CN204314301U

CN204314301U - 一种同步检测呕吐毒素和伏马毒素的免疫层析试纸条

Info

Publication number: CN204314301U
Application number: CN201420842649.3U
Authority: CN
Inventors: 张波; 王松雪; 谢刚; 付晓玲; 雷达; 刘向阳
Original assignee: Beijing Kytechbio Biotechnology Co ltd; Second Affiliated Hospital to Nanchang University; Academy of State Administration of Grain
Current assignee: Beijing Kytechbio Biotechnology Co ltd; Second Affiliated Hospital to Nanchang University; Academy of State Administration of Grain
Priority date: 2014-12-26
Filing date: 2014-12-26
Publication date: 2015-05-06
Anticipated expiration: 2024-12-26

Abstract

本实用新型涉及一种同步检测呕吐毒素和伏马毒素的免疫层析试纸条。由依次黏贴在背衬上的样品垫、胶体金结合垫、反应膜和吸水垫组成。反应膜上喷有呕吐毒素—牛血清白蛋白偶联物、伏马毒素—牛血清白蛋白偶联物和羊抗鼠抗体，作为检测线和质控线，可将反应结果以肉眼可见的颜色形式表现出来。具有操作简单、快速、灵敏度高的特点，且不需要借助其它仪器设备，适用于野外现场检测。可用于饲料、食品等样品中呕吐毒素和伏马毒素两种霉菌毒素含量的同步检测。

Description

一种同步检测呕吐毒素和伏马毒素的免疫层析试纸条

技术领域

本实用新型设及霉菌毒素免疫层析检测技术，具体涉及一种同步检测呕吐毒素和伏马毒素的免疫层析试纸条。

背景技术

呕吐毒素（Deoxynivalenol，DON）是单端孢菌素烯烃中的一种，由禾谷镰刀菌产生。主要污染小麦、大麦、玉米等谷类作物，也污染粮食制品，人和动物在误食被该毒素污染的粮谷类后可以产生广泛的毒性效应。DON属于剧毒或中等毒物，研究表明，DON在体内可能有一定的蓄积，但无特殊的靶器官，具有很强的细胞毒性。研究表明，DON可能对免疫系统有影响，有明显胚胎毒性和一定致畸作用，可能有遗传毒性，但无致癌、致突变作用。由于DON的危害严重，引起了各国的普遍重视。谷物及饲料中DON的含量有严格的限量标准。我国GB 2761-2011“食品安全国家标准食品中真菌毒素限量”中规定玉米、小麦等谷物及其制品中DON的限量标准为1000μg/kg。

伏马毒素是由串珠镰刀菌产生的水溶性代谢产物，是一类由不同的多氢醇和丙三羧酸组成的结构类似的双酯化合物，包括一个由20个碳原子组成的脂肪链及通过二个酯键连接的亲水性侧链。伏马毒素对粮食、饲料污染的情况在世界范围内普遍存在，主要污染玉米及玉米制品。1988年，Gelderblon等首次从串珠镰刀菌培养液中分离出。动物试验和流行病学资料已表明，伏马毒素主要损害肝肾功能，能引起马脑白质软化症和猪肺水肿等，对多数动物种属有肾脏毒性、肝脏毒性和神经毒性作用。有报道指出，伏马毒素对人、畜不仅是一种促癌物，而且完全是一种致癌物。鉴于伏马毒素的毒性，现已引起世界范围的广泛注意，已被世界卫生组织列为近年来首先进行研究的几种霉菌毒素之一。

目前呕吐毒素和伏马毒素含量的检测方法主要有薄层色谱法，免疫分析法及精密仪器分析法。薄层色谱法作为标准方法虽然被广泛使用沿用至今，虽不需要特殊的仪器设备，在一般实验室即可进行，但检测试剂用量大、操作繁琐、干扰严重、准确性差、灵敏度较低、不能准确定量，对实验人员和周围环境污染危害较大；精密仪器分析法主要有高效液相色谱法、超高效液相色谱法和液质联用法，虽然可以精确地进行定性、定量分析，但是由于其设备昂贵、操作复杂和对样品的纯度有较高的要求，需要专业的操作人员，导致检测成本高、周期长，无法满足大批量样本快速筛查的需要，难以实现快速检测。免疫分析法是以利用抗原抗体的特异反应为基础，主要有酶联免疫分析法和胶体金免疫层析法，具有快速、灵敏、操作简单等优点，近年来获得了快速发展。胶体金试纸条是以胶体金为显色媒介，将反应所需的原料大部分整合到试纸条上，在层析过程中完成检测反应。然而现有用于霉菌毒素检测的免疫层析试纸条大都主要只能检测一种霉菌毒素。而受生产条件影响，我国的同一农产品受多种霉菌毒素污染的可能性大，因此迫切需要能快速、同步检测多种霉菌毒素的产品。

实用新型内容

本实用新型针对粮食、饲料等样品中的呕吐毒素和伏马毒素含量检测展开研究，提供一种具有快速、操作简单、特异性强、灵敏度高、不需要额外设备等特点，可用于现场快速同步检测呕吐毒素和伏马毒素含量的胶体金免疫检测试纸条。

试纸条应用竞争抑制免疫层析原理，通过检测区的抗原和金标垫上的金标抗体反应，以检测区是否显色来反应样品中的呕吐毒素和伏马毒素含量是否超标。

本试纸条由依次黏贴在背衬上的样品垫、胶体金结合垫、反应膜和吸水垫组成。其中样品垫、胶体金结合垫、反应膜和吸水垫在相邻的地方有不同程度的重叠，以保证层析作用从样品垫到吸水垫的顺利进行，使样品溶液中的有效成分、反应膜上的检测区及质控区与胶体金结合垫上的胶体金单抗偶联物顺利发生反应。

本实用新型试纸条的各组成成分与功能如下：

背衬：为一面涂有不干胶的不吸水材料，常用PVC板，用于固定试纸条其他组分；

样品垫：用玻璃纤维制成，起吸收样品溶液，缓冲样品溶液pH值的作用

胶体金结合垫：使用聚酯膜或玻璃纤维素膜制成，上有抗呕吐毒素单抗及抗伏马毒素单抗与胶体金的偶联物，作用为样品液中的抗原与金标抗体反应的起始场所；

反应膜：使用硝酸纤维素膜，从样品垫到吸水垫方向依次喷有呕吐毒素—牛血清白蛋白偶联物、伏马毒素—牛血清白蛋白偶联物和羊抗鼠抗体，分别作为检测线和质控线用于标记检测线和质控线，将反应结果以肉眼可见的颜色表现出来；

吸水垫：由吸水纸制成，用于吸收多余的溶液使其不影响最终结果。

本实用新型试纸条具有如下有益效果：

（1）特异性好。本实用新型试纸条使用的是分别针对呕吐毒素和伏马毒素的单克隆抗体。

（2）灵敏度高。本实用新型试纸条的最低检测限呕吐毒素和伏马毒素分别为50μg/kg和100μg/kg，满足国家标准中对粮食、饲料等样品中呕吐毒素和伏马毒素的限量要求。

（3）操作简单快速。本实用新型试剂板将实验所需的大部分原料都已整合到试纸条上，不存在试剂配制、洗涤分离等操作，滴加样品提取液后3-5分钟即可肉眼读取结果，且样品前处理方法简单。

附图说明

图1为试纸条结构示意图。其中1为样品垫，2为胶体金结合垫，3为反应膜，4为呕吐毒素检测线，5为伏马毒素检测线，6为质控线，7为背衬，8为吸水垫。

图2为试纸条结果判定示意图。2-1表示呕吐毒素、伏马毒素都为阴性；2-2表示呕吐毒素、伏马毒素都为阳性；2-3表示呕吐毒素为阳性、伏马毒素为阴性；2-4表示呕吐毒素为阴性、伏马毒素为阳性；2-5、2-6、2-7、2-8表示试纸条无效。

具体实施方式

本实用新型试剂板的制备包括呕吐毒素免疫原的制备、抗呕吐毒素单克隆抗体制备、伏马毒素免疫原的制备、抗伏马毒素单克隆抗体制备、胶体金溶液制备、胶体金标记抗呕吐毒素单抗的制备，胶体金标记抗伏马毒素单抗的制备，试纸条的组装。

1、呕吐毒素免疫原(DON-BSA)制备

1．1称取1mg DON和10mg正丁基硼酸溶于200μl无水吡啶中，混匀溶解，室温下反应24小时。

1．2加入10mg丁二酸酐，沸水浴中反应3小时。用氮气吹干，加入300μl水，再加入乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯层，氮气吹干后，溶于200μl DMF中，加入10 mg DCC和6 mg NHS，4℃下反应过夜。

1．3将上述溶液滴加入BSA溶液中，室温反应10小时。

1．4将上述反应溶液装入透析袋中，用20mM pH7.4 PBS溶液透析，4℃透析三天，期间每8小时换一次透析液。

1．5取出透析后的溶液，离心，取上清，-20℃保存。

2、抗呕吐毒素单克隆抗体制备

2.1 小鼠免疫

将制备好的呕吐毒素免疫原，按体积比1:1加入佐剂混匀乳化，按蛋白浓度100μg/只腹部皮下多点免疫BALB/c小鼠，首免免疫原与弗氏完全佐剂等体积混匀，二免及以后以免疫元和弗氏不完全佐剂等体积混匀，首免3周后，以同样方法进行二次免疫，二免后每两2周免疫一次，三免后检测小鼠血清效价，血清效价合格后进行融合，融合前3天再追加免疫一次。

2.2 细胞融合

按照常规方法，准备好处于对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)和提取免疫小鼠的脾细胞，将小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞混合，然后在1分钟左右时间内（最佳时间为45秒）缓慢加入预热的融合剂(PEG4000)进行融合，用HAT培养基悬浮均匀，再加入适量的饲养细胞，培养十96孔培养板，于37℃ 5% CO₂培养箱中培养，5天后用HT培养基半换液，9天的时候进行全换液。

2.3杂交瘤细胞的筛选

细胞融合后，待细胞长到培养孔面积的1/4时，采用分步筛选法筛选杂交瘤细胞。采用间接非竞争ELISA方法初选，检测细胞培养上清液，检测为阳性的孔，立即用有限稀释法进行亚克隆化。

2.4杂交瘤细胞的冻存

将进行了2-3次亚克隆后的杂交瘤细胞扩大培养后用含25%血清、10% DMSO的基础细胞培养液冻存，浓度为10⁶-10⁷左右/ml。

2.5单克隆抗体腹水制备

复苏冻存的杂交瘤细胞，扩大培养。取8-10周龄BALB/c小鼠腹腔注射液体石蜡0.5ml/只，7-10日后腹腔注射杂交瘤细胞1-2 ×10⁶ /只，7-10日后抽取小鼠腹水，离心取上清，测定效价，冻存备用。

3、伏马毒素免疫原(FB₁-BSA)制备

3.1称取1mg伏马毒素和5mg牛血清白蛋白（BSA）溶于2ml磷酸盐缓冲液（PBS）中，滴加入0.2ml 5%的戊二醛溶液，室温反应4小时。

3.2滴加0.2ml溶度为1M的NaBH4溶液，室温反应1小时。

3.3将反应溶液装入透析袋中，用20mM pH7.4 PBS溶液透析，4℃透析三天，期间每8小时换一次透析液。

3.4取出透析后的溶液，离心，取上清，-20℃保存。

4、抗伏马毒素单克隆抗体制备

4.1 小鼠免疫

将制备好的伏马毒素免疫原，按体积比1:1加入佐剂混匀乳化，按蛋白浓度100μg/只腹部皮下多点免疫BALB/c小鼠，首免免疫原与弗氏完全佐剂等体积混匀，二免及以后以免疫元和弗氏不完全佐剂等体积混匀，首免3周后，以同样方法进行二次免疫，二免后每两2周免疫一次，三免后检测小鼠血清效价，血清效价合格后进行融合，融合前3天再追加免疫一次。

4.2 细胞融合

4.3杂交瘤细胞的筛选

4.4杂交瘤细胞的冻存

4.5单克隆抗体腹水制备

5、胶体金溶液制备

取100ml去离子水加入2.5ml 1%氯金酸溶液，煮沸后，迅速加入1.5ml 2%柠檬酸三钠溶液，继续煮沸5分钟，冷却后，4℃避光保存。经测定，该胶体金颗粒直径为35nm左右。

6、胶体金标记呕吐毒素单抗的制备

移取制备的胶体金溶液100ml，用0.1M碳酸氢钠溶液调整pH值到8.0，加入1ml抗呕吐毒素单抗，搅拌15分钟，缓慢加入1ml 25M的聚乙二醇20000溶液，搅拌15分钟后，10000r/min离心15分钟。弃去上清液，加入2ml含2%BSA的pH7.4的磷酸盐缓冲液复溶后，4℃避光保存。

7、胶体金标记伏马毒素单抗的制备

移取制备的胶体金溶液100ml，用0.1M碳酸氢钠溶液调整pH值到8.0，加入1ml抗伏马毒素单抗，搅拌15分钟，缓慢加入1ml 25M的聚乙二醇20000溶液，搅拌15分钟后，10000r/min离心15分钟。弃去上清液，加入2ml含2%BSA的pH7.4的磷酸盐缓冲液复溶后，4℃避光保存。

8、试纸条的组装

用点膜机把适当浓度的DON-BSA偶联物、FB-BSA偶联物以及羊抗鼠IgG分别喷涂在反应膜上，作为检测线和质控线，37℃干燥箱内干燥5小时。将适当浓度的两种金标抗体分别喷涂在经过处理的胶体金结合垫上，37℃干燥箱内干燥5小时。在PVC背衬板上依次粘贴样品垫，胶体金结合垫，反应膜和吸水垫。组装完毕后，用切割机切割为3.5mm宽的试纸条，同干燥剂一起密封入铝箔袋中保存。

9、试纸条的检测操作办法

9.1样品前处理

取1g粉碎的样品置于10ml离心管中，加入5ml样品提取液，剧烈震荡3分钟，静置2分钟后，吸取0.5ml的上清液待用。

9.2 检测步骤

水平放置试纸条，吸取待测样品提取液100μl滴加到加样孔中，3-5分钟内读取实验结果。

9.3 结果判断

在光线充足处，水平放置检测板，读取结果。

质控线未显色，表示操作不当或试纸条已失效，应更换试纸条重新检测。

质控线显色，两条检测线都显色，表示样品中所含呕吐毒素及伏马毒素的量低于检测限或者不含呕吐毒素及伏马毒素。

质控线显色，两条检测线都不显色，表示样品中所含呕吐毒素及伏马毒素的量等于或高于检测限。

质控线显色，呕吐毒素的检测线显色而伏马毒素的检测线不显色，表示样品中所含呕吐毒素的量低于检测限或者不含呕吐毒素，而样品中所含伏马毒素的量等于或高于检测限。

质控线显色，呕吐毒素的检测线不显色而伏马毒素的检测线显色，表示样品中所含呕吐毒素的量等于或高于检测限，而样品中所含伏马毒素的量低于检测限或者不含与伏马毒素。

Claims

1.一种同步检测呕吐毒素和伏马毒素的免疫层析试纸条，其特征在于：试纸条由依次黏贴在背衬上的样品垫、胶体金结合垫、反应膜和吸水垫组成，且在相邻的地方有2mm的重叠，胶体金结合垫上喷有呕吐毒素单克隆抗体及伏马毒素单克隆抗体和胶体金颗粒的结合物；反应膜上从样品垫到吸水垫方向依次喷有呕吐毒素—牛血清白蛋白偶联物、伏马毒素—牛血清白蛋白偶联物和羊抗鼠抗体，分别作为检测线和质控线。

2.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于试纸条上的背衬为一面涂有不干胶的不吸水材料；样品垫用玻璃纤维制成；胶体金结合垫用聚酯膜或玻璃纤维素膜制成；反应膜用硝酸纤维素膜制成；吸水垫用吸水纸制成。

3.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于两条检测线和质控线呈间隔分布，相邻两条线之间的间距为3—5mm。

4.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于所用胶体金颗粒的直径为20—40nm。