋于最大。因此，本发明优选70分钟作为杂交链反应时间。
实施例5方法灵敏度试验
考察了方法测定的灵敏度和线性范围等分析特性。在优选的试验条件下，目标物植物激素GA的浓度在0.01ng/mL到70.0ng/mL范围内，得到了浓度与化学发光强度的非线性函数关系式。非线性函数关系式为：ICL=-1297.18*exp(-C/0.85)-5821.67*exp(-C/20.95)+7111.00（ICL是化学发光强度，C是赤霉素（GA）的浓度，单位：ng/mL，n=7,R2=0.9995）。目标物植物激素GA的浓度在0.03ng/mL~1.0ng/mL范围变化时，得到了浓度与化学发光强度的线性函数关系式。线性函数关系方程式为ICL=1233.69C+28.67（n=7,R2=0.999)。检测限为0.01ng/mL。
实施例6方法的选择性试验
方法的特异性是检测技术具有实用性的最主要的要求。为评估检测GA方法的特异性，实验选择了相关植物激素如IAA，Kt和ABA等考察了对GA测定的干扰情况。根据实验结果显示，在相同实验条件下进行检测时，浓度为100.0ng/mL的IAA，Kt和ABA对1.0ng/mL的GA没有显著的影响（如图3）。这表明该方法有很好的选择性，可以选择性的识别GA。这种选择性归因于GA抗原和抗体的特异性结合。而GA抗体并不会和IAA，Kt和ABA等发生特异性结合。
实施例7实际样品中GA含量的测定
使用建立的方法测定了从市场购买的新鲜水果和蔬菜中GA的含量。测得的GA的浓度如表1所示。并通过回收实验考察了方法的准确度与精密度，回收率在96.0%-102.0%之间。
表1实际样品中GA含量的测定结果
| 编号 | 含量 | 标准加入量a | 测得量a | 相对标准偏差 | 回收率 |
| 1 | 23.6 | 20.0 | 43.1 | 5.3% | 97.5% |
| 2 | 3.6 | 5.0 | 8.4 | 4.2% | 96.0% |
| 3 | 2.4 | 5.0 | 7.5 | 4.7% | 102.0% |
| 4 | 1.7 | 1.0 | 2.7 | 3.9% | 100.0% |
a单位：ng/mL。
Claims (4)
1.一种基于杂交链式反应信号放大技术测定赤霉素的方法，其特征是将赤霉素抗体固定在羧基化磁珠上，在目标物赤霉素存在时，磁珠上赤霉素抗体、胶体金上的赤霉素抗体与赤霉素之间形成夹心式免疫复合体，加入富含G碱基的H1和H2，在胶体金上的DNA1激发杂交链式反应，从而在免疫复合物上形成富含G碱基的DNA长链，在化学发光试剂3,4,5-三甲氧基苯甲酰甲醛的作用下产生化学发光，根据化学发光实现赤霉素的测定，测定步骤为：
(1)抗体标记磁珠的制备
将0.2mL10mg/mL的羧基化磁珠加入到一小离心管中，用0.4mL0.1M咪唑–HCl缓冲溶液洗三遍；然后用咪唑–HCl缓冲溶液分散成0.4mL的溶液，再将0.4mL0.25MN-羟基琥珀酰亚胺和0.5M1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐加入该小离心管中，在37℃下培养30分钟；然后用0.4mL0.1MpH＝7.4的磷酸盐缓冲液清洗三遍，再用0.4mL0.1M的磷酸盐缓冲液分散成溶液，将得到的抗体标记磁珠存放在4℃的环境中备用；
(2)抗体和DNA1标记胶体金的制备
首先将5μL10mM的三(2-羰基乙基)磷盐酸盐加入100μL10-6MDNA1溶液中，37℃下培养30分钟，得三(2-羰基乙基)磷盐酸盐活化过的100μL10-6MDNA1溶液；再将200μL2mg/mL的GA抗体加入到粒径为20nm的1.0mL胶体金溶液中,在室温下培养30分钟，再加入用TCEP活化过的100μL10-6MDNA1溶液，在室温下轻摇16小时后，得抗体和DNA1标记胶体金溶液；再用2.0mL0.1MpH＝7.4的磷酸缓冲液洗涤三次，并用2.0mL磷酸盐缓冲液进行悬浮处理，并在4℃环境下保存；
(3)水果和蔬菜样品制备过程
将样本切碎、混合，研磨得到均匀的混合物，然后，取10g均匀的混合物放在100mL的锥形瓶中，在锥形瓶中加入25mL乙醇溶液后，将样品进行超声波处理10分钟，再将经超声波处理后的样品用孔径为0.45μm的微孔膜过滤；
(4)分析测定
首先将微孔膜过滤后的样品或标准溶液与抗体标记磁珠混合，反应5-30分钟，再进行磁分离后，用50μLPBST缓冲液洗涤两遍，并将其悬浮在50μL的磷酸盐缓冲溶液中；然后，加入5-20μL抗体和DNA1标记胶体金，在室温下反应30分钟后进行磁分离，并且使用50μLPBST缓冲液洗涤三次；然后加入20μL含0.5μM的H1和H2的混合溶液进行杂交链式反应，在室温下反应10-70分钟后，再用50μLPBST溶液洗涤三遍，然后使其悬浮于40μL磷酸缓冲溶液中，将得到的溶液进行化学发光检测；
(5)化学发光检测
使用IFFS-E型多功能化学发光检测仪进行化学发光检测，将一个2mL的小玻璃瓶放在化学发光检测仪的光电倍增管暗箱中，然后向小玻璃瓶中加入10μLpH为8.5的四丁基氢氧化铵-磷酸盐缓冲液，接着再加入步骤(4)所得的溶液10μL；再用注射器从光电倍增管顶端小孔中注入100μL30mM的3,4,5-三甲氧基苯甲酰甲醛溶液，引发化学发光反应，根据化学发光强度对样品或标准溶液的浓度进行定量测定；
所述的DNA1、H1和H2的核苷酸序列如下：
DNA1,5’-SH-CCCCAACTCCTCCCAAAAAAAAAAACAAAGTAGTCGAGGCCC-3’；
H1,5’-AGTCGAGGCCCCGGCGTGGGTTAACACGCCGGGGCCTCGACTACTTTG-3’；
H2,5’-TTAACCCACGCCGGGGCCTCGACTCAAAGTAGTCGAGGCCCCGGCGTG-3’；
分析测定时使用10μL抗体修饰磁珠，抗体和DNA1修饰胶体金用量为20μL，样品或标准溶液与抗体标记磁珠混合反应时间为30分钟，杂交链反应时间为70分钟。
2.根据权利要求1的测定赤霉素的方法，其特征在于所述的羧基化磁珠粒径为0.4-0.6μm，浓度为8-12mg/mL。
3.根据权利要求1的测定赤霉素的方法，其特征在于所有使用的化学用品都是化学纯，所有的溶剂都用二次去离子水配置。
4.根据权利要求1的测定赤霉素的方法，其特征在于PBST溶液是在磷酸缓冲溶液中加入Tween-20，使Tween-20的体积比为0.05％得到的溶液。
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2013
- 2013-12-05 CN CN201310655870.8A patent/CN103674935B/zh active Active
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
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