CN103383354B - 一种检测肠毒素sea的磁微粒化学发光试剂盒的检测方法 - Google Patents

Abstract

一种检测肠毒素SEA的磁微粒化学发光试剂盒及其检测方法，属于食品安全检测技术领域。提供了一种从食品、制剂中快速检测肠毒素SEA（金黄色葡萄球菌肠毒素A）的磁微粒化学发光方法。其工艺步骤为：标准品稀释后加入标记物，混匀，温浴，沉淀，清洗，加入发光底物，测定化学发光强度，绘制标准曲线，被测样品的OD值在标准曲线之间。优点在于：操作简便，快速，灵敏度高，特异性强，费用低廉。

Description

一种检测肠毒素SEA的磁微粒化学发光试剂盒的检测方法

技术领域

本发明属于食品安全检测技术领域，提供了一种从食品、制剂中快速检测肠毒素SEA(金黄色葡萄球菌肠毒素A)的磁微粒化学发光的方法，本方法中采用双单克隆抗体夹心法组建磁微粒化学发光试剂盒，该方法与传统的方法比较具有适用领域宽广、用时短、特异性强、灵敏度高等特点，对食品及其他领域的应用具有十分重要的意义及实际应用价值。

背景技术

本发明涉及针对SEA专一性磁微粒化学发光免疫试剂盒，双单克隆抗体夹心法检测食品中葡萄球菌肠毒素SEA，其灵敏度为0.014ng/mL，检出速度快，0.5h就可出结果，鼠抗FITC单克隆抗体磁性微球试剂运用到本试剂盒当中，与多抗试剂比较增加了以下特点：1.特异性好；2.重复性高；3.高灵敏度等特点，降低了样品中的物质的干扰，提高了产品的检出率，同时增加了试剂盒的稳定性。

金黄色葡萄球菌是引起食品污染和细菌性食物中毒的一种重要细菌，金黄色葡萄球菌肠毒素是个世界性卫生问题，在美国由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒占整个细菌性食物中毒的33％，加拿大则更多，占45％，我国每年发生的此类中毒事件也非常多。食品受其污染后，不仅腐败变质，而且部分菌株产生肠毒素，在每100g食物中含有不足18μg的肠毒素便能引起金黄色葡萄球菌食物中毒症状，目前已经确认的肠毒素至少有A、B、C(包括Cl、C2、C3)、D、E和F等六个型，其中多数食物中毒是由SEA引起的。因此对肠毒素SEA的检测是食品安全检测的一个重要指标。

目前食品卫生的检验中主要用血清学反应检验金黄色葡萄球菌肠毒素，通常采用的方法有免疫琼脂扩散法、反向间接血凝试验、免疫荧光法和酶联免疫吸咐法。早期采用动物学试验的方法检测动物学试验因结果判断直观、准确，在某些情况下可采用，但由于试验动物来源困难、灵敏度低、检测结果不够理想等使其应用受到极大的限制，并且不能精确检测出SE的不同类型。而免疫琼脂扩散法虽然特异性强、准确度高、操作简单、不需仪器设备，但其灵敏度低，检查可疑食品中低浓度肠毒素时，必须将毒素浸出后浓缩，有时甚至要提纯，实验时间约需要3-5天，不能快速检测出结果。凝集试验步骤繁琐，特异性、敏感性相对较低；用于SE检测的免疫学方法主要有放射免疫测定法与酶联免疫吸附法。需要有放射性废物处理系统和机构，也需要复杂放射性计数系统。从事放射免疫的工作人员必须进行专门训练，熟悉技术，还必须有从事该项工作的许可证，这些均限制了放射免疫法的使用。而显色酶联免疫法操作复杂,检测时间长,稳定性差等缺点。磁微 粒化学发光方法的发展克服了上述方法的不足，检测时间短、灵敏度和特异性都很高。

本发明针对肠毒素SEA的检测制备了磁微粒化学发光法检测试剂盒，采用双单克隆抗体夹心法，可以定量检测食品中SEA的残留量，历时短，灵敏度高、操作简单、特异性高。

发明内容

本发明在于提供金黄色葡萄球菌肠毒素SEA残留量磁微粒化学发光免疫试剂盒及其检测方法，实现了检测用时短、灵敏度高、特异性强、操作简单等特点。本其中试剂盒包括：鼠抗SEA单克隆抗体标记FITC标记物、鼠抗SEA单克隆抗体标记碱性磷酸酶标记物、SEA标准品溶液、鼠抗FITC单克隆抗体标记磁性微球分离试剂，浓缩洗涤缓冲液、化学发光底物液。

本发明还公开了用上述磁微粒化学发光免疫试剂盒检测肠毒素SEA的方法步骤如下：

1.将标准品稀释成25ng/mL、10ng/mL、3ng/mL、0.9ng/mL、0.3ng/mL，0ng/mL加入反应管中，每孔10-100μl；

2.向反应管中分别加入鼠抗SEA单克隆-FITC标记物10-100μl。

3.向反应管中分别加入鼠抗SEA单克隆-ALP标记物10-100μl。

4.充分混匀，37℃温浴5-20min；加入鼠抗FITC单克隆抗体标记磁性微球分离试剂。

5.将上述反应管放在磁分离架上沉降1-2分钟，用100-500μl洗液进行清洗。

6.重复步骤5，1-3次。

7.向反应管中加入碱性磷酸酶化学发光底物50-300μl，在化学发光仪上测定化学发光强度

以各点发光强度值为纵坐标，标准品浓度为横坐标，绘出标准曲线，从上面找到被测样品的浓度，被测样品稀释后的OD值应在标准曲线之间。

本发明具有以下优点：

本试剂盒操作简便、快速、0.5h即可完成操作。无需特殊仪器，试剂无放射性，技术人员不需特殊训练就可以检测。

本试剂盒特异性强，可专一地检测到肠毒素SEA。

本试剂盒灵敏度高，可检测到0.014ng/mLSEA残留量。

本试剂盒费用低廉，可以降低检测成本。

本试剂盒使用范围广泛，可检测食品及其它标本中SEA残留量。

盒中的主要试剂均以工作液的形式提供，使用方便，具有高特异性、高灵敏性、高精确性、高准确性等特点，可快速检测食品中残留的肠毒素SEA。

具体实施方式

实施例1定量检测肠毒素SEA的磁微粒化学发光免疫试剂盒的组建

组建定量检测肠毒素SEA的磁微粒化学发光免疫试剂盒，使其包括下列组分：

(1)碱性磷酸酶(ALP)标记鼠抗金黄色葡萄球菌肠毒素SEA单克隆抗体标记物；

(2)异硫氰酸荧光素标记鼠抗金黄色葡萄球菌肠毒素SEA单克隆抗体标记物；

(3)SEA标准品溶液浓度分别为：25ng/mL、10ng/mL、3ng/mL、0.9ng/mL、0.3ng/mL、0ng/mL；

(4)鼠抗FITC单克隆抗体标记磁性微球分离试剂；

(5)洗涤液为含0.5％的吐温-20、0.15M PH7.4磷酸盐缓冲液；

(6)样品稀释液为0.05％的吐温-20和1％BSA 20mM PH7.2的磷酸盐缓冲液；

(7)碱性磷酸酶化学发光底物(北京博迈世纪生物技术有限公司生产)。

实施例2金黄色葡萄球菌肠毒素SEA单克隆抗体标记异硫氰酸荧光素标记物的制备

2.1制备SEA单克隆抗体标记异硫氰酸荧光素标记物的所需试剂

包被缓冲液：pH 9.5，0.1mol/L的碳酸盐缓冲液；

2.2SEA单克隆抗体标记异硫氰酸荧光素标记物的制备

用pH 9.5，0.1mol/L的碳酸盐缓冲液将SEA单克隆抗体稀释到3-5mg/ml，每毫克抗体中加入0.1-0.3ml的1mg/ml FITC溶液，37℃温浴2-4h；反应结束装入透析袋中在pH 9.5，0.1mol/L的碳酸盐缓冲液中2-8℃透析过夜，在此过程中更换缓冲液1-2次，将其配成0.1-5μg/ml,然后2-8℃保存。

实施例3金黄色葡萄球菌肠毒素SEA单克隆抗体标记碱性磷酸酶(ALP)标记物的制备

3.1金黄色葡萄球菌肠毒素SEA单克隆抗体的活化所需的试剂

反应缓冲液：0.1mol/L磷酸盐，0.15mol/L氯化钠，PH值7.3；

终止缓冲液：0.1mol/L磷酸盐，0.5mol/L羟胺，25mM EDTA,PH值7.4

3.2活化SEA单克隆抗体的制备

将SEA单克隆抗体在反应液中室温透析2-4小时，中间更换缓冲液1-2次，然后将SEA单克隆抗体用反应缓冲液稀释成2-5mg/mL；称取一定量的活化剂SATA，用DMSO稀释成13mg/mL,混匀；每毫升抗体中加入5-30μl 13mg/mL SATA溶液，室温反应10-30分钟。然后在终止缓冲液中室温透析2-4小时，中间更换缓冲液1-2次，反应结束后，放在2-8℃保存，待用。

3.3活化碱性磷酸酶(ALP)所需要的试剂

反应缓冲液：0.1mol/L磷酸盐，0.15mol/L氯化钠，PH值7.3；

终止缓冲液：0.1mol/L磷酸盐，0.5mol/L羟胺，25mM EDTA,PH值7.4

3.4活化碱性磷酸酶(ALP)的制备

将碱性磷酸酶(ALP)在反应液中室温透析2-4小时，中间更换缓冲液1-2次，然后将碱性磷酸酶(ALP)用反应缓冲液稀释成2-5mg/mL；称取一定量的LC-SMCC，用DMF稀释成5mg/mL,混匀；每毫升碱性磷酸酶(ALP)中加入50-100μl 5mg/mLLC-SMCC溶液，室温反应15-30分钟。然后在终止缓冲液中室温透析2-4小时，中间更换缓冲液1-2次，反应结束后，放在2-8℃保存，待用。

3.5活化的碱性磷酸酶(ALP)与活化的SEA单克隆抗体的连接

将活化的碱性磷酸酶(ALP)与活化的SEA单克隆抗体按照摩尔比1：1进行混合连接，2-8℃反应15-24小时，反应结束后,在蛋白纯化仪安装有superdex 200纯化柱上进行纯化，收集纯化液，并稀释至0.1-3μg/mL；

实施例4鼠抗FITC单克隆抗体标记磁性微球分离试剂的制备

4.1制备鼠抗FITC单克隆抗体标记磁性微球分离试剂的所需试剂

包被缓冲液：pH 7.2，0.02mol/L的磷酸盐缓冲液(PBS)；

磁性微球缓冲液：pH 7.2，0.15mol/L的磷酸盐缓冲液(PBS)；含0.1％BSA，0.5％Tween20。

4.2鼠抗FITC单克隆抗体标记磁性微球分离试剂的制备

用包被缓冲液将鼠抗FITC单克隆抗体稀释到大于4mg/ml，将羧基磁珠用包被缓冲液清洗三遍,然后用包被缓冲液将磁性微球稀释至5-15mg/mL,每毫克磁性微球中加入偶联剂DCC 0.01-0.1mg,室温反应10-30分钟，反应结束后每毫克磁性微球中加入上述稀释好的鼠抗FITC单克隆抗体0.01-0.1毫克，2-8℃反应18-24h；反应结束后用磁性微球缓冲液清洗2遍，然后将连接好的磁性微球稀释至2-5mg/mL，2-8℃保存。

实施例5猪肉中肠毒素SEA残留的检测

5.1样品前处理

准确量取25g猪肉于25mL蒸馏水；混匀以得到均匀悬液，如果悬液过剩，再加蒸馏水混匀；回收全部的提取液；用5mol/L HCL调pH值至4.0；18-25℃静置15-30min，将悬液于3000-5000g离心15min，调pH至7.5-8.0之间，取上清液0.5mL。

5.2用试剂盒进行检测

向反应管中加入标准品或样品溶液15μl，加入鼠抗SEA单克隆-FITC标记物30μl，加入鼠抗SEA单克隆-ALP标记物30μl 37℃温育10分钟；在磁分离架上分离1分钟后倒出各反应管中的上清液，拍干，向各反应管中加入200μl洗涤液，混匀，在磁分离架上分离1分钟后，如此重复清洗操作步骤2次；每孔加入碱性磷酸酶化学发光底物液200μl，直接在化学发光以上测定发光强度。

5.3结果分析

绘制标准曲线，相对应的样品中的SEA的浓度可以从标准曲线上读出，也可以用回归方程法计算出样本中的肠毒素SEA的含量。根据反应管中的的样本发光强度与系列浓度标准品溶液发光强度的比较，可以判断样本的肠毒素SEA的浓度范围，利用回归方程可以定量样本中SEA的含量。

实施例6试剂盒稳定性、灵敏度、特异性实验

6.1试剂盒稳定性实验

采用先进的稳定剂处理，处理后在37℃下保存进行加速破坏稳定性试验测试，测得稳定性结果见表1，根据经验在37℃下保存1天相当于4℃保存2个月，即本试剂盒在4℃下保存时间12个月，不影响使用。

表1.SEA试剂盒稳定性结果

6.2试剂盒灵敏度分析

测定SEA ELISA试剂盒灵敏度采用零点算法，做10个零点，求其平均值和标准差，得出其灵敏度，10个零点所得发光强度值分别如表2所示。计算其灵敏度为0.014ng/mL。

表2.SEA试剂盒10个零点数据

SEA

8309

8280

8469

8256

8320

8416

8258

8392

8263

8448

6.3试剂盒特异性分析结果

SEA试剂盒分别采用SEA、SEB、SEC1抗原进行交叉反应，交叉反应结果如表3。

表3.SEA检测试剂盒与SEB、SEC1的交叉反应实验

Claims (2)

1.磁微粒化学发光免疫试剂盒检测肠毒素SEA的方法，步骤为：

(1)将标准品稀释成25ng/ml、10ng/ml、3ng/ml、0.9ng/ml、0.3ng/ml，0ng/ml加入反应管中，每孔10-100μl，样品稀释液为0.05％的吐温-20和1％BSA 20mM PH7.2的磷酸盐缓冲液；

(2)向反应管中分别加入鼠抗SEA单克隆-FITC标记物10-100μl，所述鼠抗SEA单克隆-FITC标记物的制备方法为：用pH 9.5，0.1mol/L的碳酸盐缓冲液将SEA单克隆抗体稀释到3-5mg/ml，每毫克抗体中加入0.1-0.3ml的1mg/ml FITC溶液，37℃温浴2-4h；反应结束装入透析袋中在pH 9.5，0.1mol/L的碳酸盐缓冲液中2-8℃透析过夜，在此过程中更换缓冲液1-2次，将其配成0.1-5μg/ml，然后2-8℃保存；

(3)向反应管中分别加入鼠抗SEA单克隆-ALP标记物10-100μl，所述鼠抗SEA单克隆-ALP标记物的制备方法为：将活化的碱性磷酸酶ALP与活化的SEA单克隆抗体按照摩尔比1：1进行混合连接，2-8℃反应15-24小时，反应结束后,在蛋白纯化仪安装有superdex 200纯化柱上进行纯化，收集纯化液，并稀释至0.1-3μg/mL；

(4)充分混匀，37℃温浴5-20min；加入鼠抗FITC单克隆抗体标记磁性微球分离试剂；

(5)将上述反应管放在磁分离架上沉降1-2min，用100-500μl洗液进行清洗，洗液为含0.5％的吐温-20、0.15M PH7.4磷酸盐缓冲液；

(6)重复步骤5，1-3次；

(7)向反应管中加入碱性磷酸酶化学发光底物50-300μl，在化学发光仪上测定化学发光强度；

(8)以各点发光强度值为纵坐标，标准品浓度为横坐标，绘出标准曲线，从上面找到被测样品的浓度，被测样品稀释后的OD值应在标准曲线之间。

2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的标准品为SEA标准品溶液。