CN105116148A - 一种检测五氯酚钠的试纸条及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测五氯酚钠的试纸条及方法。试纸条包括试纸和微孔试剂，所述试纸由样品吸收垫、反应膜、吸水垫、保护膜、底板依次连接组成，反应膜上包括检测线和质控线，检测线包被有五氯酚钠半抗原‐载体蛋白偶联物，质控线包被有羊抗鼠抗抗体，所述微孔试剂中冻干有五氯酚钠单克隆抗体‐胶体金标记物。用本发明试纸条检测五氯酚钠的方法简便、快速、直观、准确、便于携带、适用范围广、成本低、易推广使用。

Description

一种检测五氯酚钠的试纸条及方法

技术领域

本发明涉及一种检测五氯酚钠的试纸条及方法，具体涉及一种用于检测五氯酚钠的胶体金试纸条，其特别适于猪肉、鸡肉、鱼、虾等动物组织中五氯酚钠残留的检测。

技术背景

五氯酚钠(PentachlorophenoI-Na，简写PCP-Na)是五氯酚的钠盐，属有机氯农药，通常为白色针状或鳞片状结晶，易挥发，有明显的刺鼻气味。易溶于水，4℃时溶解度为20.8％，其水溶液有强烈的酚臭味，性质稳定，在阳光的直接照射下不易分解。五氯酚钠作为一种高效、廉价的杀虫剂、抗菌剂、防腐剂和除草剂，在世界范围内被广泛使用。20世纪50-60年代，我国曾经大量使用五氯酚钠盐杀灭血吸虫的寄主钉螺，效果明显，但五氯酚钠性质比较稳定，对水体造成污染。同时，五氯酚钠在动植物体内的富集率高，可通过食物链进入人体，严重危害人体健康。因此，美国环境保护署(EPA)将五氯酚钠列为可疑致癌物质，并限制其使用。我国农业部于2002年也将五氯酚钠列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》，禁止在水生动物养殖中使用。

GB29708-2013《食品安全国家标准动物性食品中五氯酚钠残留量的测定》使用气相色谱-质谱法测定动物性食品中的五氯酚钠残留量，仪器方法具有灵敏度高、结果准确等优点，但是资金和人员等投入成本较高。因此，针对现有五氯酚钠检测技术上的不足，我们设计了一种利用胶体金免疫层析技术检测猪肉、鸡肉、鱼、虾等动物组织中五氯酚钠的方法，该方法特异性好、灵敏度高、操作简便、检测成本低、适合于批量样品的筛选检测，是理想的快速筛选手段，能够更好地满足我国猪肉、鸡肉、鱼、虾等动物组织企业、政府职能监管部门等开展检测工作。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种检测五氯酚钠的试纸条。

本发明所提供的试纸条包括试纸和微孔试剂，试纸包括底板、样品吸收垫、反应膜、吸水垫、保护膜，其依次连接，反应膜上有检测线和质控线，检测线上包被有五氯酚钠半抗原-载体蛋白偶联物，质控线上包被有羊抗鼠抗抗体；微孔试剂具有微孔塞，其中冻干有五氯酚钠单克隆抗体-胶体金标记物。

所述五氯酚钠半抗原-载体蛋白偶联物是由五氯酚钠半抗原与载体蛋白偶联得到，所述五氯酚钠半抗原是由五氯酚钠与4溴丁酸乙酯反应得到，所述载体蛋白可为牛血清白蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白、甲状腺蛋白、人血清白蛋白。

所述五氯酚钠单克隆抗体-胶体金标记物中的五氯酚钠单克隆抗体是以五氯酚钠半抗原-载体蛋白作为免疫原制备获得。

所述样品吸收垫上粘贴有保护膜，为检测端，上面有MAX标记线。

所述检测线位于近于有MAX标记的保护膜的一端，所述质控线位于远离有MAX标记的保护膜的一端。

所述底板可为PVC底板或其他硬质不吸水的材料；所述样品吸收垫可为吸滤纸或滤油纸；所述吸水垫为吸水纸；所述反应膜可为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜；所述保护膜为PE材质保护膜。

本发明的另一个目的是提供一种制备上述试纸条的方法，其包括步骤：

1)制备冻干有五氯酚钠单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂；

2)制备具有包被五氯酚钠半抗原-载体蛋白偶联物的检测线和包被羊抗鼠抗抗体的质控线的反应膜；

3)将2)制备好的反应膜与样品吸收垫、吸水垫、保护膜、底板组装成试纸；

4)将1)和3)制备好的冻干有五氯酚钠单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂和试纸组装成试纸条。

具体地说，步骤包括：

1)将五氯酚钠与4溴丁酸乙酯反应，制备五氯酚钠半抗原；

2)将五氯酚钠半抗原与载体蛋白偶联，制备五氯酚钠半抗原-载体蛋白偶联物；

3)用五氯酚钠半抗原-载体蛋白偶联物免疫小鼠，将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞通过融合、筛选，得到分泌五氯酚钠单克隆抗体的杂交瘤细胞株；

4)提取小鼠IgG免疫健康山羊，得到羊抗鼠抗抗体；

5)分别将五氯酚钠半抗原-载体蛋白偶联物和羊抗鼠抗抗体包被于反应膜的检测线(T)和质控线(C)；

6)用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金；

7)将制备的五氯酚钠单克隆抗体加入到制备的胶体金中，得到五氯酚钠单克隆抗体-胶体金标记物；

8)将五氯酚钠单克隆抗体-胶体金标记物冻干在微孔试剂中后，将微孔试剂加上微孔塞；

9)将样品吸收垫用含0.5％牛血清白蛋白(体积百分含量)、pH为7.2、0.1mol/L磷酸盐缓冲液浸泡2h，37℃下烘干2h；

10)在底板上按顺序粘贴上样品吸收垫、反应膜、吸水垫和保护膜；

11)将制备好的微孔试剂和试纸组装成试纸条，2～8℃条件下保存12个月。

本发明的另一个目的是提供一种应用上述试纸条检测样品中五氯酚钠残留的方法，它包括步骤：

(1)样品前处理；

(2)用试纸条进行检测；

(3)分析检测结果。

本发明试纸条的检测原理：将待检样品液滴加于微孔试剂中，混匀后，孵育3min，将试纸标有MAX标记线端向下，插入孵育后的微孔试剂中，待检样品液与微孔中的金标抗体结合后一起向反应膜扩散；若待检样品液中五氯酚钠的含量高，则扩散过程中待检样品液中的五氯酚钠可与金标抗体相结合，进而完全封闭金标抗体上五氯酚钠的抗原结合点，阻止金标抗体与反应膜上五氯酚钠半抗原-载体蛋白偶联物结合，检测线显色明显弱于质控线或不显色，而抗抗体则可与金标抗体结合，质控线显色；若待检样品液中五氯酚钠的含量低或无，则金标抗体上的抗原结合位点不能被封闭，进而金标抗体会与反应膜上五氯酚钠半抗原-载体蛋白偶联抗原结合，检测线显色强于质控线或与质控线显色无差异，同时抗抗体也可与金标抗体结合，质控线显色。如果质控线不显色，则试纸失效。如图4所示。

阳性：当质控线(C)显示出红色条带，而检测线(T)显色明显弱于质控线(C)或不显色，判为阳性。

阴性：当质控线(C)显示出红色条带，检测线(T)显色强于质控线(C)或与质控线(C)显色无差异，判为阴性。

无效：当质控线(C)不显示出红色条带，则无论检测线(T)显示出红色条带与否，该试纸均判为无效。

本发明的试纸条具有灵敏度高、特异性强、成本低、操作简单、检测时间短、适合各种单位使用、储存简单、保质期长的优点。其中，采用高特异性的五氯酚钠单克隆抗体，保证了检测结果的可靠性；将金标抗体冻干在微孔试剂中，在检测过程中，能够使金标抗体与待检样品液充分接触，充分反应，从而减少误差，增加整个体系的反应灵敏度。用本发明试纸条检测五氯酚钠的方法，简便、快速、直观、准确、适用范围广、成本低、易推广使用。

附图说明

图1为试纸剖面结构示意图；

图2为试纸俯视图；

图3为微孔试剂图；

图4为试纸检测结果判定图；

图5为五氯酚钠半抗原合成路线图；

图6为五氯酚钠半抗原核磁共振氢谱图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1检测五氯酚钠的试纸条的构成

一、试纸(图1)

所述试纸是由底板、样品吸收垫、反应膜、吸水垫、保护膜组成；

所述样品吸收垫1、反应膜2、吸水垫3和保护膜7依次按顺序粘贴在底板6上，样品吸收垫的末端与反应膜相连，反应膜的末端与吸水垫相连，样品吸收垫的始端与底板的始端对齐，吸水垫的末端与底板的末端对齐；

所述试纸粘贴有保护膜，保护膜7覆盖在样品吸收垫上，为检测端，上面印有MAX字样(图2)；

所述反应膜上有检测线4和质控线5，均呈与所述试纸的长相垂直的条带状，检测线位于近于有MAX标记的保护膜的一端，质控线位于远离有MAX标记的保护膜的一端，检测线包被有五氯酚钠半抗原-载体蛋白偶联物(五氯酚钠半抗原-卵清蛋白的偶联物)，质控线包被有羊抗鼠抗抗体；

所述底板为PVC底板；所述样品吸收垫为吸滤纸；所述吸水垫为吸水纸；所述反应膜为硝酸纤维素膜；所述保护膜为PE材质保护膜。

二、微孔试剂(图3)

所述微孔试剂8中冻干有五氯酚钠单克隆抗体-胶体金标记物；所述微孔试剂具有微孔塞9。

将上述试纸与微孔试剂组装成试纸条，在2～8℃环境中保存，有效期12个月。

实施例2实施例1中所述试纸条的制备方法

一、试纸条的制备

该试纸条的制备方法主要包括以下步骤：

1)制备冻干有五氯酚钠单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂；

2)制备具有包被五氯酚钠半抗原-载体蛋白偶联物的检测线和包被羊抗鼠抗抗体的质控线的反应膜；

3)将2)制备好的反应膜与样品吸收垫、吸水垫、保护膜、底板组装成试纸；

4)将1)和3)制备好的冻干有五氯酚钠单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂和试纸组装成试纸条。

下面分步详细叙述：

(一)各部件的制备

1、五氯酚钠半抗原-载体蛋白偶联物的合成与鉴定

五氯酚钠是小分子物质，只有免疫反应性，没有免疫原性，不能诱发机体产生免疫应答，必须与大分子载体蛋白偶联后才具有免疫原性。

(1)五氯酚钠半抗原的制备(图5)

1.0g五氯酚钠与4溴丁酸乙酯在DMF中，在无水碳酸钾与碘化钠的催化下，反应生成五氯酚-4溴-丁酸乙酯产物，经乙酸乙酯萃取，水洗，柱层析纯化分离，得到中间产物，中间产物在氢氧化钾的水溶液中加热反应，水解生成半抗原，经乙酸乙酯提取，二氯甲烷重结晶，得到半抗原产物。

取上述产物经核磁共振氢谱测定，如图6所示，化学位移在4.0ppm处的为邻近酚氧的亚甲基信号峰，2.0ppm处两组为亚甲基信号峰，11ppm处为羧基氢信号峰，说明半抗原合成成功。

(2)免疫原的制备——五氯酚钠半抗原与牛血清白蛋白(BSA)偶联物合成

取18mg半抗原，溶解于1mLDMF中，得到溶液(1)，取氯甲酸异丁酯50ul加入(1)中，4℃下搅拌30min，得到反应液A。称取BSA50mg，使之充分溶解在4.0mLPBS(PH7.2)中，将反应液A逐滴缓慢滴加到蛋白溶液中，并于室温下搅拌24h，用0.01mol/LPBS4℃透析3d每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质。分装，于-20℃保存备用。

(3)包被原的制备——五氯酚钠半抗原与卵清蛋白(OVA)偶联物合成

取18mg半抗原，溶解于1mLDMF中，得到溶液(1)，取氯甲酸异丁酯50ul加入(1)中，4℃下搅拌30min，得到反应液A。称取OVA50mg，使之充分溶解在4.0mLPBS(PH7.2)中，将反应液A逐滴缓慢滴加到蛋白溶液中，并于室温下搅拌24h，用0.01mol/LPBS4℃透析3d每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质。分装，于-20℃保存备用。

(4)五氯酚钠半抗原-载体蛋白偶联物的鉴定

将五氯酚钠半抗原、载体蛋白、五氯酚钠半抗原-载体蛋白偶联物用pH7.4的PBS配成0.5mg/ml的溶液，以0.01mol/LpH7.4PBS调零，用紫外分光光度计在波长200～800nm范围内扫描，得到五氯酚钠半抗原、载体蛋白、五氯酚钠半抗原-载体蛋白偶联物的吸收曲线。三者出现不同的吸收曲线，表明五氯酚钠半抗原与载体蛋白偶联成功。

2、五氯酚钠单克隆抗体的制备

(1)动物免疫

将步骤1得到的免疫原注入Balb/c小鼠体内，免疫剂量为150μg/只，使其产生抗血清。

(2)细胞融合和克隆化

取免疫Balb/c小鼠脾细胞，按8:1(数量配比)比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

(3)细胞冻存和复苏

将杂交瘤细胞用冻存液制成1×10⁶个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。

(4)单克隆抗体的制备与纯化

增量培养法：将杂交瘤细胞置于细胞培养基中，在37℃条件下进行培养，用辛酸-饱和硫酸铵法将得到的培养液进行纯化，得到单克隆抗体，-20℃保存。

所述细胞培养基为向RPMI1640培养基中添加小牛血清和碳酸氢钠，使小牛血清在细胞培养基中的质量分数为20％，碳酸氢钠在细胞培养基中的质量分数为0.2％；所述细胞培养基的pH为7.4。

3、羊抗鼠抗抗体的制备

以羊作为免疫动物，以鼠源抗体为免疫原对无病原体羊进行免疫，得到羊抗鼠抗抗体。

4、五氯酚钠单克隆抗体-胶体金标记物的制备

(1)胶体金的制备

用双蒸去离子水将质量分数为1％的氯金酸稀释成0.01％，取100ml置于锥形瓶中，用恒温电磁搅拌器加热至沸腾，在持续高温、持续搅拌下加入2.5ml质量分数为1％的柠檬酸三钠，继续匀速搅拌加热至溶液呈透亮的红色时停止，冷却至室温后用去离子水恢复到原体积，4℃保存。制备好的胶体金外观纯净、透亮、无沉淀和漂浮物。

(2)五氯酚钠单克隆抗体-胶体金标记物的制备

在磁力搅拌下，用0.2mol/L碳酸钾溶液调胶体金的pH至7.2，按每毫升胶体金溶液中加入20～50μg的标准向胶体金溶液中加入上述五氯酚钠单克隆抗体，搅拌混匀，室温静置10min，加入10％牛血清白蛋白，使其在胶体金溶液中的体积分数为1％，静置10min。12000r/min，4℃离心40min，弃上清液，沉淀用复溶缓冲液洗涤两次，用体积为初始胶体金体积1/10的复溶缓冲液将沉淀重悬，置4℃备用。

复溶缓冲液：含牛血清白蛋白的体积分数为0.1％～0.3％、吐温-80的质量分数为0.05％～0.2％、pH7.2的0.02mol/L磷酸盐缓冲液。

5、将五氯酚钠单克隆抗体-胶体金标记物冻干到微孔中

向微孔试剂微孔中加入100μl五氯酚钠单克隆抗体-胶体金标记物，放入冷冻干燥机中，在冷阱温度为-50℃条件下，预冻3h后，再真空干燥15h，即可取出，得到冻干有五氯酚钠单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂，密封保存。

6、样品吸收垫的制备

将样品吸收垫置于体积分数为0.5％牛血清白蛋白、pH为7.2的0.1mol/L磷酸盐缓冲液中浸泡2h，37℃烘2h备用。

7、反应膜的制备

包被过程：用磷酸缓冲液将五氯酚钠半抗原-卵清蛋白偶联物稀释到1mg/ml，用Isoflow点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的检测线(T)，包被量为1.0μl/cm；用0.01mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液将羊抗鼠抗抗体稀释到200μg/ml，用Isoflow点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的质控线(C)，包被量为1.0μl/cm。将包被好的反应膜置于37℃条件下干燥2h，备用。

(二)各部件的组装

1、试纸的组装

将所述样品吸收垫、反应膜、吸水垫、保护膜依次按顺序粘贴在所述底板上；样品吸收垫的末端与反应膜的始端相连，反应膜的末端与吸水垫的始端相连，样品吸收垫的始端与底板的始端对齐，吸水垫的末端与底板的末端对齐；在组装好的试纸上粘贴保护膜，保护膜上印有MAX标记线的一端粘贴在样品吸收垫上。

2、试纸条的组装

将上述步骤1得到的试纸与微孔试剂组装成试纸条，在2～8℃的环境中贮存，有效期12个月。

实施例3猪肉、鸡肉、鱼、虾等动物组织中五氯酚钠的检测

1、样品前处理

(1)取已去脂肪的组织样本于均质器中均质；

(2)称取2g匀浆好的组织样本至15ml聚苯乙烯离心管中，加入1瓶样本提取剂，用涡旋仪涡动3min，室温(20～25℃)3000rpm以上离心5min；

(3)移取3ml上层有机相至10ml聚苯乙烯离心管中，于50～60℃水浴氮气流或空气流下吹干；

(4)加入300μl样本复溶液，用涡旋仪涡动20s后待检。

2、用试纸条检测

从原包装中取出试剂桶和试纸袋，取出所需数目的微孔试剂和试纸条，并做好标记。请在60min内尽快使用。所需微孔试剂取出后，请立即盖好试剂桶盖，防止受潮。用微量移液器吸取100μl待检样本溶液于微孔中，缓慢抽吸且充分与微孔中试剂混匀。室温(20～25℃)孵育3min后，吸取混匀液约70ul垂直滴于加样孔中。液体流动时开始计时，反应10min，根据示意图判定结果或通过胶体金分析仪读取检测结果。其它时间判读无效。

3、检测结果分析

阳性：当质控线(C)显示出红色条带，而检测线(T)显色明显弱于质控线(C)或不显色，判为阳性，如图4a、4b所示；

阴性：当质控线(C)显示出红色条带，检测线(T)显色强于质控线(C)或与质控线(C)显色无差异，判为阴性，如图4c、4d所示；

无效：当质控线(C)不显示出红色条带，则无论检测线(T)显示出红色条带与否，该试纸均判为无效，如图4e、4f所示。

实施例4试纸条技术参数的确定

1、灵敏度试验

将五氯酚钠标准品分别稀释成0.5、1、2μg/L，所用稀释液为pH7.2、0.2mol/L的磷酸盐缓冲液。

用试纸条进行检测，结果为：五氯酚钠标准品浓度为0.5μg/L时，C线显示出红色条带，T线显色强于C线或与C线显色无差异，呈阴性；五氯酚钠标准品浓度为1、2μg/L时，C线显示出红色条带，而T线显色明显弱于C线或不显色，呈阳性，表明本试纸条检测五氯酚钠的灵敏度均为1μg/L。

2、假阳性率、假阴性率试验

取已知五氯酚钠含量大于1μg/kg的动物组织阳性样本20份和浓度小于1μg/L的动物组织阴性样本20份，用3个批次生产的试纸条分别进行检测，计算其阴阳性率。结果见表1。

表1检测阳性、阴性样本结果

结果表明：用3个批次生产的试纸条检测阳性动物组织样本时，结果全为阳性，可知阳性符合率为100％，假阴性率为0；检测20份阴性动物组织样本时，结果全为阴性，可知阴性符合率为100％，假阳性率为0。说明本发明的检测五氯酚钠的试纸条可以对动物组织样本中五氯酚钠残留进行快速检测。

3、特异性试验

本试纸条对五氯酚钠的检测灵敏度均为1μg/kg，将硝基呋喃类药物、氯霉素等药物用pH7.2、0.2mol/L的磷酸盐缓冲液进行稀释，用实施例1中所述的试纸条进行检测。结果显示，用该试纸条检测500μg/kg的硝基呋喃类药物、氯霉素等药物时，试纸C线显示出红色条带，T线显色强于C线或与C线显色无差异，呈阴性，说明本试纸条对这些药物无交叉反应。

Claims (9)

1.一种检测五氯酚钠的试纸条，其特征在于包括试纸和微孔试剂，所述试纸包括反应膜、样品吸收垫、吸水垫、保护膜、底板，所述反应膜上有检测线和质控线，检测线上包被有五氯酚钠半抗原-载体蛋白偶联物，质控线上包被有羊抗鼠抗抗体，所述微孔试剂中冻干有五氯酚钠单克隆抗体-胶体金标记物。

2.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于所述试纸由样品吸收垫、反应膜、吸水垫、保护膜依次黏贴在底板上组成，所述微孔试剂上具有微孔塞。

3.根据权利要求1-2任一项所述的试纸条，其特征在于所述样品吸收垫上粘贴有保护膜，为检测端，上面有MAX标记线。

4.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于所述检测线位于近于有MAX标记的保护膜的一端，所述质控线位于远离有MAX标记的保护膜的一端。

5.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于所述五氯酚钠半抗原-载体蛋白偶联物由五氯酚钠半抗原与载体蛋白偶联得到，所述载体蛋白可为牛血清白蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白、甲状腺蛋白、人血清白蛋白。

6.根据权利要求1或5任一项所述的试纸条，其特征在于所述五氯酚钠半抗原是由五氯酚钠与4溴丁酸乙酯反应得到，分子结构式为：

7.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于所述五氯酚钠单克隆抗体-胶体金标记物中的五氯酚钠单克隆抗体是以五氯酚钠半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得。

8.一种制备权利要求1-7任一项所述试纸条的方法，其包括步骤：

1)制备冻干有五氯酚钠单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂；

2)制备具有包被五氯酚钠半抗原-载体蛋白偶联物的检测线和包被羊抗鼠抗抗体的质控线的反应膜；

3)将2)制备好的反应膜与样品吸收垫、吸水垫、保护膜、底板组装成试纸；

4)将1)和3)制备好的冻干有五氯酚钠单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂和试纸组装成试纸条。

9.一种检测样品中五氯酚钠残留的方法，其包括步骤：

1)样品前处理；

2)用权利要求1-7任一项所述的试纸条进行检测；

3)分析检测结果。