CN116106536A - 一种复杂基质中痕量五氯苯酚的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于食品安全免疫学检测技术领域，具体公开一种复杂基质中痕量五氯苯酚的检测方法，所述方法包括：（1）对复杂基质进行预处理；（2）使用免疫亲和柱提取预处理样品中的五氯苯酚；（3）采用HPLC‑MS/MS方法对五氯苯酚进行测定。本发明的一个优势在于利用式(I)所示的半抗原制备得到的五氯苯酚单克隆抗体制备免疫亲和柱。本发明的五氯苯酚单克隆抗体的IC50为0.467 ng/mL，比现有技术低得多，因此对五氯苯酚的检测灵敏度和检测限都得到了明显提升，本发明检测方法对五氯苯酚的LOD为0.008μg/L，LOQ为0.02μg/L。
Figure ZY_1
(I)。

Description

一种复杂基质中痕量五氯苯酚的检测方法
技术领域
本发明属于食品安全免疫学检测技术领域，具体涉及一种复杂基质中痕量五氯苯酚的检测方法。
背景技术
五氯苯酚(pentachloropHenol，PCP)及其钠盐五氯酚钠(sodiumpentachloropHenol，PCP-Na)属于氯代芳香族化合物，其化学结构稳定，不易降解，可在环境中持续存在并在人体内蓄积。五氯苯酚在获得广泛应用的同时，其所造成的环境及健康问题也引起人们高度重视。流行病学研究与体内外实验发现，五氯苯酚可导致肝、肾、中枢神经系统损伤及内分泌功能紊乱，并且具有强烈的致癌、致畸变作用。
现有研究表明，五氯苯酚可通过呼吸、摄食或直接接触等多种途径进入人体，并蓄积于肝脏、肾脏及脂肪等组织，导致人体的高暴露风险。开展五氯苯酚的人体生物监测是评估人体暴露水平和健康风险的有效手段。国内外研究者基于固相萃取、气相色谱-串联质谱法及液相色谱-串联质谱法等建立了血液、尿液等常规生物样本中五氯苯酚的分析技术并成功应用于大规模的人群暴露监测。
与血液和尿液相比，母乳是另一种较为理想的人体生物检测基质，具有易于收集、无损伤性和富含脂肪等特点，更适用于脂溶性有机污染物的人体蓄积评估。同时，母乳作为婴儿生命早期最理想的天然食品，分析母乳中的五氯苯酚水平既能够反应母亲的暴露水平又能够评估婴儿的健康风险。但是， 母乳基质较血液、尿液等样本更为复杂，对样品前处理方法的净化能力要求更高。为此，有必要针对母乳中残留的五氯苯酚进一步开发简便准确、净化能力强的分析技术，为开展母婴暴露水平的监测提供方法学基础，同时也可为开展血液、尿液等其他人体样本的暴露水平监测提供方法学参考。
目前，母乳中五氯苯酚及五氯酚钠的检测主要采用气相色谱-串联质谱法。然而，五氯苯酚分子结构中的5个氯原子的作用使得其极性较强，在气相色谱柱上较难洗脱，存在色谱峰拖尾，检测灵敏度较低等不足。液相色谱-串联质谱法测定五氯苯酚方法简便、灵敏度高，但容易受到基质抑制作用影响。针对这一问题，本研究拟采用基于抗原抗体特异性可逆结合原理的免疫亲和柱(immunoaffinity column，IAC)从复杂的母乳样品中高选择性地提取五氯苯酚，以达到降低基质效应的目的。前期研究发现，基于免疫亲和柱的样品净化方法还具有回收率高、操作便捷等优点，适用于大批量样品的快速检测。
专利文献CN105462933A与CN101526525A分别公开了一株五氯苯酚单克隆抗体杂交瘤细胞株和用于五氯酚残留分析的酶联免疫吸附试剂盒，其中用于制备所述五氯苯酚单克隆抗体的半抗原均是对羟基四氯苯氧丁酸。期刊文献（“Development of an enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of pentachloropHenolresidues inwater samples”， Food and Agricultural Immunology， 2007， 18(3-4)，189-201）也报道了半抗原对羟基四氯苯氧丁酸，其结构式如下：
；
但是该半抗原所制得单克隆抗体灵敏度还有待进一步提升。
发明内容
基于此，本发明的目的是建立一种基于免疫亲和柱净化，高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)精准定量的分析方法，简便高效地检测母乳中五氯苯酚残留量，为进一步开展人群健康风险评估提供技术支撑。
第一方面，本发明提供一种复杂基质中痕量五氯苯酚的检测方法，所述方法包括：
（1）对复杂基质进行预处理；
（2）使用免疫亲和柱提取预处理样品中的五氯苯酚；所述免疫亲和柱由偶联五氯苯酚单克隆抗体的柱料制备得到，制备所述五氯苯酚单克隆抗体使用的半抗原结构式如下：
(I)；
（3）采用HPLC-MS/MS方法对五氯苯酚进行测定。
优选的，所述步骤（1）的预处理方法包括：向所述复杂基质中加入8-10倍体积的提取液超声提取20-30min；离心，取上清液；氮气流吹至1-2 mL，加入PBS混匀备用；所述提取液为50-90vol.%甲醇水溶液或50-90 vol.%乙腈水溶液，且所述甲醇水溶液或乙腈水溶液中含有1-5 wt.%的甲酸或三乙胺。
优选的，所述提取液为70-90 vol.%乙腈水溶液，所述乙腈水溶液中含有3-5wt.%的三乙胺。
在本发明的最优选实施方式中，所述提取液是70 vol.%乙腈水溶液，所述乙腈水溶液中含有5wt.%的三乙胺。
本发明所述的“vol.%”表示体积百分数，“wt.%”表示质量百分数。
本发明所述的复杂基质是任何可能含有五氯苯酚的基质，包括但不限于尿液、血液、母乳、牛乳、羊乳。
在本发明的优选实施方式中，所述复杂基质为母乳。
本发明提供一种母乳样品预处理的方法，所述方法具体为：准确吸取母乳样品1mL，加入8 mL含5 wt.%三乙胺的乙腈-水溶液(7:3, V/V)，涡旋均匀后超声提取20 min，4℃10000 r/min条件下离心10 min，吸取上清液并置于15 mL离心管中，在35℃下经温和氮气流吹至2 mL，加入10 mL 2×PBS缓冲液，涡旋混匀备用。
本发明步骤（2）所述的免疫亲和柱通过如下方法制备得到：
步骤一：向NHS活化柱料中加入PBS进行柱料洗涤；
步骤二：将洗涤后的活化柱料与五氯苯酚单克隆抗体按照1:1-2（v:m）混合，搅拌反应12-24h，PBS洗涤；
步骤三：将步骤二制备的偶联五氯苯酚单克隆抗体的柱料与空白柱料按照体积比1:2-3混合，装柱，4℃保存备用。
进一步，本发明所述的五氯苯酚单克隆抗体通过如下方法制备得到：
A：式(I)所示的半抗原与载体蛋白偶联制备全抗原；
B：根据全抗原制备得到五氯苯酚单克隆抗体。
所述载体蛋白可为牛甲状腺球蛋白（BTG）、牛血清白蛋白（BSA）、兔血清蛋白、人血清白蛋白、卵清蛋白。
步骤B所述的根据全抗原制备得到五氯苯酚单克隆抗体是本领域的常规操作，本发明不做限定。在本发明的具体实施方式中，根据全抗原制备五氯苯酚单克隆抗体的方法包括：
（1）小鼠的免疫：全抗原与等体积弗氏佐剂混合免疫BALB/c小鼠，首次免疫用完全弗氏佐剂，之后都用不完全弗氏佐剂，首免后第7、14、28天以免疫原与弗氏不完全佐剂等体积混匀，各追加免疫一次，最后一次用全抗原(不含佐剂)追加免疫，通过间接ELISA检测血清效价和抑制；
（2）细胞融合与细胞株建立：将筛选的小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合，培养，利用间接ELISA检测阳性细胞孔，进一步利用间接竞争ELISA法测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制的阳性细胞孔进行多次亚克隆，最终筛选获得杂交瘤细胞株18F2；
（3）单克隆抗体的制备：采用体内诱生法向BALB/c小鼠腹腔注射杂交瘤细胞，采集腹水，纯化，得到五氯苯酚单克隆抗体，通过ELISA法测定灵敏度和特异性。
第二方面，本发明提供一种用于制备五氯苯酚单克隆抗体的半抗原，所述半抗原具有如下式(I)结构：
    (I)。
第三方面，本发明提供上述式(I)所示半抗原的制备方法，包括以下步骤：
S1：称取原料四氯氰醌用DMF溶解，加入氢化钠搅拌，加入4-溴甲基苯甲酸甲酯，加热到60-65℃反应，反应完全后加入冰水，过滤得到粗品；
S2：进行柱层析纯化，收集产物点溶液，合并旋干，得到产物；
S3：再用甲醇溶解，加入氢氧化钠水溶液，加热反应，反应完全用盐酸调pH到6.5-7.0，旋干混合溶液，加纯水，过滤，得到产物。
第四方面，本发明提供一种如上式(I)所示的半抗原在制备五氯苯酚单克隆抗体中的应用。
第五方面，本发明提供一种根据如上式(I)所示的半抗原制备得到的五氯苯酚全抗原。
第六方面，本发明提供一种根据如上式(I)所示的半抗原制备得到的五氯苯酚单克隆抗体。
本发明提供一种如式(I)所示的半抗原，利用所述半抗原制备得到的五氯苯酚单克隆抗体对五氯苯酚具有较高的亲和力，所述单克隆抗体的IC50可达到 0.467 ng/mL。本发明基于所述单克隆抗体制备得到免疫亲和柱，对样品中的五氯苯酚进行特异性提取，再采用对HPLC-MS/MS对提取得到的五氯苯酚进行检测。本发明提供的检测方法，五氯苯酚的检出限为0.008 μg/L，定量限为0.02 μg/L，远高于现有技术水平。本发明提供的检测方法重现性好、准确度高，能够有效地分离和检测母乳中的五氯苯酚残留，可应用于母乳样品中五氯苯酚的定性定量检测。
附图说明
图1 本发明制备的式(I)半抗原化合物的质谱图；
图2 BSA的MALDI-TOF检测结果；
图3 PCP4-AR-BSA的MALDI-TOF检测结果；
图4 五氯苯酚单克隆抗体标准曲线图；
图5 不同提取液类型对母乳样品提取效率的影响；
图6 不同实验条件下免疫亲和柱重复利用对母乳样品提取效率的影响；
图7 五氯苯酚标准品(A)及母乳实际样品(B)色谱图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的部分实施例，而不是全部。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
材料与试剂
母乳样品由某市哺乳期健康女性提供，于2021年11月至2022年12月采集并于零下80℃保存。
五氯苯酚(纯度>99.8%)、同位素内标五氯苯酚-13C6(纯度>99.0%)(天津阿尔塔科技有限公司)；氟化铵、甲醇、乙腈(色谱纯，美国Sigma公司)；PBS缓冲液(10, pH=7.4，北京索莱宝科技有限公司)；三乙胺(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)。
实验用水为美国Milli-Q系统净化的电阻率至18.2 MΩ•cm的超纯水。
仪器与设备
LCMS-8060三重四极杆液相色谱串联质谱仪(日本岛津公司)；X-30R台式冷冻离心机(美国Beckman公司)；N-EVAP 116氮吹仪(美国Organomation公司)；ACQUITY UPLC HSST3色谱柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm, 美国Waters公司)。
标准溶液配制
用甲醇逐级稀释质量浓度为100 μg/mL的五氯苯酚标准溶液，配制成质量浓度为0.2、1.0、5.0、20.0 μg/mL的标准品使用液。同理，配制质量浓度为20 μg/L五氯苯酚-13C6的同位素内标使用液。精密吸取适量五氯苯酚标准品使用液及五氯苯酚-13C6标准品使用液，用甲醇稀释，配制成五氯苯酚-13C6质量浓度均为1 μg/L及质量浓度范围为0.02~20.00 μg/L的五氯苯酚标准系列溶液，置于安捷伦2 mL棕色螺口进样瓶中，-20℃冰箱保存。
制备例1 五氯苯酚单克隆抗体的制备
一、半抗原的合成
半抗原结构如下：
(I)。
称取原料四氯氰醌1g，用10ml DMF溶解，搅拌，加入氢化钠96.8mg，搅拌1h后加入4-溴甲基苯甲酸甲酯1.18g，加热到60℃反应，监测反应进程，当原料大多数转化后处理反应，加入冰水20ml，过滤，得到粗品，进行柱层析纯化，收集产物点溶液，合并旋干，得到产物1.21g，用甲醇溶解，加入2mol的氢氧化钠水溶液，加热到40℃反应，监测直到反应完全为止，用1mol盐酸调pH到7，旋干混合溶液，加入纯水5ml，过滤，得到产物约920mg。
使用质谱对半抗原进行鉴定，结果如图1所示。起始原料四氯氰醌含两个羟基，半抗原相对分子质量为380，说明第一步反应只取代其中一个羟基，另一个羟基为对位。半抗原相对分子质量为380，其分子离子峰M+H，m/z 381，质谱图上m/z 381出现一强峰，说明半抗原结构正确。
二、全抗原的合成
免疫原PCP4-AR-BTG的制备
S1：将6.78mg本发明制备得到的五氯芬酸半抗原用2ml DMF溶解，200rpm搅拌10min，加入EDC 10.3mg溶解后再加入NHS6.18g，室温搅拌（500rpm）活化2-3h；
S2：称取BTG共计20mg溶于7ml的10mmol的PBS溶液中，200rpm搅拌10min，使其充分溶解，冰浴降温0-4℃，1000rpm搅拌下，将步骤S1反应液逐滴加入（1ml/min），500rpm搅拌反应24h；
S3：将反应产物装入蒸馏水冲洗干净透析袋（10cm），1L 0.01M PBS（1×，pH7.2）4℃搅拌（100rpm）透析3d，每天换液3次（早中晚各一次），共计换液9次，将透析产物5000rpm离心6min，1.5ml/管分装，将抗原编号，-20℃保存备用。
包被原PCP4-AR-BSA的制备
S1：将17mg本发明制备的五氯芬酸半抗原用2ml DMF溶解，200rpm搅拌10min，加入EDC 25.75mg溶解后再加入NHS15.46mg，室温搅拌（500rpm）活化2-3h；
S2：称取BSA共计50mg溶于5ml的10mmol的PBS溶液中，200rpm搅拌10min，使其分溶解，冰浴降温0-4℃，1000rpm搅拌下，将步骤S1反应液逐滴加入（1ml/min），500rpm搅拌反应24h；
S3：将反应产物装入蒸馏水冲洗干净透析袋（10cm），1L 0.01M PBS（1×，pH7.2）4℃搅拌（100rpm）透析3d，每天换液3次（早中晚各一次），共计换液9次，将透析产物5000rpm离心6min，1.5ml/管分装，将抗原编号，-20℃保存备用。
抗原鉴定
包被原和免疫原的浓度
采用紫外吸收法测定免疫原和包被原的浓度。用PBS作空白对照，紫外分光光度计测定蛋白溶液的OD280 nm、OD260 nm，然后按下列公式计算蛋白浓度。
公式为：蛋白浓度（mg/mL）=1.45×OD280 nm-0.74×OD260 nm；
检测结果是：
PCP4-AR-BTG的浓度是2.13 mg/mL。
PCP4-AR-BSA的浓度是3.2 mg/mL。
MALDI-TOF检测BSA抗原的偶联比
用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪（MALDI-TOF）检测法对免疫原进行鉴定，其中，BSA的MALDI-TOF检测结果如图2所示，PCP4-AR-BSA的MALDI-TOF检测结果如图3所示，经过计算，PCP4-AR-BSA偶联比为13.8。
三、单克隆抗体制备与鉴定
1.动物免疫
采用小剂量短周期方案对BALB/c雌性小鼠进行免疫。
用制备出的免疫原PCP4-AR-BTG按100 μg/只，以生理盐水溶解免疫原与弗氏完全佐剂等体积混匀，颈背部皮下注射免疫6~8周龄BALB/c雌鼠，初次免疫后第7、14、28天以免疫原与弗氏不完全佐剂等体积混匀，各追加免疫一次，融合前3天以免疫复合物100 μg/只，不加弗氏佐剂再追加免疫一次。
2.抗血清的筛选
采血后，离心取出上层抗血清。获得的抗血清存放于4℃冰箱待检。以抗原包板，对免疫后获得的抗血清进行检测。用间接ELISA法检测。选择对抗原识别最好且效价高的血清对应小鼠取脾细胞进入下一步细胞融合。
抗血清抑制水平检测
化学方法合成免疫原免疫小鼠后，抗血清OD值较低，第四次加强免疫后小鼠血清的抑制水平如下表所示。选择抗原抗体反应强度高、抑制程度好的小鼠，用于后续试验。
表1 抗血清抑制水平
。
3.杂交瘤细胞的制备和筛选
杂交瘤细胞株的建立及腹水单克隆抗体制备与效价测定
挑取效价和抑制最佳的小鼠，取脾细胞进行细胞融合，5～6 d后观察融合效果，100块细胞培养板9600孔中有杂交瘤细胞形成的为8200孔；间接ELISA检测细胞培养上清，强阳性孔4500孔，强阳性率为54％；间接竞争ELISA检测强阳性孔培养上清，挑选阳性强且抑制率高的孔进行亚克隆筛选，经多次亚克隆筛选后阳性率达100％。第4次亚克隆后获得了多株分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞，其中抗体分泌能力强，抗体亲和力最高的细胞株为18F2，经多次传代、冻存与复苏，杂交瘤细胞分泌抗体稳定。
结论：将杂交瘤细胞18F2产生的单抗纯化后，按2倍比稀释，经间接ELISA检测，其腹水型单抗的效价为1:243000。
4.杂交瘤细胞的冻存和复苏
取处于对数生长期的杂交瘤细胞用冻存液制成5×106个/ml的细胞悬液，分装于冻存管，在液氮中长期保存。复苏时取冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。
5.单克隆抗体的制备与纯化
采用体内诱生法，将8周龄的BALB/c小鼠腹腔注入灭菌石蜡油0.5 ml/只，7-8 d后腹腔注射杂交瘤细胞5×106个/只，7 d后采集腹水4℃，8000 r/min离心10 min，去除上层油脂和沉淀，用辛酸-硫酸铵沉淀法对单克隆抗体进行纯化，制备得到五氯苯酚单克隆抗体。
所述单克隆抗体纯化具体方法如下：
①取腹水5mL，加入10mL 0.06 mol/L，pH 5.0的乙酸缓冲液，用0.1mol/L HCl调节pH至4.8；②室温搅拌条件下，逐渐加入160μL辛酸，4℃静置2 h，8000 rpm离心10 min，弃沉淀；③上清中加入0.2 mL 0.1 mol/L PBS，用1 mol/L NaOH调节pH至7.4；④逐滴加入适量饱和硫酸铵使溶液呈45%饱和度，静置1 h，4℃8000 rpm离心30 min，弃上清；⑤沉淀溶于5mL的PBS中，在PBS中透析2天。
6.单克隆抗体浓度的确定
采用紫外吸收法测定纯化后五氯苯酚单克隆抗体的浓度。用PBS作空白对照，紫外分光光度计测定蛋白溶液的OD280 nm、OD260 nm，然后按下列公式计算蛋白浓度：
公式为：蛋白浓度（mg/mL）=1.45×OD280 nm-0.74×OD260 nm；
结论：本发明制备的五氯苯酚单克隆抗体浓度为2.539 mg/mL。
7.抗原抗体最佳工作浓度测定
稀释一系列梯度的包被抗原、五氯苯酚单克隆抗体、标准品，采用棋盘法间接竞争ELISA对单克隆抗体进行效价鉴定：
①包板：用包被液稀释包被原至适当浓度，100μL／孔加入96孔板，盖上塑料薄膜，4℃保存过夜或37℃2 h；②洗板：弃去孔中液体，PBST洗涤液洗涤2遍，每遍l min；③封闭：96孔板封闭液200μl/孔，置37℃封闭2 h；封闭结束PBST洗涤4遍后甩干拍干；④加入标准品和纯化的单克隆抗体：将各系列梯度的标准品以50μl/孔，抗体以50ul/孔分别加入酶标反应孔中，置于25℃，30min，用洗涤液洗涤4遍；⑤加入酶标抗体：HRP酶标山羊抗鼠IgG，稀释度：l000-5000进行，100μL／孔，25℃，30 min；洗涤同前；⑥显色：加入显色液25℃显色10 min，100μL／孔；⑦终止反应：加入终止液终止反应，100μL／孔，测定OD450值，数据计算与分析。
结论：将杂交瘤细胞18F2产生的五氯苯酚单克隆抗体纯化后，按2倍比系列稀释，经间接竞争ELISA检测，抗原的最佳工作浓度为1810 ng/mL，抗体的最佳工作浓度为10.4ng/mL。
8.单克隆抗体亲和力检测
通过间接竞争ELISA进行测定，如上述第④步中分别添加系列标准品，50 μL/孔，以标准溶液的浓度为横坐标(x)，结合率为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，求出IC50，以IC50衡量小鼠单克隆抗体亲和力。
结合率(％)=B/B0(％)=标准(或样品)的吸光度／零标准的吸光度×100％；
抑制率(％)=1-结合率(％)；
结论： ELISA检测方法结果如图4所示，本发明制备的五氯苯酚单克隆抗体的IC50为0.467 ng/mL，表明该株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体具有较高的亲和力。
目前市场上用于制备五氯苯酚单克隆抗体过程使用的半抗原为四氯对羟基苯氧丁酸（本发明称为对照半抗原），结构式如下：
。
为了对比所述的对照半抗原与本发明提供的半抗原差异，发明人以对照半抗原完全复制上述步骤制备得到对照五氯苯酚单克隆抗体，ELISA检测，所述对照五氯苯酚单克隆抗体的IC50为14.58 ng/mL。
9.特异性实验
选择五氯苯酚、2-氯苯酚、2,5-二氯苯酚、2,4,6-三氯苯酚、2,3,4,6-四氯苯酚、五氯硝基苯、六氯苯作为测试物，测试本发明所得单克隆抗体对上述测试物的交叉反应性。
交叉反应(CR %)= IC50(五氯苯酚)/IC50(测试物)×100%，结果如下表2所示：
表2 交叉反应测试
。
制备例2 免疫亲和柱（IAC）的制备
S1（洗涤活化柱料）：向24mL NHS活化柱料中加入10倍柱体积的10 mM PBS，弃去流出液；
S2（抗体偶联反应）：将36 mg本发明制备的五氯苯酚单克隆抗体溶液与24mL活化柱料混合，室温下搅拌过夜反应17-18 h，用5倍体积的10 mM PBS清洗柱料，电泳鉴定偶联效率；
S3（装柱）：将活化柱料与空白柱料以1：2.5的比例混合，每根3mL柱子填装0.35mL的混合柱料和2mL的10mM PBS，4℃冰箱中保存备用。
实施例1
免疫亲和柱提取、HPLC-MS/MS测定母乳中的五氯苯酚
（1）母乳样品预处理
准确吸取涡旋混匀的母乳样品1 mL，置于15 mL聚丙烯离心管中，加入内标工作液50 μL，混匀，静置1 h。加入8 mL含5%三乙胺的乙腈-水溶液(7:3, V/V)，涡旋均匀后超声提取20 min，4℃ 10000 r/min条件下离心10 min，吸取上清液并置于15 mL离心管中，在35℃下经温和氮气流吹至2 mL左右，加入10 mL 2×PBS缓冲液，涡旋混匀备用。
（2）免疫亲和柱提取
将于4℃冰箱中保存的免疫亲和柱移至室温条件下，待其复温后让柱中保存液自然流干，将上步预处理后的母乳样本加入到免疫亲和柱中，自然流干后再用10 mL含10%甲醇的超纯水进行淋洗。待淋洗液滴完后，用洗耳球吹出柱中残留液体。用2 mL甲醇洗脱并收集洗脱液于玻璃氮吹瓶中，在35℃下经温和氮气流吹至近干，加入400 μL甲醇复溶，振荡30s后再加入600 μL超纯水涡旋混匀，供HPLC-MS/MS测定。
（3）HPLC-MS/MS检测
色谱柱： ACQUITY UPLC HSST3反向分析柱(100 mm× 2.1 mm, 1.8 μm)； 柱温箱温度： 40℃； 流动相： (A)含0.05%氟化铵的甲醇和(B)含0.05%氟化铵的水。梯度程序: 0~0.5 min, 40% A； 0.5~5 min, 40%~100% A；5~7 min, 100% A；7~7.1 min, 100%~40% A；7.1~9.5 min, 40% A；流速: 0.3 mL/min；进样体积: 10 μL。
离子源: 电喷雾离子源(electrospray ionization, ESI)； 扫描方式: 负离子扫描; 离子源温度: 150℃；脱溶剂气温度: 520℃；脱溶剂气流量: 15 L/min；五氯苯酚及其内标的定性离子对、定量离子对、碰撞气能量等参数见下表3。
表3 五氯苯酚及其内标的质谱参数
。
检测结果的数据处理通过岛津LC-MS再解析软件完成，根据五氯苯酚的出峰时间及定性定量离子对进行定性，根据软件生成的标准曲线对样品中五氯苯酚浓度进行定量。采用Origin 2022b软件对实验数据进行分析。
优化实验
1、母乳样品提取液的优化
五氯苯酚，酸度系数(pKa)为4.99，辛醇-水分配系数(logKow)为5.01，在酸性条件下呈分子态，极易溶于甲醇、乙腈、乙醚等有机溶剂。在碱性条件下呈离子态，更易溶于水，利用五氯苯酚分子及其离子在不同条件下可相互转化的性质，可通过酸化或碱化提取液来提高萃取效率。常见的有机溶剂包括甲醇或乙腈均可用作母乳样品的提取试剂和蛋白沉淀剂。经对比发现乙腈的提取回收率和蛋白沉淀效果优于甲醇。本发明选用甲酸或三乙胺调整提取液酸碱度，乙腈作为提取剂及蛋白沉淀剂，并进行进一步优化以获得最佳提取液类型。
采用空白母乳样品添加五氯苯酚标准品50 ng，含1%甲酸的乙腈或含1%三乙胺的乙腈水(7:3, V/V)提取目标物，比较回收率差异。结果表明，碱化提取液的回收率（75.9%）相比酸化提取液的回收率（25.9%）更高，重现性更好，这可能是由于酸化的提取液在经氮气吹至近干并用PBS复溶后，上样液仍为强酸性(pH试纸检测其pH介于2~3之间)，影响免疫亲和柱中五氯苯酚抗体活性，使其未能与五氯苯酚有效结合。
在此结果基础上，对提取液碱化程度(三乙胺含量: 1%、3%、5%)及乙腈与水的比例(5:5、7:3、9:1, V/V)进行进一步优化。结果如图5所示, 随着碱化程度的增加，五氯苯酚由分子状态转化为离子状态更充分，更易溶于水。因此，乙腈比例的降低(即水相占比增加)有利于目标物萃取，但过低的乙腈比例造成其对蛋白等杂质的沉淀效果的降低，进而导致回收率下降。5%三乙胺乙腈水(7:3, V/V)的提取溶液能够有效萃取五氯苯酚，获得最高回收率，故最终选择5%三乙胺乙腈水(7:3, V/V)作为提取液。
2、提取液体积优化
在上述优化条件下，考察不同提取液体积(2、4、6、8、10 mL)对萃取效果的影响。结果是随着提取液体积的增加，五氯苯酚的萃取效率逐渐增加。当提取液体积为8 mL时，绝对回收率达到95.7 %，可实现高效萃取，继续增加提取液体积不但对萃取效果无显著影响，而且增加了有机试剂的使用，延长了氮吹步骤时间。因此，本发明选择的提取液体积为8 mL。
3、不同实验条件免疫亲和柱重复利用情况
尽管免疫亲和柱基于抗原抗体特异性结合的原理具有从复杂待测样品中高效净化目标物的优势，但高成本限制了其广泛应用。针对这一问题，本发明考察了免疫亲和柱重复利用情况。在每次使用免疫亲和柱之后，用PBS缓冲液填充并在4℃的条件下储存24 h来恢复柱内抗体活性，以备重复使用。结果如图6所示，含有五氯苯酚抗体的免疫亲和柱在不同提取方式下可重复使用8至9次，均不会影响使用性能(绝对回收率达80%以上)，这使得实验成本可降低87%以上。
方法学考察
1、线性范围、检出限和定量限
在高效液相色谱条件及质谱分析条件下，对五氯苯酚(0.02、0.05、1.00、2.00、5.00、10.00、20.00 μg/L)系列标准溶液由低质量浓度至高质量浓度进行依次检测，其中五氯苯酚-13C6质量浓度为1 μg/L。以五氯苯酚及其内标的色谱峰峰面积比值为纵坐标，对应的浓度比值为横坐标绘制散点图，添加线性趋势线拟合得到标准曲线回归方程。结果表明(表4)，五氯苯酚在0.02~20.00 μg/L范围线性关系良好，线性方程为Y=0.749X+0.046，相关系数(r2)可达0.9998。将定量离子信噪比(S/N)为3时对应浓度计作方法的检出限，并以S/N为10时浓度计作方法的定量限。母乳样品中五氯苯酚的检出限为0.008 μg/L，定量限为0.02 μg/L。由此可见，方法的灵敏度高。同时，该灵敏度满足我国对五氯苯酚残留量(限值为0.5 mg/kg, 另: 婴儿产品限值为0.05mg/kg)的检测需求。
表4 五氯苯酚线性范围、线性方程、决定系数、检出限及定量限
。
2、回收率、精密度和基质效应
在不含五氯苯酚的母乳样品中分别添加低、中、高3种浓度水平(1、5、10 μg/L)的五氯苯酚标准溶液，然后在每个样品中添加50 μL质量浓度为20 μg/L的五氯苯酚-13C6标准溶液，每个水平做6个平行样品，考察方法回收率和精密度。结果显示，不同加标水平的回收率在98.72%~106.95%范围内，相对标准偏差(relative standard deviations, RSD)均不大于6.09%，表明该方法具有较好的精密度与准确度。
基质效应(matrix effect, ME)可以有效反映实际样品的净化效果，可通过计算基质匹配样品中五氯苯酚峰面积与溶剂标准品中五氯苯酚峰面积之比获得。当ME>100%时，提示基质导致五氯苯酚的信号加强；ME<100%时，提示基质导致五氯苯酚的信号减弱。结果显示，基质效应均较低(94.45%~101.61%)，体现出免疫亲和柱特异性高效净化目标物的特点。
实施例2
采用本发明提供的方法对随机抽取的10份某市母乳样品进行分析。其中，9份样品检测到五氯苯酚的残留，含量在0.06~0.20 ng/mL之间，由此可见，方法灵敏度和特异性良好。五氯苯酚标准品及典型的阳性母乳样品色谱图如图7，注: A为5 μg/L五氯苯酚标准品色谱图；B为母乳实际样品色谱图。监测结果提示, 某市孕妇体内存在一定的五氯苯酚的残留，应引起密切关注并进行进一步人体生物检测及风险评估。
本发明建立了含5%三乙胺的乙腈水萃取，免疫亲和柱特异性提取，HPLC-MS/MS定性定量分析母乳中五氯苯酚的方法。该方法具有操作简便、回收率高、测定结果准确可靠等优点。同时，免疫亲和柱的重复利用有效降低了其成本。本发明填补了母乳中五氯苯酚残留量HPLC-MS/MS检测方法的空白，为开展相关暴露监测和健康风险评估提供了技术支持。利用建立的方法检测了某市哺乳期健康女性母乳样本中五氯苯酚的浓度水平，发现某市哺乳期女性体内存在一定水平的五氯苯酚身体负荷。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种复杂基质中痕量五氯苯酚的检测方法，所述方法包括：
（1）对复杂基质进行预处理；
（2）使用免疫亲和柱提取预处理样品中的五氯苯酚；所述免疫亲和柱由偶联五氯苯酚单克隆抗体的柱料制备得到，制备所述五氯苯酚单克隆抗体使用的半抗原结构式如下式(I)：
   (I)；
（3）采用HPLC-MS/MS方法对五氯苯酚进行测定。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤（1）的预处理方法包括：向所述复杂基质中加入8-10倍体积的提取液超声提取20-30min；离心，取上清液；氮气流吹至1-2 mL，加入PBS混匀备用；所述提取液为50-90 vol.%甲醇水溶液或50-90 vol.%乙腈水溶液，且所述甲醇水溶液或乙腈水溶液中含有1-5 wt.%的甲酸或三乙胺。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述提取液为70-90 vol.%乙腈水溶液，所述乙腈水溶液中含有3-5wt.%的三乙胺。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤（2）所述的免疫亲和柱通过如下方法制备得到：
步骤一：向NHS活化柱料中加入PBS进行柱料洗涤；
步骤二：将洗涤后的活化柱料与五氯苯酚单克隆抗体按照1:1-2体积质量比，单位mL：mg，混合，搅拌反应12-24h，PBS洗涤；
步骤三：将步骤二制备的偶联五氯苯酚单克隆抗体的柱料与空白柱料按照体积比1:2-3混合，装柱，4℃保存备用；
所述的五氯苯酚单克隆抗体通过如下方法制备得到：
A：式(I)所示的半抗原与载体蛋白偶联制备全抗原；
B：根据全抗原制备得到五氯苯酚单克隆抗体；
所述载体蛋白可为牛甲状腺球蛋白、牛血清白蛋白、兔血清蛋白、人血清白蛋白、卵清蛋白。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，步骤B所述的根据全抗原制备得到五氯苯酚单克隆抗体的方法包括：
（1）小鼠的免疫：全抗原与等体积弗氏佐剂混合免疫BALB/c小鼠，首次免疫用完全弗氏佐剂，之后都用不完全弗氏佐剂，首免后第7、14、28天以免疫原与弗氏不完全佐剂等体积混匀，各追加免疫一次，最后一次用全抗原追加免疫，通过间接ELISA检测血清效价和抑制；
（2）细胞融合与细胞株建立：将筛选的小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合，培养，利用间接ELISA检测阳性细胞孔，进一步利用间接竞争ELISA法测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制的阳性细胞孔进行多次亚克隆，最终筛选获得杂交瘤细胞株18F2；
（3）单克隆抗体的制备：采用体内诱生法向BALB/c小鼠腹腔注射杂交瘤细胞，采集腹水，纯化，得到五氯苯酚单克隆抗体，通过ELISA法测定灵敏度和特异性。
6.一种用于制备五氯苯酚单克隆抗体的半抗原，所述半抗原具有如下式(I)结构：
   (I)。
7.权利要求6所述用于制备五氯苯酚单克隆抗体的半抗原的制备方法，包括以下步骤：
S1：称取原料四氯氰醌用DMF溶解，加入氢化钠搅拌，加入4-溴甲基苯甲酸甲酯，加热到60-65℃反应，反应完全后加入冰水，过滤得到粗品；
S2：进行柱层析纯化，收集产物点溶液，合并旋干，得到产物；
S3：再用甲醇溶解，加入氢氧化钠水溶液，加热反应，反应完全用盐酸调pH到6.5-7.0，旋干混合溶液，加纯水，过滤，得到产物。
8.一种根据权利要求6所述的用于制备五氯苯酚单克隆抗体的半抗原在制备五氯苯酚单克隆抗体中的应用。
9.一种根据权利要求6所述的用于制备五氯苯酚单克隆抗体的半抗原制备得到的五氯苯酚全抗原。
10.一种根据权利要求6所述的用于制备五氯苯酚单克隆抗体的半抗原制备得到的五氯苯酚单克隆抗体。
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Hu et al. Monoclonal antibody based enzyme-linked immunosorbent assay for the specific detection of ciprofloxacin and enrofloxacin residues in fishery products
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Liu et al. Development of a monoclonal antibody based-ELISA for the detection of chloramphenicol in shrimp, feed and milk samples and validation by LC-MS/MS coupled with immunoaffinity clean-up
Wang et al. Indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay based on a broad-spectrum monoclonal antibody for tropane alkaloids detection in pig urine, pork and cereal flours
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Lin et al. Determination of robenidine in shrimp and chicken samples using the indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay and immunochromatographic strip assay
Zhao et al. Development of a sensitive monoclonal antibody-based ELISA for the determination of a β-adrenergic agonist brombuterol in swine meat, liver and feed samples
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Dai et al. Production of high affinity monoclonal antibody and development of indirect competitive chemiluminescence enzyme immunoassay for gentamicin residue in animal tissues
Wang et al. A sensitive monoclonal antibody-based ELISA integrated with immunoaffinity column extraction for the detection of zearalenone in food and feed samples
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Chen et al. Development of competitive indirect ELISAs with a flexible working range for the simple quantification of melatonin in medicinal foods
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Shuang-Min et al. Development of enzyme-linked immunosorbent assay and colloidal gold-based immunochromatographic assay for the rapid detection of gentamicin in chicken muscle and milk

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