CN103713133B - 检测螺旋霉素、链霉素、庆大霉素、新霉素的试纸条及方法 - Google Patents

检测螺旋霉素、链霉素、庆大霉素、新霉素的试纸条及方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测螺旋霉素、链霉素、庆大霉素、新霉素的试纸条及方法。试纸条包括试纸和微孔试剂，所述微孔试剂中冻干有胶体金标记的螺旋霉素单克隆抗体、链霉素单克隆抗体、庆大霉素单克隆抗体、新霉素单克隆抗体；所述试纸由样品吸收垫、反应膜、吸水垫、保护膜、底板依次连接组成，所述反应膜上包括检测线和质控线，四条检测线分别包被有螺旋霉素半抗原-载体蛋白偶联物、链霉素半抗原-载体蛋白偶联物、庆大霉素半抗原-载体蛋白偶联物、新霉素半抗原-载体蛋白偶联物，质控线包被有羊抗鼠抗抗体。本发明试纸条可有效同时检测螺旋霉素、链霉素、庆大霉素和新霉素，方法简单、快速、直观、准确、成本低，易于推广使用。<!--1-->

Description

检测螺旋霉素、链霉素、庆大霉素、新霉素的试纸条及方法
技术领域
本发明涉及一种检测螺旋霉素、链霉素、庆大霉素、新霉素的试纸条及方法，具体涉及一种用于检测牛奶中螺旋霉素、链霉素、庆大霉素、新霉素的胶体金试纸条。
背景技术
链霉素、庆大霉素、新霉素属于氨基糖苷类抗生素，被广泛应用于动物疾病的治疗，由于这些药物具有神经毒性和肾脏毒性，在动物食品中的残留会影响人类健康，欧美国家及我国均要求其限量使用。螺旋霉素为大环内酯类抗生素，可用于治疗由革兰氏阳性菌和某些革兰氏阴性菌引起的耳、鼻、喉和呼吸道感染。由于肝胆系统是乙酰螺旋霉素排泄的主要途径，故严重肝功能不全患者慎用该品。农业部第235号文件《动物性食品中兽药最高残留限量》中规定链霉素在牛奶中残留限量为200μg/L，庆大霉素在牛奶中残留限量为200μg/L，新霉素在牛奶中残留限量为500μg/L。欧盟在动物源性食品最高残留限量规定2377/90/EC规定螺旋霉素在牛奶中最大残留限量为200μg/kg。
目前，氨基糖甙类抗生素、大环内酯类抗生素残留监控中免疫测定法仍是最常见的分析手段，免疫分析方法与仪器检测方法相比，样品前处理过程较简单，适合进行大规模现场检测等。胶体金免疫层析试纸条已广泛用于药物残留检测中，具有操作简便、快速、不需要任何设备等优点，目前已成为免疫学检测发展方向之一。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种检测螺旋霉素、链霉素、庆大霉素、新霉素的胶体金快速检测试纸条。
本发明所提供的试纸条包括试纸、微孔试剂，微孔试剂具有微孔塞，试纸包括反应膜、样品吸收垫、吸水垫、保护膜、底板；所述微孔试剂中分别冻干有螺旋霉素单克隆抗体-胶体金标记物、链霉素单克隆抗体-胶体金标记物、庆大霉素单克隆抗体-胶体金标记物和新霉素单克隆抗体-胶体金标记物，反应膜上包括检测线和质控线，均呈与所述试纸的长相垂直的条带状，检测线分别包被有螺旋霉素半抗原-载体蛋白偶联物、链霉素半抗原-载体蛋白偶联物、庆大霉素半抗原-载体蛋白偶联物、新霉素半抗原-载体蛋白偶联物，质控线包被羊抗鼠抗抗体。
所述螺旋霉素半抗原-载体蛋白偶联物是由螺旋霉素半抗原与载体蛋白偶联得到，所述链霉素半抗原-载体蛋白偶联物是由链霉素半抗原与载体蛋白偶联得到，所述庆大霉素半抗原-载体蛋白偶联物是由庆大霉素半抗原与载体蛋白偶联得到，所述新霉素半抗原-载体蛋白偶联物是由新霉素半抗原与载体蛋白偶联得到，所述载体蛋白可为牛血清白蛋白、卵清白蛋白、甲状腺蛋白、血蓝蛋白、人血清白蛋白。
所述螺旋霉素单克隆抗体是以螺旋霉素半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得的，链霉素单克隆抗体是以链霉素半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得的，庆大霉素单克隆抗体是以庆大霉素半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得的，新霉素单克隆抗体是以新霉素半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得的。
所述保护膜粘贴在样品吸收垫上，为检测端，上面有MAX标记线。
所述检测线位于近于有MAX标记的保护膜的一端，所述质控线位于远离有MAX标记的保护膜的一端。
所述底板可为PVC底板或其他硬质不吸水的材料；所述样品吸收垫可为吸滤纸或全血滤膜；所述吸水垫为吸水纸；所述反应膜为硝酸纤维素膜；所述保护膜为PE材质保护膜。
本发明的另一个目的是提供一种制备上述试纸条的方法，其包括步骤：
1）制备冻干有螺旋霉素单克隆抗体-胶体金标记物、链霉素单克隆抗体-胶体金标记物、庆大霉素单克隆抗体-胶体金标记物和新霉素单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂；
2）制备分别包被有螺旋霉素半抗原-载体蛋白偶联物、链霉素半抗原-载体蛋白偶联物、庆大霉素半抗原-载体蛋白偶联物和新霉素半抗原-载体蛋白偶联物的检测线和包被羊抗鼠抗抗体的质控线的反应膜；
3）将2）制备好的反应膜与样品吸收垫、吸水垫、保护膜、底板组装成试纸；
4）将1）和3）制备好的冻干有螺旋霉素单克隆抗体-胶体金标记物、链霉素单克隆抗体-胶体金标记物、庆大霉素单克隆抗体-胶体金标记物和新霉素单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂和试纸组装成试纸条。
具体地说，步骤包括：
1）分别制备螺旋霉素半抗原、链霉素半抗原、庆大霉素半抗原、新霉素半抗原；
2）分别将螺旋霉素半抗原、链霉素半抗原、庆大霉素半抗原、新霉素半抗原与载体蛋白偶联，制备得到螺旋霉素半抗原-载体蛋白偶联物、链霉素半抗原-载体蛋白偶联物、庆大霉素半抗原-载体蛋白偶联物、新霉素半抗原-载体蛋白偶联物；
3）用螺旋霉素半抗原-载体蛋白偶联物、链霉素半抗原-载体蛋白偶联物、庆大霉素半抗原-载体蛋白偶联物、新霉素半抗原-载体蛋白偶联物分别免疫小鼠，将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞通过融合、筛选，分别得到分泌螺旋霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分泌链霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分泌庆大霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株和分泌新霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株；
4）提取小鼠IgG免疫健康山羊，得到羊抗鼠抗抗体；
5）用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金；
6）将制备的螺旋霉素单克隆抗体、链霉素单克隆抗体、庆大霉素单克隆抗体、新霉素单克隆抗体加入到制备的胶体金中，得到螺旋霉素单克隆抗体-胶体金标记物、链霉素单克隆抗体-胶体金标记物、庆大霉素单克隆抗体-胶体金标记物和新霉素单克隆抗体-胶体金标记物；
7）将螺旋霉素单克隆抗体-胶体金标记物、链霉素单克隆抗体-胶体金标记物、庆大霉素单克隆抗体-胶体金标记物和新霉素单克隆抗体-胶体金标记物冻干在微孔试剂中后，将微孔试剂加上微孔塞；
8）将样品吸收垫用含牛血清白蛋白（牛血清白蛋白在缓冲液中的终浓度为0.5%体积百分含量）、pH为7.2、0.1mol/L磷酸盐缓冲液浸泡2h，37℃下烘干2h；
9）在底板上按顺序粘贴上样品吸收垫、反应膜、吸水垫和保护膜；
10）将制备好的微孔试剂、试纸组装成试纸条，2~8℃条件下保存12个月。
本发明的另一个目的是提供一种应用上述试纸条检测样品中螺旋霉素、链霉素、庆大霉素、新霉素残留的方法，它包括步骤：
（1）用试纸条进行检测；
（2）分析检测结果。
本发明中用试纸条检测样品时，将待检样品溶液滴加于微孔试剂中，混匀后室温孵育5min，将标有MAX标记线端向下，插入孵育后的微孔试剂，待检样品液与微孔中的金标抗体结合后一起向反应膜扩散；若待检样品液中待检药物的含量高，则扩散过程中待检样品液中的待检药物可与金标抗体相结合，进而完全封闭金标抗体上待检药物的抗原结合点，阻止金标抗体与反应膜上待检药物半抗原-载体蛋白偶联物结合，检测线不显色，而抗抗体则可与金标抗体结合，质控线显色；若待检样品液中待检药物的含量低或无，则金标抗体上的抗原结合位点不能被封闭，进而金标抗体会与反应膜上药物半抗原-载体蛋白偶联物结合，检测线显色，同时抗抗体也可与金标抗体结合，质控线显色。如果质控线不显色，则试纸失效。如图4a-4k所示。
阴性（-）：C线显色，T线均显色，无论颜色深浅，均表示牛奶样本中螺旋霉素、链霉素、庆大霉素、新霉素浓度均低于检测限。
阳性（+）：C线显色，T1线不显色，表示牛奶样本中螺旋霉素浓度等于或高于检测限；
C线显色，T2线不显色，表示牛奶样本中链霉素浓度等于或高于检测限；
C线显色，T3线不显色，表示牛奶样本中庆大霉素浓度等于或高于检测限；
C线显色，T4线不显色，表示牛奶样本中新霉素浓度等于或高于检测限；
无效：当质控线（C）不显示条带，表明不正确的操作过程或试纸条已失效。
本发明的试纸条具有灵敏度高、特异性强、成本低、操作简单、检测时间短、适合各种单位使用、储存简单、保质期长的优点。将金标抗体冻干在微孔试剂中，在检测过程中，能够使金标抗体与待检样品液充分接触，充分反应，从而减少误差，增加整个体系的反应灵敏度。用本发明试纸条检测螺旋霉素、链霉素、庆大霉素、新霉素的方法，简便、快速、直观、准确、适用范围广、成本低、易推广使用。
附图说明
图1为试纸剖面结构示意图。
图2为试纸俯视图。
图3为微孔试剂图。
图4a-4k为试纸检测结果判定图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1检测螺旋霉素&链霉素&庆大霉素&新霉素的试纸条的构成
一、试纸（图1）
所述试纸是由底板、样品吸收垫、反应膜、吸水垫、保护膜组成；
所述样品吸收垫1、反应膜2、吸水垫3和保护膜7依次按顺序粘贴在底板6上，样品吸收垫的末端与反应膜相连，反应膜的末端与吸水垫相连，样品吸收垫的始端与底板的始端对齐，吸水垫的末端与底板的末端对齐；
所述试纸的样品吸收垫端粘贴有保护膜，保护膜7覆盖在样品吸收垫上的检测端，在检测端保护膜上印有MAX字样（图2）；
所述反应膜上有四条检测线4-1，4-2，4-3，4-4和质控线5，均呈与所述试纸的长相垂直的条带状，检测线位于近于有MAX标记的保护膜的一端，质控线位于远离有MAX标记的保护膜的一端。四条检测线分别包被有螺旋霉素半抗原-载体蛋白偶联物、链霉素半抗原-载体蛋白偶联物、庆大霉素半抗原-载体蛋白偶联物和新霉素半抗原-载体蛋白偶联物，质控线包被有羊抗鼠抗抗体；
所述底板为PVC底板或其他硬质不吸水的材料；所述样品吸收垫可为吸滤纸或全血滤膜；所述吸水垫为吸水纸；所述反应膜为硝酸纤维素膜；所述保护膜为PE材质保护膜。
二、微孔试剂（图3）
所述微孔试剂8具有微孔塞9，微孔试剂上分别冻干有螺旋霉素单克隆抗体-胶体金标记物、链霉素单克隆抗体-胶体金标记物、庆大霉素单克隆抗体-胶体金标记物和新霉素单克隆抗体-胶体金标记物。
将上述试纸、微孔试剂组装成试纸条，在2~8℃环境中保存，有效期12个月。
实施例2实施例1中所述试纸条的制备方法
一、试纸条的制备
试纸条的制备方法主要包括以下步骤：
1）制备冻干有螺旋霉素单克隆抗体-胶体金标记物、链霉素单克隆抗体-胶体金标记物、庆大霉素单克隆抗体-胶体金标记物和新霉素单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂；
2）制备具有分别包被有螺旋霉素半抗原-载体蛋白偶联物、链霉素半抗原-载体蛋白偶联物、庆大霉素半抗原-载体蛋白偶联物和新霉素半抗原-载体蛋白偶联物的检测线和包被羊抗鼠抗抗体的质控线的反应膜；
3）将2）制备好的反应膜与样品吸收垫、吸水垫、保护膜、底板组装成试纸；
4）将1）和3）制备好的冻干有螺旋霉素单克隆抗体-胶体金标记物、链霉素单克隆抗体-胶体金标记物、庆大霉素单克隆抗体-胶体金标记物和新霉素单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂和试纸组装成试纸条。
下面分步详细叙述：
（一）各部件的制备
1.抗原制备
（1）螺旋霉素半抗原-载体蛋白偶联物的制备
a、半抗原的合成
0.85g螺旋霉素在5ml二甲基亚砜（DMSO）中的混合物，60℃下缓慢滴加入0.5ml乙二胺和0.5ml吡啶在10mlDMSO的混合液中，滴加完毕后，继续反应10小时，旋蒸除去溶剂和未反应的乙二胺，定量得到螺旋霉素的乙二胺单缩合物。
b、免疫原的制备
取半抗原30mg用2.7mlN,N-二甲基甲酰胺（DMF）溶解完全，制成Ⅰ液；取50%戊二醛（GA）300μl，加入Ⅰ液中，反应1小时得到Ⅱ液；取牛血清白蛋白（BSA）120mg用7ml0.1mol/LPBS（PH7.0）溶解完全，制成Ⅲ液；将Ⅱ液加入Ⅲ液中，室温反应24小时，用0.01mol/LPBS透析三天，每天换液三次，得免疫原。
c、包被原的制备
同上，将牛血清白蛋白（BSA）换成卵清白蛋白（OVA），制备得到包被原。
（2）链霉素半抗原-载体蛋白偶联物的制备
a、半抗原的合成
1.0g链霉素、0.3g邻苯二甲酸酐和1ml吡啶在20mlDMSO中的混合液，在80℃下搅拌反应24小时，蒸除溶剂，乙醇-水体系中多次重结晶得到邻苯二甲酸单链霉素酯。
b、免疫原的制备
取半抗原40mg用2mlDMF溶解完全，制成Ⅳ液；取BSA80mg用7ml0.1mol/LPBS（pH7.5）溶解完全，制Ⅴ液；将Ⅳ液加入Ⅴ液中，制成Ⅵ液；取碳化二亚胺（EDC）100mg用1ml水溶解后缓冲加入Ⅵ液中，室温搅拌2小时；用0.01mol/LPBS透析三天，每天换液三次，得免疫原。
c、包被原的制备
同上，将BSA换成OVA，制备得到包被原。
（3）庆大霉素半抗原-载体蛋白偶联物的制备
a、半抗原的合成
0.39g溴乙酸叔丁酯在5mlDMSO中的溶液，40℃下缓慢滴加入0.90g庆大霉素和1ml吡啶在10mlDMSO中的混合物中。滴加完毕后，继续反应6小时后，蒸除溶剂。简单柱层析分离后，除去溶剂，加入20mlDMSO和5ml甲酸，室温反应20小时，蒸除溶剂，乙醇-水体系中重结晶得到羧甲基庆大霉素。
b、免疫原的制备
取半抗原35mg用2mlDMF溶解完全，制成A液；取BSA100mg用7ml0.1mol/LPBS（pH7.5）溶解完全，制成B液；将A液加入B液中，制成C液；取EDC100mg用1ml水溶解后缓冲加入C液中，室温搅拌2小时，用0.01mol/LPBS透析三天，每天换液三次，得免疫原。
c、包被原的制备
同上，将BSA换成OVA，制备得到包被原。
（4）新霉素半抗原-载体蛋白偶联物的制备
a、半抗原的合成
0.61g新霉素和10mlDMSO的混合液，室温下缓慢滴加入到0.14g对苯二甲醛的10mlDMSO溶液中，滴加完毕后室温至60℃反应2-4小时，除去溶剂，乙醇-水体系中重结晶得到新霉素对苯二甲醛单缩合物。
b、免疫原的制备
取半抗原30mg用3mlDMF溶解完全，制成D液；取BSA100mg用7ml0.1mol/LPBS（pH7.0）溶解完全，制成E液；将D液加入E液中，制成F液，室温反应24小时；用0.01mol/LPBS透析三天，每天换液三次，得免疫原。
c、包被原的制备
同上，将BSA换成OVA，制备得到包被原。
（5）药物半抗原-载体蛋白偶联物的鉴定
将载体蛋白、螺旋霉素半抗原、螺旋霉素半抗原-载体蛋白偶联物用pH7.4的PBS配成0.5mg/mL的溶液，以0.01mol/LpH7.4PBS调零，用紫外分光光度计在波长200~800nm范围内扫描，得到载体蛋白、螺旋霉素半抗原、螺旋霉素半抗原-载体蛋白偶联物的吸收曲线。三者出现不同的吸收曲线，表明螺旋霉素半抗原与载体蛋白偶联成功。用同样的方法鉴定链霉素半抗原与载体蛋白、庆大霉素半抗原与载体蛋白、新霉素半抗原与载体蛋白偶联物是否偶联成功。
2.单克隆抗体的制备
（1）动物免疫
将上述制备得到的免疫原分别注入Balb/c小鼠体内，免疫剂量为150μg/只，使其产生抗血清。
（2）细胞融合和克隆化
取免疫Balb/c小鼠脾细胞，按8:1（数量配比）比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，筛选得到稳定分泌螺旋霉素的螺旋霉素单克隆抗体的单克隆抗体杂交瘤细胞株、分泌链霉素单克隆抗体的链霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株、分泌庆大霉素单克隆抗体的庆大霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株、分泌新霉素单克隆抗体的新霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株。
（3）细胞冻存和复苏
将杂交瘤细胞用冻存液制成5×106个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。
（4）单克隆抗体的制备与纯化
增量培养法：将杂交瘤细胞置于细胞培养基中，在37℃条件下进行培养，用辛酸-饱和硫酸铵法将得到的培养液进行纯化，得到单克隆抗体，-20℃保存。
所述细胞培养基为向RPMI1640培养基中添加小牛血清和碳酸氢钠，使小牛血清在细胞培养基中的终浓度为20%（质量百分含量），使碳酸氢钠在细胞培养基中的终浓度为0.2%（质量百分含量）；所述细胞培养基的pH为7.4。
3.羊抗鼠抗抗体的制备
以羊作为免疫动物，以鼠源抗体为免疫原对无病原体羊进行免疫，得到羊抗鼠抗抗体。
4.四种单克隆抗体-胶体金标记物的制备
（1）胶体金的制备
用双蒸去离子水将1%氯金酸稀释成0.01%（质量百分含量），取100ml置于锥形瓶中，用恒温电磁搅拌器加热至沸腾，在持续高温、持续搅拌下加入2.5ml1%柠檬酸三钠，继续匀速搅拌加热至溶液呈透亮的红色时停止，冷却至室温后用去离子水恢复到原体积，4℃保存。制备好的胶体金外观纯净、透亮、无沉淀和漂浮物。
（2）分别制备四种单克隆抗体-胶体金标记物
分别制备单克隆抗体-胶体金标记物，在磁力搅拌下，用0.2mol/L碳酸钾调胶体金的pH值至7.2，按每毫升胶体金溶液中加入10~50μg抗体的标准向胶体金溶液中加入上述单克隆抗体，继续搅拌混匀10min，加入10%牛血清白蛋白（BSA）使其在胶体金溶液中的终浓度为1%（体积百分含量），静置10min。12000rpm，4℃离心40min，弃上清液，沉淀用复溶缓冲液洗涤两次，用体积为初始胶体金体积1/10的复溶缓冲液将沉淀重悬，置4℃备用。
复溶缓冲液：含牛血清白蛋白（BSA）0.2%~0.5%（体积百分含量）、吐温-800.05%~0.2%（质量百分含量）、pH7.2的0.02mol/L磷酸盐缓冲液。
5.将四种单克隆抗体-胶体金标记物冻干到微孔试剂上
向微孔试剂微孔中分别加入50μl螺旋霉素单克隆抗体-胶体金标记物、50μl链霉素单克隆抗体-胶体金标记物、50μl庆大霉素单克隆抗体-胶体金标记物、50μl新霉素单克隆抗体-胶体金标记物，放入冷冻干燥机中，在冷阱温度为-50℃条件下，预冻3h后，再真空干燥15h，即可取出，得到冻干有螺旋霉素单克隆抗体-胶体金标记物、链霉素单克隆抗体-胶体金标记物、庆大霉素单克隆抗体-胶体金标记物、新霉素单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂，密封保存。
6.样品吸收垫的制备
将样品吸收垫置于含牛血清白蛋白（牛血清白蛋白在缓冲液中的终浓度为0.5%（体积百分含量））、pH7.2、0.1mol/L磷酸盐缓冲液中浸泡2h，37℃烘2h备用。
7.反应膜的制备
包被过程：分别用磷酸缓冲液将螺旋霉素半抗原-卵清白蛋白偶联物、链霉素半抗原-卵清白蛋白偶联物、庆大霉素半抗原-卵清白蛋白偶联物、新霉素半抗原-卵清白蛋白偶联物稀释到1mg/mL，用Isoflow点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的检测线，包被量为1.0μl/cm；用0.01mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液将羊抗鼠IgG抗体稀释到200μg/mL，用Isoflow点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的质控线，包被量为1.0μl/cm。将包被好的反应膜置于37℃条件下干燥2h，备用。
（二）各部件的组装
1.试纸的组装
将所述样品吸收垫、反应膜、吸水垫、保护膜依次按顺序粘贴在所述底板上；样品吸收垫的末端与反应膜的始端相连，反应膜的末端与吸水垫的始端相连，样品吸收垫的始端与底板的始端对齐，吸水垫的末端与底板的末端对齐；在组装好的试纸样品吸收垫上粘贴保护膜，保护膜上印有MAX标记线。
2.试纸条的组装
将上述步骤1得到的试纸与微孔试剂组装成试纸条，在2~8℃的环境中贮存，有效期12个月。
实施例3样品中螺旋霉素&链霉素&庆大霉素&新霉素的检测
1.用试纸条检测样品
从原包装中取出所需数目的微孔试剂和试纸，并做好标记；吸取待检牛奶样品，用微量移液器移取200μl于微孔中，缓慢抽吸且充分与微孔中试剂混匀，室温（20℃-25℃）孵育5min；将印有“MAX”线端朝下插入微孔中，使之充分浸入溶液中；室温（20℃-25℃）孵育5min后，取出试纸，判定结果。
2.检测结果分析
阴性：C线显色，T线均显色，无论颜色深浅，均表示牛奶样本中螺旋霉素、链霉素、庆大霉素、新霉素浓度均低于检测限，判为阴性，用“－”表示，如图4a。
阳性：C线显色，T1-T4线均不显色，表示牛奶样本中螺旋霉素、链霉素、庆大霉素、新霉素浓度高于或等于检测限，判为阳性，用“+”表示，如图4b；C线显色，T1线不显色，表示牛奶样本中螺旋霉素浓度等于或高于检测限，判为阳性，用“+”表示，如图4c；C线显色，T2线不显色，表示牛奶样本中链霉素浓度等于或高于检测限，判为阳性，用“+”表示，如图4d；C线显色，T3线不显色，表示牛奶样本中庆大霉素浓度等于或高于检测限，判为阳性，用“+”表示，如图4e；C线显色，T4线不显色，表示牛奶样本中新霉素浓度等于或高于检测限，判为阳性，用“+”表示，如图4f。
无效：未出现C线，表明不正确的操作过程或试纸条已失效，如图4g-4k所示。
实施例4试纸条技术参数的确定
1.检测限试验
向空白牛奶样品中分别添加螺旋霉素、庆大霉素标准品至终浓度为0、10、20、40μg/L，添加链霉素标准品至终浓度为0、40、80、160μg/L，添加新霉素标准品至终浓度为0、250、500、1000μg/L，用试纸条进行牛奶样品检测，结果为：当螺旋霉素添加浓度为0、10μg/L时，庆大霉素添加浓度为0、10μg/L时，链霉素添加浓度为0、40μg/L时，新霉素添加浓度为0、250μg/L时，C线显色，T1-T4均显色，呈阴性；当螺旋霉素添加浓度为20、40μg/L时，C线显色，T1不显色，表示牛奶样本中螺旋霉素浓度等于或高于检测限，呈阳性；当链霉素添加浓度为80、160μg/L时，C线显色，T2不显色，表示牛奶样本中链霉素浓度等于或高于检测限，呈阳性；当庆大霉素添加浓度为20、40μg/L时，C线显色，T3不显色，表示牛奶样本中庆大霉素浓度等于或高于检测限，呈阳性；当新霉素添加浓度为500、1000μg/L时，C线显色，T4不显色，表示牛奶样本中新霉素浓度等于或高于检测限，呈阳性；表明本试纸条对牛奶样品螺旋霉素检测限为20μg/L，庆大霉素检测限为20μg/L，链霉素检测限为80μg/L，新霉素检测限为500μg/L。
2.假阳性率、假阴性率试验
取已知螺旋霉素含量大于20μg/L的牛奶阳性样品20份、庆大霉素含量大于20μg/L的牛奶阳性样品20份、链霉素含量大于80μg/L的牛奶阳性样品20份、新霉素含量大于500μg/L的牛奶阳性样品20份、以及牛奶阴性样品20份，用3个批次生产的试纸条分别进行检测，结果见表1、表2。
表1检测阳性样品结果
表2检测阴性样品结果
结果表明：用3个批次生产的试纸条检测含螺旋霉素的阳性牛奶样品时，结果全为阳性，可知阳性样本符合率为100%，假阴性率为0；检测含庆大霉素的阳性牛奶样品时，结果全为阳性，可知阳性样本符合率为100%，假阴性率为0；检测含链霉素的阳性牛奶样品时，结果全为阳性，可知阳性样本符合率为100%，假阴性率为0；检测含新霉素的阳性牛奶样品时，结果全为阳性，可知阳性样本符合率为100%，假阴性率为0。检测20份阴性牛奶样品时，结果全为阴性，可知阴性符合率为100%，假阳性率为0。本发明的检测螺旋霉素、链霉素、庆大霉素、新霉素试纸条可以对牛奶样品中螺旋霉素、链霉素、庆大霉素、新霉素残留进行快速检测。
3.特异性试验
特异性常用交叉反应率表示，是指抗体与结构不同的抗原决定簇发生结合的能力。用该试纸条检测500μg/L的氯霉素、大观霉素、林可霉素、四环素药物，试纸条质控线和检测线均显色，结果均呈阴性，说明本试纸条对这些药物无交叉反应。

Claims (7)

1.一种检测螺旋霉素、链霉素、庆大霉素、新霉素的试纸条，其特征在于包括试纸和微孔试剂，所述试纸包括反应膜、样品吸收垫、吸水垫、保护膜、底板，所述反应膜上有检测线和质控线，检测线分别包被有螺旋霉素半抗原-载体蛋白偶联物、链霉素半抗原-载体蛋白偶联物、庆大霉素半抗原-载体蛋白偶联物和新霉素半抗原-载体蛋白偶联物，质控线包被有羊抗鼠抗抗体，所述微孔试剂中冻干有螺旋霉素单克隆抗体-胶体金标记物、链霉素单克隆抗体-胶体金标记物、庆大霉素单克隆抗体-胶体金标记物和新霉素单克隆抗体-胶体金标记物，所述螺旋霉素半抗原的制备方法是：0.85g螺旋霉素在5ml二甲基亚砜(DMSO)中的混合物，60℃下缓慢滴加入0.5ml乙二胺和0.5ml吡啶在10mlDMSO的混合液中，滴加完毕后，继续反应10小时，旋蒸除去溶剂和未反应的乙二胺，定量得到螺旋霉素的乙二胺单缩合物；所述链霉素半抗原的制备方法是：1.0g链霉素、0.3g邻苯二甲酸酐和1ml吡啶在20mlDMSO中的混合液，在80℃下搅拌反应24小时，蒸除溶剂，乙醇-水体系中多次重结晶得到邻苯二甲酸单链霉素酯；所述庆大霉素半抗原的制备方法是：0.39g溴乙酸叔丁酯在5mlDMSO中的溶液，40℃下缓慢滴加入0.90g庆大霉素和1ml吡啶在10mlDMSO中的混合物中，滴加完毕后，继续反应6小时后，蒸除溶剂，简单柱层析分离后，除去溶剂，加入20mlDMSO和5ml甲酸，室温反应20小时，蒸除溶剂，乙醇-水体系中重结晶得到羧甲基庆大霉素；所述新霉素半抗原的制备方法是：0.61g新霉素和10mlDMSO的混合液，室温下缓慢滴加到0.14g对苯二甲醛的10mlDMSO溶液中，滴加完毕后室温至60℃反应2-4小时，除去溶剂，乙醇-水体系中重结晶得到新霉素对苯二甲醛单缩合物。
2.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于所述试纸由样品吸收垫、反应膜、吸水垫、保护膜依次粘贴在底板上组成，所述微孔试剂上具有微孔塞。
3.根据权利要求2所述的试纸，其特征在于所述保护膜粘贴在样品吸收垫上，为检测端，上面有MAX标记线。
4.根据权利要求3所述的试纸条，其特征在于所述检测线位于近于有MAX标记的保护膜的一端，所述质控线位于远离有MAX标记的保护膜的一端，均呈与所述试纸的长相垂直的条带状。
5.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于所述螺旋霉素单克隆抗体是以螺旋霉素半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得的，链霉素单克隆抗体是以链霉素半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得的，庆大霉素单克隆抗体是以庆大霉素半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得的，新霉素单克隆抗体是以新霉素半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得的。
6.一种制备权利要求1-5任一项所述试纸条的方法，其包括步骤：
1)制备冻干有螺旋霉素单克隆抗体-胶体金标记物、链霉素单克隆抗体-胶体金标记物、庆大霉素单克隆抗体-胶体金标记物和新霉素单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂；
2)制备具有分别包被有螺旋霉素半抗原-载体蛋白偶联物、链霉素半抗原-载体蛋白偶联物、庆大霉素半抗原-载体蛋白偶联物和新霉素半抗原-载体蛋白偶联物的检测线和包被羊抗鼠抗抗体的质控线的反应膜；
3)将2)制备好的反应膜与样品吸收垫、吸水垫、保护膜、底板组装成试纸；
4)将1)和3)制备好的冻干有螺旋霉素单克隆抗体-胶体金标记物、链霉素单克隆抗体-胶体金标记物、庆大霉素单克隆抗体-胶体金标记物和新霉素单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂和试纸组装成试纸条。
7.一种检测样品中螺旋霉素、链霉素、庆大霉素、新霉素残留的方法，其包括步骤：
1)用权利要求1-5任一项所述的试纸条进行检测；
2)分析检测结果。
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