CN103304495A - 一种喹乙醇代谢物半抗原制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种喹乙醇代谢物半抗原，相应的人工抗原和单克隆抗体，同时本发明也公开了所述喹乙醇代谢物半抗原，相应的人工抗原和单克隆抗体的制备方法及其应用。本发明提供的喹乙醇代谢物半抗原与载体蛋白连接可以得到喹乙醇代谢物抗原。所述喹乙醇代谢物抗原可应用于制备喹乙醇代谢物特异性抗体。本发明制备方法简便可行、成本较低，半抗原产率较高。本发明的喹乙醇代谢物人工抗原，通过免疫动物可产生了针对喹乙醇代谢物的特异性抗体，可用于制备检测食品中喹乙醇代谢物残留的酶联免疫试剂盒或者胶体金试纸卡，具有简单、快速、处理样品量大、灵敏度高、特异性强等诸多优点。

Description

一种喹乙醇代谢物半抗原制备方法及其应用

技术领域

本发明属于食品安全技术领域，具体涉及一种喹乙醇代谢物半抗原、抗原、单克隆抗体制备方法及其应用。

背景技术

喹乙醇(Olaquindox)，又名：快育灵、倍育诺(Bayonox)、奥拉金、喹酸胺醇、Fedan。分子式：C₁₂H₁₃N₃O₄。是1965年由德国Bayer公司由2-甲基喹噁啉-1、4-二氧化物与乙醇胺缩合而成的淡黄色结晶性粉末，微溶于水。

因其具有良好的广谱抗菌效果尤其是对大肠杆菌、沙门氏杆菌等革兰氏阴性致病菌所致的消化道疾病具有良好的治疗效果，并且有促进畜禽对饲料的消化利用，提高生长速度等作用而被广泛应用于饲料及饲料添加剂中。近年来在水产饲料中，喹乙醇曾一度被称为“水产瘦肉精”，经历了从被忽略毒副作用到被客观评价的过程。喹乙醇的毒性随动物种属不同存在较大差异，特别对禽和鱼类，有中度至明显蓄积毒性和一定遗传毒性，对部分鱼类有明显致畸作用。

喹乙醇的蓄积毒性不但能使动物发生中毒或死亡，且其可能残留在畜产品中，对人体也有较大危害。因此，使用时，必须严格按其使用范围、剂量浓度实行休药期。鉴于喹乙醇的毒性和存在的潜在危害，因而人们重新对喹乙醇的安全性进行评价，对喹乙醇的使用也做出了新的规定。美国没有批准使用；欧盟也从1999年开起始全面禁止使用喹乙醇；我国对喹乙醇使用的限制也更加严格。我国农业部颁布的《动物性食品兽药最高残留限量》中也列入了喹乙醇。国家进出口检验检疫局制定了肉中喹乙醇残留量的检验方法《中华人民共和国进出口商品检验行业标准出口肉中喹乙醇代谢物残留量检验方法SN 0197-93》也把鸡饲料、饮水及鱼饲料中的喹乙醇作为违禁药物进行监督检验。

由于动物在摄食喹乙醇后，3-甲基-喹噁啉-2-羧酸(MQCA)是最后离开动物机体的代谢物，也是喹乙醇的标示残留物，所以在监控喹乙醇残留时通常要分析其代谢产物MQCA的含量。

目前的喹乙醇检测方法多为色谱法，但是需要复杂昂贵的仪器，且样品前处理过程繁琐，不适应现场大量样本的筛查。基于抗原抗体免疫反应的免疫学检测技术为小分子残留物的分析检测提供了一个新的途径。该技术研究的关键是半抗原分子的设计、合成和人工抗原及抗体的制备。因为喹乙醇代谢物是小分子化合物，本身没有免疫原性，必须将其与大分子载体蛋白偶联得到具有免疫原性的人工抗原。在此基础上建立起来的酶联免疫检测试剂盒可快速、方便、准确的检测动物组织中的喹乙醇代谢物残留，可为建立监控动物源性食品中喹乙醇残留提供技术支持。

发明内容

本发明的目的是提供一种喹乙醇代谢物半抗原、抗原、特异性抗体制备方法及其应用。本发明提供的喹乙醇代谢物半抗原，是式(1)所示化产物：

式1

所述喹乙醇代谢物半抗原的合成路线示意图见图1。

本发明还公开了式(1)所示产物的制备方法，包括如下步骤：

(1)取0.38g喹乙醇代谢物(MQCA)，0.20g氨基丁酸及少量4-二甲氨基吡啶(DMAP)加入20mL干燥的二甲基甲酰胺(DMF)；

(2)0℃条件下缓慢滴加0.8g二环己基碳二亚胺(DCC)于5mL干燥的DMF混合液中，滴加完毕后自然升温至室温，继续反应40h；

(3)蒸除溶剂，柱层析纯化后得到MQCA与氨基丁酸的缩合物，即为式(1)所示产物。本发明提供的喹乙醇代谢物抗原，是将式(1)所示产物和载体蛋白偶联得到的偶联物。

所述喹乙醇代谢物抗原的结构示意图见图3。

本发明还公开了所述喹乙醇代谢物抗原的制备方法，包括如下步骤：

方法一：

(1)将30mg喹乙醇半抗原，充分溶解于1mL DMF中；

(2)称取载体蛋白50mg，使之充分溶解在3mL PBS(pH 7.2)中，将喹乙醇半抗原溶解液逐滴缓慢滴加到该载体蛋白溶液中得溶液A；

(3)称取12.5mg EDC，用1mL水溶解后缓慢于室温下加入A中，搅拌24h；

(4)用0.01mol/L PBS透析3d，每天换2次透析液，以除去未反应的小分子物质。以12000rpm离心30min，收集上清，分装，于-20℃保存备用。

方法二：

(1)将20mg喹乙醇半抗原用1.0mL DMF溶解，冷却至10℃，加入氯甲酸异丁酯15μL，10℃搅拌反应30min，即可得到反应液A。

(2)称取载体蛋白36mg，使之充分溶解在2.6mL 50mmol/L碳酸钠溶液中，将反应液A逐滴缓慢滴加到该溶液中。

(3)10℃反应4h，然后4℃过夜。

(4)用0.01mol/L PBS透析3d，每天换2次透析液，以除去未反应的小分子物质。以12000rpm离心30min，收集上清，分装，于-20℃保存备用。

常用载体蛋白均可采用，如牛血清白蛋白(BSA)，卵清蛋白(OVA)，人血清白蛋白(HSA)，鼠血清白蛋白(MSA)，甲状腺蛋白(TG)或血蓝蛋白(KLH)等。

所述喹乙醇代谢物抗原可以作为免疫原制备喹乙醇代谢物特异性抗体，也可以作为包被原制备酶标板。

所述抗体具体可为单克隆抗体。

本发明保护保藏编号为CGMCC NO.5886的喹乙醇代谢物单克隆杂交瘤细胞株D-3-3。

杂交瘤细胞株D-3-3已于2012年03月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏登记号为CGMCCNO.5886。

应用喹乙醇代谢物抗原制备得到的抗体也属于本发明的公开范围。是由保藏编号为CGMCC NO.5886的喹乙醇代谢物单克隆杂交瘤细胞株D-3-3分泌产生的。

所述抗体可应用于检测喹乙醇代谢物。

应用喹乙醇代谢物抗原和喹乙醇代谢物单克隆抗体制备得到的酶联免疫试剂盒也属于本发明的公开范围。

所述酶联免疫检测试剂盒，是由包被有包被原的酶标板、酶标二抗、喹乙醇代谢物特异性抗体浓缩液、喹乙醇代谢物系列标准品、底物显色液、终止液、复溶工作液、浓缩洗涤液组成。

本发明依靠免疫学、免疫化学基本原理和残留分析技术手段，设计、合成小分子目标分析物半抗原，并与载体蛋白偶联，制备有效人工抗原，免疫动物制备针对小分子分析物的特异性抗体。利用抗原抗体的特异性免疫学反应，定性的检测样本中微量小分子目标分析物，具有特异、灵敏、准确、快速、方便、廉价等特点。本发明制备方法简便可行、成本较低，半抗原产率较高。本发明克服了现有检测技术中对喹乙醇代谢物样品预处理复杂、耗时、且需要大量有机溶剂萃取，以及在检测过程中要用到精密昂贵的检测仪器而不适于推广使用等缺点。本发明的喹乙醇代谢物人工抗原，通过免疫动物可产生了针对喹乙醇代谢物的特异性抗体，用于快速检测食品中的喹乙醇代谢物残留，具有简单、快速、处理样品量大、灵敏度高、特异性强等诸多优点。

附图说明

图1为喹乙醇代谢物半抗原合成路线图。

图2为喹乙醇代谢物半抗原核磁共振氢谱图。

图3为喹乙醇代谢物抗原的结构示意图。

图4为喹乙醇代谢物酶联免疫检测试剂盒标准曲线。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1、喹乙醇代谢物半抗原的制备和鉴定

一、喹乙醇代谢物半抗原的制备

(1)取0.38g MQCA，0.20g氨基丁酸及少量DMAP加入20mL干燥的DMF；

(2)0℃条件下缓慢滴加0.8g DCC于5mL干燥的DMF混合液中，滴加完毕后自然升温至室温，继续反应40h；

(3)蒸除溶剂，柱层析纯化后得到MQCA与氨基丁酸的缩合物，即为式(1)所示产物。

二、喹乙醇代谢物半抗原的鉴定

将步骤一制备得到的喹乙醇代谢物半抗原核磁鉴定。

核磁图见图2。图谱显示12.0左右的羧基信号峰以及1.5-3.5之间增加的亚甲基信号峰说明半抗原合成成功。

实施例2、喹乙醇代谢物人工抗原的制备和鉴定

一、喹乙醇代谢物免疫抗原的合成

(1)将30mg喹乙醇半抗原，充分溶解于1mL DMF中；

(2)称取BSA50mg，使之充分溶解在3mL PBS(pH 7.2)中，将喹乙醇半抗原溶解液逐滴缓慢滴加到该BSA溶液中得溶液A；

(3)称取12.5mg EDC，用1mL水溶解后缓慢于室温下加入A中，搅拌24h；

(4)用0.01mol/L PBS透析3d，每天换2次透析液，以除去未反应的小分子物质。以12000rpm离心30min，收集上清，分装，于-20℃保存备用。

二、喹乙醇代谢物包被抗原的合成

(1)将20mg喹乙醇半抗原用1.0mL DMF溶解，冷却至10℃，加入氯甲酸异丁酯15μL，10℃搅拌反应30min，即可得到反应液A。

(2)称取OVA36mg，使之充分溶解在2.6mL 50mmol/L碳酸钠溶液中，将反应液A逐滴缓慢滴加到该溶液中。

(3)10℃反应4h，然后4℃过夜。

(4)用0.01mol/L PBS透析3d，每天换2次透析液，以除去未反应的小分子物质。以12000rpm离心30min，收集上清，分装，于-20℃保存备用。

三、喹乙醇代谢物人工抗原的鉴定

按合成喹乙醇代谢物免疫抗原和包被抗原反应所用的半抗原、载体蛋白与偶联产物的比例，分别进行紫外(200nm-400nm)扫描鉴定，并通过比较三者在同一波长下的吸光值计算其结合比。产物的紫外光谱图与载体蛋白相比发生了变化，说明半抗原已经与载体蛋白成功偶联制得喹乙醇代谢物人工抗原。经计算，喹乙醇代谢物半抗原分子与牛血清白蛋白(BSA)分子的结合比为12∶1，喹乙醇代谢物半抗原分子与卵清蛋白(OVA)分子的结合比为15∶1。

实施例3、单抗的制备和特异性鉴定

一、喹乙醇代谢物单抗的制备

1、用上述制备出的免疫原(MQCA-BSA)按100μg/只，以生理盐水溶解免疫原与弗氏完全佐剂等体积混匀，颈背部皮下注射免疫6～8周龄Balb/c雌鼠，初次免疫后第7、14、28天以免疫原与弗氏不完全佐剂等体积混匀，各追加免疫一次，融合前3天以免疫复合物100μg/只，不加弗氏佐剂再追加免疫一次。

2、按常规方法进行，取免疫小鼠的脾细胞与处于对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)混合，然后在45秒内缓慢加入预热的融合剂(PEG4000)进行融合，用HAT培养基悬浮均匀，再加入适量的饲养细胞，培养于96孔培养板，于37℃，5％CO₂培养箱中培养，5天后用HT培养基半换液，9天时候进行全换液。

3、细胞融合后，待细胞长到培养孔面积的1/4时，采用分步筛选法筛选杂交瘤细胞。初选采用间接ELISA方法，以包被抗原(预先用方阵法常规滴定其最佳包被浓度和阳性血清稀释度)包被酶标板，加入被测孔培养上清，孵育，清洗后加入羊抗鼠IgG-HRP和IgM-HRP，OPD进行显色反应。筛选出的阳性孔再用间接竞争ELISA方法筛选，先将细胞上清与100μg/mL的喹乙醇代谢物等体积混合，37℃水浴作用30min，再加入到包被好的酶标板中。同时用PBS取代喹乙醇代谢物作对照，其余步骤同上。若经喹乙醇代谢物阻断后的OD₄₅₀nm值下降到对照孔的50％以下，则判为阳性，经2～3次检测都为阳性的孔，立即用有限稀释法进行亚克隆化。

4、将2～3次亚克隆建株后的杂交瘤细胞扩大培养，收集上清液用间接ELISA测定效价，冻存；并取8～10周龄Balb/c小鼠腹腔注射液体石蜡0.5mL/只，7～10日后腹腔注射杂交瘤细胞1～2×10⁶/只，7～10日后抽取小鼠腹水，离心取上清，测定效价，并冻存备用。

5、最后获得稳定分泌抗喹乙醇代谢物单克隆抗体细胞株D-3-3，该细胞株已于2012年03月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏登记号为CGMCC NO.5886。

二、喹乙醇代谢物抗体效价的测定

喹乙醇代谢物标准品购自Sigma公司。

用方阵滴定法确定喹乙醇代谢物包被抗原和步骤一制备的单抗的工作浓度，喹乙醇代谢物包被抗原的工作浓度为5.0μg/mL，单克隆抗体的工作浓度为1∶32000。

用不同浓度的喹乙醇代谢物标准品溶液做实验溶液，其浓度如下：0、1、3、9、27、81μg/L。采用8组平行试验(n＝8)。

(1)间接竞争性ELISA方法：用上述工作浓度的抗原包被酶标板，将喹乙醇代谢物标准品实验溶液与抗体溶液同时加入酶标板小孔中，同时设置空白孔(将添加的抗体溶液换成高纯水，其它一致)和阴性对照孔(将添加的实验溶液用PBS溶液代替，其它一致)，4℃孵育30min；

(2)倒出孔内液体，用洗涤液洗涤3～5次，将酶标板倒置在吸水纸上拍打；

(3)加入酶标二抗溶液于酶标板小孔中，25℃温育30min，用洗涤液重复洗3～5次，吸干；

(4)加入底物显色溶液到酶标板小孔中，室温下反应10～15min，用酶标仪在波长450nm处测定OD值；

(5)以OD值为纵坐标，以喹乙醇代谢物实验溶液浓度的对数值为横坐标，绘制标准曲线图。标准曲线具有完整的反S形状，并具有上平台和下平台，标准曲线的平行测定次数8次，实验重复性良好，相对标准偏差(变异系数)均在10％以内。

根据标准曲线得出半数抑制量(IC₅₀)，确定检测灵敏度。

抑制率用以下式计算：

式中：ODmax：为不加标准品时的吸光值，ODx为标准品x时的吸光值，ODmin为空白对照孔的吸光值。

由上述公式计算得喹乙醇代谢物抗体在缓冲液中的半数抑制量(IC₅₀)为3.8ng/mL。

实施例4、检测喹乙醇代谢物的酶联免疫试剂盒及其制备

一、酶联免疫试剂盒由下述物质组成：

(1)包被喹乙醇代谢物与载体蛋白偶联物(MQCA-OVA)的酶标板；

(2)喹乙醇代谢物抗体浓缩液：实施例1中所述单克隆抗体。抗体浓缩液是用复溶工作液稀释实施例1中的纯化单克隆抗体得到的；

(3)喹乙醇代谢物标准品：喹乙醇代谢物标准品溶液浓度分别为0、1、3、9、27、81μg/L，用复溶工作液稀释成上述各浓度；

(4)酶标二抗：辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG单克隆抗体；

(5)底物显色液：由A液和B液组成，A液为2％过氧化脲的水溶液，B液为1％四甲基联苯胺(TMB)的水溶液；

(6)终止液：0.2M硫酸水溶液；

(7)浓缩洗涤液：每1升所述洗涤液是按照如下方法配制得到的：将10mL吐温-20、5g叠氮化钠和990mL磷酸盐缓冲液混合，得到所述洗涤液；所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.01MpH值为7.4；

(8)复溶工作液：0.02mol/L的磷酸盐缓冲液。

二、试剂盒组分的制备

包被有包被原的酶标板及其制备

包被有合成抗原MQCA-OVA的聚苯乙烯酶标板：用0.05M的碳酸盐溶液将抗原作1：50000倍稀释(5.0μg/mL)，包被96孔聚苯乙烯酶标板，每孔100μL，37℃温育2h，倾去包被液，用洗涤液洗涤3次，每次10s，拍干，然后在每孔中加入150μL封闭液，37℃温育2h，倾去孔内液体，干燥后用铝膜真空密封保存。

包被缓冲液：pH9.6，0.05mol/L的碳酸钠缓冲液；

封闭液：每1升封闭液按照如下方法配制：将5mL马血清、1g叠氮化钠、30g酪蛋白混合，用磷酸盐缓冲液溶解并定容至1000mL，得到封闭液；其中，磷酸盐缓冲液的浓度为0.02M，pH值为7.2。

三、试剂盒检测方法

(一)鸡肉、猪肉、鱼、虾样品前处理

(1)称取1.0±0.05g均质样品至50mL聚苯乙烯离心管中，加入8mL乙酸乙酯，加入1ml去离子水，用振荡器振荡5min；

(2)再加入1mL 2M H₂SO₄溶液，振荡30s，3000g以上，室温(20～25℃)离心5min；

(3)取4mL上清液至10mL干净玻璃试管中，于50～60℃水浴氮气流下吹干；

(4)加入1mL正己烷，用涡旋仪涡动30s溶解干燥残留物，加入1mL复溶液工作液，用涡旋仪涡动2min，3000g以上，室温(20～25℃)离心5min；

(5)除去上层正己烷相，取下层水相50μL用于分析。

组织样本稀释倍数为：2

(二)用试剂盒检测

1、标准曲线的制作

向包被有包被原的酶标板微孔中加入喹乙醇代谢物标准品溶液50μL，用复溶工作液将抗体浓缩液按1∶10的体积比稀释(即1份抗体浓缩液加入到10份复溶工作液中)，充分混合均匀后，将抗体工作液按50μL/孔加入微孔板中，轻轻振荡混合均匀，用盖板膜盖板后置4℃避光环境中反应30min，倒出孔中液体，每孔加入250μL洗涤液，10s后倒出孔中液体，如此重复操作共洗板5次，用吸水纸拍干。加入酶标二抗工作液100μL，25℃恒温箱中反应30min，倒出孔中液体，重复洗涤步骤，加入底物A液50μL/孔、底物B液50μL/孔，轻轻振荡混匀，25℃恒温箱避光显色15min，每孔加入终止液50μL，轻轻振荡混匀，用酶标仪，测定每孔吸光度值。

用每个浓度的标准品溶液的吸光度平均值(B)除以第一个标准品溶液(0标准)的吸光度值(B₀)再乘以100％，得到百分吸光度值。以喹乙醇代谢物标准品浓度(μg/L)的对数值为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线图。得到的标准曲线如图4所示。

百分吸光度值(％)＝(B/B₀)×100％

2、样品中喹乙醇代谢物浓度的测定

用每个检测样本溶液的吸光度平均值(B)除以第一个标准品溶液(0标准)的吸光度值(B₀)再乘以100％，得到百分吸光度值。相对应每一个检测样本溶液的百分吸光度值，则可从标准曲线上读出检测样本溶液的吸光度值，再根据标准品溶液的浓度值换算出样本溶液中喹乙醇代谢物的残留量，最后再乘以各样品前处理过程的稀释倍数，即可计算出样品中喹乙醇代谢物的浓度。

四、试剂盒检测效果评价

(一)最低检测限：对20份空白样本进行检测，通过标准曲线计算各空白样品浓度，以20份样本喹乙醇代谢物浓度的平均值加上3倍标准差表示检测限，结果得该方法对鸡肉、猪肉、鱼、虾检测限为1.0μg/kg。

(二)准确度和精密度试验

向不含喹乙醇代谢物的样品(鸡肉、猪肉、鱼、虾)中添加喹乙醇代谢物标准品，使喹乙醇代谢物标准品在样品中的终浓度分别为2.0、4.0、8.0μg/kg；将添加后的样品分别按照实验三中所述方法进行前处理，得到检测样本溶液。

从三个不同批次的试剂盒中各抽取3个试剂盒进行检测，检测方法如实验三中所述，每个实验重复5次，分别计算变异系数。结果分别见表1。

表1准确度和精密度试验结果

批内变异系数：同一次测定中各平行样本的变异系数。

批间变异系数：同一样本在不同批次测定结果的变异系数，取其平均值。

结果表明：所有样品的添加回收率在80.7～108.1％，批内变异系数在5.2～13.5％，批间变异系数在6.0～14.8％。

(三)试剂盒保存期

试剂盒保存条件为2～8℃，经过15个月的测定，试剂盒的最大吸光度值(0标准)，50％抑制浓度、喹乙醇代谢物添加实际测定值均在正常范围之内。考虑到运输和使用过程中，会有非正常保存条件出现，将试剂盒在37℃保存的条件下放置9天，进行加速老化实验，结果表明该试剂盒的各项指标完全符合要求。考虑到试剂盒冷冻情况发生，将试剂盒放入-20℃冰箱冷冻9天，测定结果也表明试剂盒各项指标完全正常。从以上结果可得出试剂盒可以在2～8℃至少可以保存12个月以上。

(四)交叉反应率试验

选择与喹乙醇结构或功能相似的其他药物进行交叉反应试验，通过各种药物的标准曲线分别得到其50％抑制浓度。用下式计算试剂盒对其它类似物的交叉反应率。与其他药物的交叉反应率越小，说明喹乙醇代谢物酶联免疫检测试剂盒对喹乙醇代谢物的检测特异性越好。结果见表2。

表2喹乙醇代谢物试剂盒交叉反应率

药物名称	交叉反应率(％)
		喹乙醇代谢物	100.0
2-喹恶啉羧酸	7.0
		喹乙醇	＜1.0
卡巴氧	＜1.0

试验结果表明，本发明试剂盒对2-喹恶啉羧酸、喹乙醇、卡巴氧的交叉反应率均不大于10％，所以试剂盒对喹乙醇代谢物的特异性好，即本发明试剂盒可以检测喹乙醇代谢物。

Claims (9)

1.一种喹乙醇代谢物半抗原，为式(1)所示产物：

式1

2.式(1)所示产物的制备方法，包括如下步骤：

(1)取0.38g MQCA，0.20g氨基丁酸及少量DMAP加入20mL干燥的DMF；

(2)0℃条件下缓慢滴加0.8g DCC于5mL干燥的DMF混合液中，滴加完毕后自然升温至室温，继续反应40h；

(3)蒸除溶剂，柱层析纯化后得到MQCA与氨基丁酸的缩合物，即为式(1)所示产物。

3.一种喹乙醇代谢物抗原，是将式(1)所示产物和载体蛋白偶联得到的偶联物。

4.权利要求3所述喹乙醇代谢物抗原的制备方法，包括如下步骤：

方法一：

(1)将30mg喹乙醇半抗原，充分溶解于1mL DMF中；

(2)称取载体蛋白50mg，使之充分溶解在3mL pH 7.2的PBS中，将喹乙醇半抗原溶解液逐滴缓慢滴加到该载体蛋白溶液中得溶液A；

(3)称取12.5mg EDC，用1mL水溶解后缓慢于室温下加入A中，搅拌24h；

(4)用0.01mol/L PBS透析3d，每天换2次透析液，以除去未反应的小分子物质。以12000rpm离心30min，收集上清，分装，于-20℃保存备用。

方法二：

(1)将20mg喹乙醇半抗原用1.0mL DMF溶解，冷却至10℃，加入氯甲酸异丁酯15μL，10℃搅拌反应30min，即可得到反应液A。

(2)称取载体蛋白36mg，使之充分溶解在2.6mL 50mmol/L碳酸钠溶液中，将反应液A逐滴缓慢滴加到该溶液中。

(3)10℃反应4h，然后4℃过夜。

(4)用0.01mol/L PBS透析3d，每天换2次透析液，以除去未反应的小分子物质。以12000rpm离心30min，收集上清，分装，于-20℃保存备用。

5.权利要求3所述喹乙醇代谢物抗原在制备喹乙醇代谢物特异性抗体中的应用。

6.应用权利要求3所述喹乙醇代谢物抗原制备得到的特异性抗体。

7.权利要求6所述抗体在检测喹乙醇代谢物中的应用。

8.应用权利要求1所述产物、权利要求3所述喹乙醇代谢物抗原、权利要求6所述特异性抗体制备得到的酶联免疫检测试剂盒。

9.权利要求8所述酶联免疫检测试剂盒，其特征在于它含有：包被有包被原的酶标板、酶标二抗、喹乙醇代谢物特异性抗体浓缩液、喹乙醇代谢物系列标准品、底物显色液、终止液、复溶工作液、浓缩洗涤液。

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