CN203337668U - 荧光定量检测单增李斯特菌免疫层析试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本实用新型公开了一种荧光定量检测单增李斯特菌免疫层析试剂盒，该试剂盒包括试纸条、免疫磁珠和荧光标记液，所述试纸条的检测区包被有单增李斯特菌单克隆抗体或多克隆抗体，质控区包被有抗兔IgG抗体；所述免疫磁珠表面偶联有单增李斯特菌单克隆抗体；所述荧光标记液中含有荧光胶乳标记单增李斯特菌单克隆抗体或多克隆抗体和荧光胶乳标记兔IgG抗体。本实用新型结合了磁珠富集样本技术和免疫层析荧光定量检测技术，利用免疫磁珠对检测样本中的单增李斯特菌进行了富集浓缩后，把目标物洗脱出来，再利用荧光免疫层析技术进行定量检测，与单纯的荧光定量层析检测试剂盒或者一般的胶体金检测方法等相比，大大提高了检测效率。
Description
技术领域
本实用新型属于医学检验领域，具体地说，本实用新型涉及一种荧光定量检测单增李斯特菌免疫层析试剂盒，包括荧光定量检测单增李斯特菌免疫层析试纸条、免疫磁珠溶液和荧光标记液。
背景技术
单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria Monocytogenes)是一种人畜共患的食源性致病菌，简称单增李斯特菌。单增李斯特菌是一种革兰氏阳性短杆菌，不产芽孢，临床主要表现为败血症、脑膜炎等，尤其易感染孕妇、新生儿、老年人等免疫力低下的人群和免疫缺陷病人，孕妇感染后可引发菌血症导致早产、死婴等。其发病率虽不高，但致死率可高达20％～30％。它在自然界广泛分布，蔬菜、乳制品、海产品、肉类和禽类等食品中都已证实是李斯特菌的传播载体，它可在4℃的环境中生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一。
目前，食品中单增李斯特菌的检测主要有三大技术手段，分别是传统的分离培养与鉴定技术、分子生物学检测技术、和免疫学检测技术。传统检测方法首先对样品进行增菌处理后，分离纯化出可疑微生物，进一步对可疑菌落做生化反应实验、溶血实验、动物实验及典型运动等鉴定，被确定为李斯特菌后进一步进行血清分型。我国检测单增李斯特菌方法主要有国标GB 4789.30-2010和行业标准SNT 0184.1-2005。传统检验方法中，前增菌处理是不可或缺的实验步骤，这些增菌方法耗时不一，但至少都需要20小时，且后续鉴定程序复杂，不能够适应当今社会快速、准确、灵敏、特异检测微生物的要求。
以聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)技术为代表的分子生物学技术在实际应用中也存在一些问题，如普通聚合酶链式反应(PCR)技术需要专门的仪器，而且存在容易交叉污染，造成假阳性及过程烦琐的缺点。而荧光定量聚合酶链式反应(real time PCR)技术虽较好解决了交叉污染的问题，并简化了操作流程，但需更复杂的定量检测仪器，不适用于现场快速检测。免疫学方法是基于抗原抗体特异性反应而建立起来的一种检测方法，具有快速、灵敏、特异、结果易于判断等特点。目前，单增李斯特菌的免疫学检测法主要有酶联免疫吸附法(ELISA)、酶联荧光免疫检测系统等，其中应用最为广泛的是ELISA法，但其操作过程需要专业人员进行检测，操作步骤复杂，且检测时间较长，一般需18～24小时。
免疫层析技术是出现于80年代初期的一种独特的免疫分析方式，免疫层析技术常见的标记物有胶体金、胶乳颗粒、胶体硒、明胶等，运用最成功的标记物为胶体金。胶体金免疫层析技术不需要特殊大型设备，从而具有操作简便、快速灵敏的优点，是一种适用于现场快速检测的方法。但也存在以下不足之处导致无法实现准确的定量检测：
(1)胶体金标记过程是静电吸附过程，是一种物理吸附，稳定性较差，往往造成已标记上的蛋白分子又再次脱落。
(2)显色后只能是单一的颜色——紫红色，不能根据不同的品种或不同要求变化颜色。
(3)样本浓度较低，收集时比较分散，浓度比较低，检测灵敏度不高。
实用新型内容
本实用新型的目的是针对上述现有技术的缺陷，提供一种单增李斯特菌荧光胶乳免疫层析检测试剂盒及制备方法。本实用新型的试剂盒检测特异性强，灵敏度高，检测速度快，可实现定量检测。
为实现上述目的，本实用新型采用了以下技术方案：
一种荧光定量检测单增李斯特菌免疫层析试剂盒，其特征是，所述试剂盒包括试纸条、单增李斯特菌单克隆抗体-免疫磁珠偶联物和荧光标记液。所述试纸条包含样品垫、硝酸纤维素包被膜、吸水纸、聚乙烯塑料底板，顺次搭接粘贴；所述硝酸纤维素包被膜包括检测区和质控区；所述检测区包被有单增李斯特菌单克隆抗体或多克隆抗体，所述质控区包被抗兔IgG抗体；所述荧光标记液中含有荧光胶乳标记单增李斯特菌单克隆抗体或多克隆抗体和荧光胶乳标记兔IgG抗体。
优选地，所述磁珠为微米级别的羧基磁珠。
优选地，所述荧光标记液的激发波长(Ex)为310～550nm，发射波长(Em)为340～620nm。
本实用新型所述的一种单增李斯特菌的免疫层析试纸条的检测原理是双抗夹心法，先将经过活化的免疫磁珠加入到样本，将样本中的目标抗原吸附浓缩，去除上清液后进行洗脱，使目标抗原和磁珠分离；将浓缩后样本和免疫荧光胶乳微球液体混合(免疫荧光胶乳微球已经与单增李斯特菌单克隆抗体或多克隆抗体偶联)，当此荧光胶乳标记的单增李斯特菌单克隆抗体或多克隆抗体与检测样本中足够的单增李斯特菌结合形成复合物，该复合物在层析作用下移动至包被膜的检测区，在包被膜的检测区包被有能与单增李斯特菌结合的单克隆抗体或多克隆抗体，该抗体结合在单增李斯特菌的另一表位上，形成双抗体夹心的复合物。利用 荧光定量光谱监测系统，由光源激发包被膜上检测区T线处聚积的荧光胶乳，荧光胶乳发射出的荧光被相应的检测系统接收，通过光电变换将光信号转化成电信号，并由自动控制系统将信号输出，显示出最终的定量结果。
本实用新型所述的单增李斯特菌荧光免疫层析试剂盒与PCR方法、ELISA方法相比，具有操作简便、适合不同数量样本检测和快速(2小时左右即可有结果)等优点；与胶体金免疫层析试纸条和一般的荧光试纸条相比，本实用新型具有灵敏度更高，且可实现定量检测等优点。
本实用新型所述的单增李斯特菌荧光免疫层析试剂盒，采用荧光标记液与样本预先混合的方法，使反应与信号释放更加均一，与其他层析法相比，其批量生产的精密度和准确度达到最好效果。配合相应的荧光定量检测仪，仅需10秒时间即可对单增李斯特菌做出灵敏的定量检测结果输出。
本实用新型结合了磁珠富集样本技术和免疫层析荧光定量检测技术，利用免疫磁珠对检测样本中的单增李斯特菌进行了富集浓缩后再进行定量检测，与单纯的荧光定量层析检测试剂盒相比，大大提高了检测效率。
附图说明
图1是本实用新型的所述荧光定量检测单增李斯特菌层析试剂盒中试纸条的结构示意图；
图2是本实用新型的所述荧光定量检测单增李斯特菌层析试剂盒中试纸条的结构示意图；
图3是本实用新型的所述荧光定量检测单增李斯特菌层析试剂盒中用于放置试纸条的检测卡的结构示意图。
附图标记：
1、样品垫；2、硝酸纤维素包被膜；3、检测区(T线)；4、质控区(C线)；5、吸水纸；6、底板；7、卡外壳；8、显示窗；9、加样孔。
具体实施方式
实施例一：检测牛肉样本中单增李斯特菌的荧光免疫层析试剂盒
在该实施例中，荧光定量检测单增李斯特菌、免疫层析试剂盒，包括试纸条、免疫磁珠溶液和荧光标记液。
其中，试纸条由样品垫、包括检测区(T区)和质控区(C区)的纤维素包被膜、吸水纸按试纸条的常规方法依次相互搭接地粘贴在底板上。
在该实施例中，包被膜的检测区T线包被有浓度为0.3mg/ml，用量为90μl/27-35cm的单增李斯特菌单克隆抗体或多克隆抗体。在包被膜的质控区C线包被有浓度为0.3mg/ml，用量为90μl/27-35cm的羊抗兔IgG抗体，用于结合荧光标记的兔IgG抗体，用于检测试纸条的有效性。
(1)检测牛肉样本中单增李斯特菌的免疫磁珠的制备
磁珠活化：取100μL羧基修饰磁珠至1.5mL离心管中，用等体积一水吗啉乙磺酸溶液(MES，pH5，25mM)洗涤2次，用磁力架分离后吸出上清。用MES(pH5，25mM)分别配制50mg/mL的碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶液，向磁珠中分别加入50μL EDC和NHS溶液，置于混匀仪上保持磁珠悬浮，室温活化30分钟，离心管置于磁力架上磁分离，移除上清，加入100μL MES(pH5，25mM)，重新洗涤2次，最后移除上清。
磁珠与抗体偶联：将60μg单增李斯特菌单克隆抗体与活化的磁珠混合，用MES(pH5，25mM)调节总体积至100μL，在旋转混合器上室温反应30分钟。加入含有1％(w/v)牛血清白蛋白BSA的PBS溶液，封闭反应30分钟。取下离心管置于磁力架上磁分离，移除上清，磁珠用100μL PBS洗涤四次。加入以含0.02％(w/v)叠氮化钠NaN3、1％(w/v)牛血清白蛋白BSA的PBS作为保存液，4℃保存备用。
(2)荧光标记液的制备
荧光胶乳的共价活化：超声波处理胶乳微球体30秒后，调节胶乳微球体浓度为1.0×1012/mL，15000rpm离心10分钟，离心后收集沉淀物用蒸馏水溶解，并用200W超声波分散30秒；先加入50μL的50mg/mL EDC，振荡混匀，再加入50μL的50mg/mL N-羟基硫代琥珀酰亚胺，振荡混匀，室温下平衡30分钟后在15000rpm离心10分钟，沉淀用50mM柠檬酸缓冲液溶解，静置于4℃冰箱。
荧光胶乳标记蛋白的制备：将活化后的荧光胶乳于200W超声波处理30秒，按照100μg蛋白/100μL荧光胶乳的比例加入待标记的单增李斯特菌单克隆抗体和兔IgG抗体，混匀室温搅拌反应2小时，离心洗涤，每次15000rpm下离心10分钟，共洗涤3次，沉淀用PBS-TBN溶解并100W超声波处理30秒，然后用PBS-TBN稀释至离心前体积，4℃保存备用。
将上述制备好的荧光胶乳微粒标记的单增李斯特菌单克隆抗体和荧光胶乳微粒标记兔IgG抗体用抗体稀释液按1∶100、1∶1000比例稀释混合，分装备用。
(3)定量检测牛肉样本中单增李斯特菌
以无菌操作将10g牛肉样本放于含有90mL灭菌生理盐水均质器中，置均质器中以8000r/min的速度处理1分钟后过滤，做成1∶10的均质稀释液。取1mL均质液加入30μL免疫磁珠富集，将富集捕获单增李斯特菌的免疫磁珠用80μLPBS重悬，60℃水浴温育15分钟后，再用磁性分离架分离出免疫磁珠，保留含有单增李斯特菌的上清液，吸取50μL的样本与荧光标记液等量混合，混匀1分钟后吸取80μL，往水平放置检测卡加样孔加入，避免带气泡，开始层析反应。反应15分钟，由广州万孚生物技术股份有限公司自主研制的“飞测”荧光检测仪(型号：WF-0901/1型)读取测试结果。
实施例二：检测牛奶样本中单增李斯特菌的荧光免疫层析试剂盒的制备
在该实施例中，荧光定量检测单增李斯特菌免疫层析试剂盒，包括试纸条、免疫磁珠溶液和荧光标记液。
其中，试纸条由样品垫、包括检测区(T区)和质控区(C区)的纤维素包被膜、吸水纸按试纸条的常规方法依次相互搭接地粘贴在底板上。
在该实施例中，包被膜的检测区T线包被有浓度为2.5mg/ml，用量为90μl/27-35cm的单增李斯特菌单克隆抗体或多克隆抗体。在包被膜的质控区C线包被有浓度为2.5mg/ml，用量为90μl/27-35cm的羊抗兔IgG抗体，用于结合荧光标记的兔IgG抗体，用于检测试纸条的有效性。
(1)检测牛奶样本中单增李斯特菌免疫磁珠的制备
磁珠活化：取100μL羧基修饰磁珠至1.5mL离心管中，用等体积一水吗啉乙磺酸溶液(MES，pH5，25mM)洗涤2次，用磁力架分离后吸出上清。用MES(pH5，25mM)分别配制50mg/mL的碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶液，向磁珠中分别加入50μL EDC和NHS溶液，置于混匀仪上保持磁珠悬浮，室温活化30分钟，离心管置于磁力架上磁分离，移除上清，加入100μL MES(pH5，25mM)，重新洗涤2次，最后移除上清。
磁珠与抗体偶联：将60μg单增李斯特菌单克隆抗体与活化的磁珠混合，用MES(pH5，25mM)调节总体积至100μL，在旋转混合器上室温反应30分钟。加入含有1％(w/v)牛血清白蛋白BSA的PBS溶液，封闭反应30分钟。取下离心管置于磁力架上磁分离，移除上清，磁珠用100μL PBS洗涤四次。加入以含0.02％(w/v)叠氮化钠NaN3、1％(w/v)牛血清白蛋白BSA的PBS作为保存液，4℃保存备用。
(2)荧光标记液的制备
荧光胶乳的共价活化：超声波处理胶乳微球体30秒后，调节胶乳微球体浓度为1.0×1013/mL，15000rpm离心10分钟，离心后收集沉淀物用蒸馏水溶解，并用200W超声波分散30秒；先加入50μL的50mg/mL EDC，振荡混匀，再加入50μL的50mg/mLN-羟基硫代琥珀酰亚胺，振荡混匀，室温下平衡30分钟后在15000rpm离心10分钟，沉淀用50mM柠檬酸缓冲液溶解，静置于4℃冰箱。
荧光胶乳标记蛋白的制备：将活化后的荧光胶乳于200W超声波处理30秒，按照80μg蛋白/100μL荧光胶乳的比例加入待标记的单增李斯特菌单克隆抗体和兔IgG抗体，混匀室温搅拌反应2小时，离心洗涤，每次15000rpm下离心10分钟，共洗涤3次，沉淀用PBS-TBN溶解并100W超声波处理30秒，然后用PBS-TBN稀释至离心前体积，4℃保存备用。
将上述制备好的荧光胶乳微粒标记的单增李斯特菌单克隆抗体和荧光胶乳微粒标记兔IgG抗体用抗体稀释液按1∶50、1∶1000比例稀释混合，分装备用。
(3)定量检测牛奶样本中单增李斯特菌
以无菌操作将10mL牛奶样本放于90mL灭菌生理盐水中，8000r/min的速度离心去除上层脂肪层，做成1∶10的稀释液。取1mL均质液加入30μL免疫磁珠富集，将富集捕获单增李斯特菌的免疫磁珠用80μLPBS重悬，60℃水浴温育15分钟后，再用磁性分离架分离出免疫磁珠，保留含有单增李斯特菌的上清液，吸取50μL的样本与荧光标记液等量混合，混匀1分钟后吸取80μL，往水平放置检测卡加样孔加入，避免带气泡，开始层析反应。反应15分钟，由广州万孚生物技术股份有限公司自主研制的“飞测”荧光检测仪(型号：WF-0901/1型)读取测试结果。
实施例三：检测火腿肠样本中单增李斯特菌的荧光免疫层析试剂盒的制备
在该实施例中，荧光定量检测单增李斯特菌免疫层析试剂盒，包括试纸条、免疫磁珠溶液和荧光标记液。
其中，试纸条由样品垫、包括检测区(T区)和质控区(C区)的纤维素包被膜、吸水纸按试纸条的常规方法依次相互搭接地粘贴在底板上。
在该实施例中，包被膜的检测区T线包被有浓度为3.5mg/ml，用量为90μl/27-35cm的单增李斯特菌单克隆抗体或多克隆抗体。在包被膜的质控区C线包被有浓度为3.5mg/ml，用量为90μl/27-35cm的羊抗兔IgG抗体，用于结合荧光标记的兔IgG抗体，用于检测试纸条的有效性。
(1)检测火腿肠样本中单增李斯特菌免疫磁珠的制备
磁珠活化：取100μL羧基修饰磁珠至1.5mL离心管中，用等体积一水吗啉乙磺酸溶液(MES，pH5，25mM)洗涤2次，用磁力架分离后吸出上清。用MES(pH5，25mM)分别配制50mg/mL的碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶液，向磁珠中分别加入50μL EDC和NHS溶液，置于混匀仪上保持磁珠悬浮，室温活化30分钟，离心管置于磁力架上磁分离，移除上清，加入100μL MES(pH5，25mM)，重新洗涤2次，最后移除上清。
磁珠与抗体偶联：将60μg单增李斯特菌单克隆抗体与活化的磁珠混合，用MES(pH5，25mM)调节总体积至100μL，在旋转混合器上室温反应30分钟。加入含有1％(w/v)牛血清白蛋白BSA的PBS溶液，封闭反应30分钟。取下离心管置于磁力架上磁分离，移除上清，磁珠用100μL PBS洗涤四次。加入以含0.02％(w/v)叠氮化钠NaN3、1％(w/v)牛血清白蛋白BSA的PBS作为保存液，4℃保存备用。
(2)荧光标记液的制备
荧光胶乳的共价活化：超声波处理胶乳微球体30秒后，调节胶乳微球体浓度为1.0×1013/mL，15000rpm离心10分钟，离心后收集沉淀物用蒸馏水溶解，并用200W超声波分散30秒；先加入50μL的50mg/mL EDC，振荡混匀，再加入50μL的50mg/mL N-羟基硫代琥珀酰亚胺，振荡混匀，室温下平衡30分钟后在15000rpm离心10分钟，沉淀用50mM柠檬酸缓冲液溶解，静置于4℃冰箱。
荧光胶乳标记蛋白的制备：将活化后的荧光胶乳于200W超声波处理30秒，按照80μg蛋白/100μL荧光胶乳的比例加入待标记的单增李斯特菌单克隆抗体和兔IgG抗体，混匀室温搅拌反应2小时，离心洗涤，每次15000rpm下离心10分钟，共洗涤3次，沉淀用PBS-TBN溶解并100W超声波处理30秒，然后用PBS-TBN稀释至离心前体积，4℃保存备用。
将上述制备好的荧光胶乳微粒标记的单增李斯特菌单克隆抗体和荧光胶乳微粒标记兔IgG抗体用抗体稀释液按1∶50、1∶1000比例稀释混合，分装备用。
(3)定量检测火腿肠样本中单增李斯特菌
以无菌操作将10g火腿肠样本放于含有90mL灭菌生理盐水均质袋中，置均质器中以8000r/min的速度处理1分钟后过滤，做成1∶10的均质稀释液。取1mL均质液加入30μL免疫磁珠富集，将富集捕获单增李斯特菌的免疫磁珠用100μLPBS重悬，60℃水浴温育15分钟后，再用磁性分离架分离出免疫磁珠，保留含有单增李斯特菌的上清液，吸取50μL的样本与荧光标记液等量混合，混匀1分钟后吸取80μL，往水平放置检测卡加样孔加入，避免带气泡，开始层析反应。反应15分钟，由广州万孚生物技术股份有限公司自主研制的“飞 测”荧光检测仪(型号：WF-0901/1型)读取测试结果。
本实用新型所述的单增李斯特菌免疫层析检测试剂盒，在具体实例中，半成品通过以下工序组装而成：由样品垫、包被膜、吸水纸顺次搭接粘贴在底板上，构成试纸条，可再用现有技术中的卡外壳7(如图3所示)，固定成检测卡，所述卡外壳涂有可供荧光仪扫描识别的产品信息喷码。与写入信息的ID芯片(现有技术中的ID芯片采用的定量计算公式为检测信号值与计算浓度的半对数直线方程式或其他计算方程式，可自动进行结果判定)。分装好的免疫磁珠、荧光标记液和其他配件组装成试剂盒。
本实用新型所述荧光定量检测单增李斯特菌的免疫层析试剂盒，在使用时，组装在由塑料上壳和塑料下壳扣合而成的塑料卡外壳(检测卡)中，塑料上壳设有两个开孔，加样孔9和显示窗8，加样孔9对应于所述的荧光定量检测单增李斯特菌的免疫层析试纸条样品垫，结果显示窗8对应于所述荧光定量检测单增李斯特菌的免疫层析试纸条的检测区和质控区，该荧光定量检测单增李斯特菌的免疫层析试纸条可以从该塑料外壳中取出。
本实用新型通过对实施例中的200例样本进行检测，同时用胶体金免疫层析试剂盒、酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒和环介导等温扩增(LAMP)试剂盒分别进行检测比较。目前，市面上销售的应用了胶体金、ELISA、LAMP技术检测单增李斯特菌的试剂盒只能对样本中的目标检测物进行定性或半定量检测，相比之下，本实用新型结合了免疫磁珠富集技术和荧光定量检测技术，可对样本进行精确定量。现将该检测效果比较如下：
以上是针对本实用新型的可行实施实例的具体说明，当该实施实例并非用以限制本实用新型的专利范围，凡未脱离本实用新型技艺精神所为的等效实施或变更，均应包含于本实用新型的专利范围中。
Claims (3)
1.一种荧光定量检测单增李斯特菌免疫层析试剂盒，其特征是，所述试剂盒包括试纸条、单增李斯特菌单克隆抗体-免疫磁珠偶联物和荧光标记液；所述试纸条包含样品垫、硝酸纤维素包被膜、吸水纸、聚乙烯塑料底板，顺次搭接粘贴；所述硝酸纤维素包被膜包括检测区和质控区；所述检测区包被有单增李斯特菌单克隆抗体或多克隆抗体，所述质控区包被抗兔IgG抗体。
2.根据权利要求1所述的荧光定量检测单增李斯特菌免疫层析试剂盒，其特征是，所述磁珠为微米级别的羧基磁珠。
3.根据权利要求1所述的荧光定量检测单增李斯特菌免疫层析试剂盒，其特征是，所述荧光标记液的激发波长(Ex)为310～550nm，发射波长(Em)为340～620nm。
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