CN201876457U

CN201876457U - 检测磺胺类药物残留的胶体金试纸卡

Info

Publication number: CN201876457U
Application number: CN2010205790155U
Authority: CN
Inventors: 何方洋; 万宇平; 赵正苗; 田甜; 冯才伟; 汪善良; 冯才茂; 何丽霞; 罗晓琴
Original assignee: Beijing Wanger Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Beijing Wanger Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2010-10-21
Filing date: 2010-10-21
Publication date: 2011-06-22
Anticipated expiration: 2020-10-21

Abstract

本实用新型提供了一种检测磺胺类药物残留的胶体金试纸卡，包括底板、附着在底板上依次紧密相连的样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜和吸水垫，结合物释放垫的部分区域覆盖于样品吸收垫之下。在反应膜层上具备包被有磺胺类药物半抗原-载体蛋白偶联物构成的检测线和包被有羊抗鼠IgG构成质控线；结合物释放垫包被有磺胺类药物单克隆抗体-胶体金标记物。本实用新型试纸卡样品吸收垫可以将检测液体充分吸收与结合物释放垫上包被的金标抗体完全接触充分反应，再层析至反应膜上进行反应，可以有效的减少误差。操作简便快速、结果显示形象直观准确、成本低，可同时检测多种磺胺类药物，灵敏度高。本实用新型试纸卡可以在磺胺类药物残留检测中发挥重要作用。

Description

检测磺胺类药物残留的胶体金试纸卡

技术领域

本实用新型属于兽药残留的免疫化学速测技术领域，具体涉及一种检测试纸卡。

背景技术

磺胺类药物是应用广泛的抗菌素，对畜禽疾病控制和治疗起到重要作用，但其同时存在严重副作用，人体中长期存在磺胺类药物会导致许多细菌对磺胺类药物产生耐药性，且磺胺类药物具有潜在的致癌性。我国农业部第235号文件规定其残留限量为100μg/kg。

目前针对磺胺类药物残留的检测方法主要有薄层色谱法(TLC)，高效液相色谱法(HPLC)、液质联用(HPLC/MS)、气相色谱法(GC)，酶联免疫吸附法(ELISA)和毛细管电泳法(HPCE)等。由于复杂的仪器设备和繁琐的前处理过程，仪器分析方法不适合现场监控和大量样本的筛选，其中ELISA方法作为一种新型的动物源食品中磺胺类药物残留筛选方法已经被使用，相对于仪器方法，ELISA方法检测要简单、快捷一些，但是检测时间仍需要1至2个小时左右，还不能够满足现场检测的需求。目前市场上出现了检测磺胺类药物的试纸条，检测所需时间较短，操作方便，但是试纸条本身结构比较复杂，可检测的磺胺类药物种类较少。

实用新型内容

本实用新型的目的在于针对上述不足提供一种灵敏度高、成本低、操作简单、检测时间短、检测磺胺类药物种类多的试纸卡。

本实用新型的试纸卡包括底板、附着在底板上依次紧密相连的样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜和吸水垫，与常规试纸卡不同的是，其中的结合物释放垫不是完全覆盖在样品吸收垫之下，而是部分区域覆盖于样品吸收垫之下，优选结合物释放垫的二分之一至三分之一区域覆盖于样品吸收垫之下。

这样做的好处是可以延长检测结果观察时间，样品吸收垫也可以将检测液体充分吸收与金标抗体完全接触充分反应，再层析至反应膜上进行反应，可以有效的减少误差。还可以防止检测样本中一些干扰成份使金标抗体中的蛋白失去活性，影响金标抗体与包被原的结合。

所述反应膜上分别包被有磺胺类药物半抗原-载体蛋白偶联物构成的检测线和包被羊抗鼠IgG构成的质控线。

本实用新型试纸卡的底板为可为PVC背衬；反应膜可为硝酸纤维素膜或者醋酸纤维素膜；样品吸收垫可由玻璃棉或聚酯材料制成；结合物释放垫可由纤维制成，结合物释放垫层包被有磺胺类药物单克隆抗体-胶体金结合物。在样品吸收垫与结合物释放垫及吸水层上覆盖有保护膜，在保护膜偏向于样品吸收垫的一侧0.5cm喷制样品标记线。

偶联磺胺类药物的载体蛋白可用卵血清蛋白、人血清白蛋白、牛血清白蛋白、血蓝蛋白等，在反应膜上的检测线和质控线相互平行且与样品液流动方向垂直。

本实用新型试纸卡具有如下有益效果：

1.灵敏度高、检测范围广，可检测多种磺胺类药物。磺胺类药物快速检测试纸卡以胶体金标记高亲和力的单克隆为基础制备而成，金标抗体中金颗粒与抗体分子之间无价健形成，二者通过异性电荷间的范德华力相结合，胶体金对单克隆特异性和亲和力影响很小，且具有较高的标记率。因此，快速检测试纸卡具有较高的灵敏度。本实用新型试纸卡对磺胺二甲基嘧啶的检测灵敏度为10μg/L，对磺胺甲基嘧啶的检测灵敏度为20μg/L，对磺胺甲氧哒嗪的检测灵敏度为15μg/L，磺胺氯哒嗪的检测灵敏度为10μg/L，对磺胺对甲氧嘧啶的检测灵敏度为15μg/L，对磺胺喹噁啉的检测灵敏度为10μg/L，磺胺嘧啶的检测灵敏度为15μg/L，对磺胺多辛的检测灵敏度为20μg/L，磺胺苯酰的检测灵敏度为20μg/L，磺胺间二甲氧嘧啶的检测灵敏度为10μg/L，磺胺甲噻二唑的检测灵敏度50μg/L，磺胺异噁唑的检测灵敏度为5μg/L，酞酰磺噻唑的检测灵敏度为20μg/L。

2.操作简便快速。使用快速检测试纸卡时无需任何其它试剂，只要将样品用滴管滴入试剂卡孔内，滴加3滴，加样后计时，5～8min内观察结果。

3.显示检测结果形象、直观准确。快速检测试纸卡以显示红线印迹作为试纸卡的阳性和阴性标记，即在硝酸纤维素膜上只有质控线显示红色表示在被检测样品液中含有磺胺类药物，检测线和质控线均显示红色表示在被检测样品中不含磺胺类药物，结果判定形象、直观、准确、简单明了，不容易出现误判。

4.成本低，投资少。使用快速检测试纸条，不需另配仪器设备及其他试剂，使现场检测一步到位，成本低廉，投资少，见效快。

5.易于大范围推广应用。快速检测试纸卡操作简单，能较好满足不同层次人员的需要，如专业化验、海关检疫、卫生防疫、质量监测、动物产品加工、集化养殖到个体养殖等，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益。

附图说明

图1为磺胺类药物快速检测试纸卡结构示意图，其中，1、样品吸收垫；2、结合物释放垫；3、反应膜；4、吸水垫；5、检测线；6、质控线；7、底板；

图2为磺胺类药物快速检测试纸卡俯视结构示意图，其中8-1和8-2是覆盖在试纸卡两端的保护膜，9为标记线；

图3为磺胺类药物快速检测试纸卡阴性(图3.a)、阳性(图3.b)、无效(图3.c)显色示意图，其中T为质控区，C为检测区。

具体实施方式

实施例1试纸卡的组装

参见图1、图2：样品吸收垫1用玻璃棉制成，结合物释放垫2由纤维制成，吸附有磺胺类药物单克隆抗体-胶体金标记物，反应膜3为硝酸纤维素膜，吸水垫4为吸水材料层制成，检测线5包被有磺胺类药物半抗原-载体蛋白偶联物，检测线位于距离结合物释放垫一侧0.4cm处，质控线6包被有羊抗鼠IgG，底板7为PVC背衬，在PVC背衬上按顺序粘附反应膜、吸水垫、结合物释放垫和样本垫，将样本垫覆盖在结合物释放垫三分之一处，白色保护膜8-1，覆盖在样品吸收垫和结合物释放垫上，在样品吸收垫和结合物释放垫交界处对应保护膜8-1位置偏向于样品吸收垫一方0.5cm处印有标记线9，9的右端印有箭头及max字样，吸水垫4为滤纸层(手柄端)上覆盖有浅蓝色保护膜8-2。

要制成磺胺类药物快速检测试纸卡首先需制备偶联磺胺类药物半抗原-载体蛋白偶联物，用于制备检测线，制备胶体金，用于制备金标抗体，其次须制备羊抗鼠IgG抗体，用于制作质控线。以下是相关材料的制备方法：

1.磺胺类药物半抗原

a)取10g对乙酰氨基苯磺酰氯置100ml圆底烧瓶中，加25ml吡啶溶解，剧烈搅拌下逐滴加入含有0.52g对氨基苯甲酸的吡啶溶液55ml，加毕油浴升温，44℃反应1h.反应停止后，冷却至室温，旋蒸，除去吡啶，用0.01mol/L氢氧化钠溶解，加乙酸乙酯萃取，分出有机相，水洗除去氢氧化钠，蒸干得黄色固体物质0.72g；

b)取6g黄色产品溶解在30ml 0.1mol/L的NaOH水溶液中，油浴升温，回流反应3h，反应结束后，冷却至室温，用1mol/L盐酸调节PH值到弱酸性，用乙酸乙酯萃取两次，合并有机相，水洗，干燥，蒸干得黄色固体产品，乙酸乙酯∶丙酮＝3∶2体系中加热溶解，重结晶得磺胺类半抗原产品。

2.磺胺类药物半抗原-载体蛋白的偶联

1)取磺胺类半抗原5mg溶于0.5ml DMF中，得到I液，向其中加入25mg EDC，活化反应30min得到I液；

2)取卵清蛋白20mg，用2.7ml pH 8.0PBS液溶解，得到II液；

3)将I液加到II液后搅拌反应过夜，得到磺胺类药物载体蛋白偶联物。

3.磺胺类药物半抗原-载体偶联物的鉴定

将载体蛋白、磺胺类药物半抗原、磺胺类药物载体蛋白偶联物用pH7.4的PBS配成0.5mg/ml的溶液，以0.01mol/L pH7.4PBS调零，用紫外分光光度计在波长200-800nm范围内扫描，得到载体蛋白、磺胺类药物半抗原、磺胺类药物半抗原-载体蛋白偶联物的吸收曲线。三者出现不同的吸收曲线，表明磺胺类药物半抗原与载体蛋白偶联成功。

4.抗磺胺类药物单克隆抗体的制备

4.1免疫原的制备

1)磺胺类药物半抗原2mg溶于1ml50％的N，N-二甲基甲酰胺溶液，加入2μl氯甲酸异丁酯，10℃搅拌反应30min；

2)取牛血清白蛋白20mg，溶于1ml 50mmol/L的碳酸盐溶液；

3)将载体蛋白溶液滴加到半抗原溶液中4℃搅拌过夜，得到免疫原；

4)将反应完的人工抗原在0.02mol/L的磷酸盐缓冲液中透析7天，每天换液 3-4次，最后将抗原浓缩或冻干，备用。

4.2动物免疫

将免疫原注入到Balb/c小鼠体内，免疫剂量为100μg/只，使其产生多克隆抗体。小鼠血清测定结果较高后，取其脾细胞，按9∶1比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

4.3细胞冻存和复苏

将磺胺类药物的单克隆杂交瘤细胞株用冻存液制成1×10⁶个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。

4.4单克隆抗体的制备与纯化

将Balb/c小鼠腹腔注入灭菌石蜡油0.5ml/只，7天后腹腔注射磺胺类药物的单克隆杂交瘤细胞株5×10⁷个/只，7天后采集腹水。用辛酸-饱和硫酸铵法进行腹水纯化，-20℃保存。

5.磺胺类药物单克隆抗体-胶体金标记物的制备

5.1胶体金的制备

用双蒸去离子水将1％氯金酸稀释成0.01％，置磁力加热棒搅拌器上搅拌煮沸，每100ml 0.01％氯金酸加入2ml 1％柠檬酸三钠，继续煮沸，至液体呈红色时停止加热，冷却至室温后补足失水。制备好的胶体金外观应纯净、透亮、无沉淀和漂浮物，有效期为一个月。

5.2磺胺类药物单克隆抗体-胶体金标记物的制备

在磁力搅拌下，用0.1mol/L碳酸钾调胶体金的pH值至8.2，按每毫升胶体金溶液加入50μg磺胺类药物单克隆抗体，继续搅拌混匀30min，加入10％BSA至终浓度为1％，静置30min。12000rpm、4℃离心30min，弃上清液，沉淀用复溶缓冲液洗涤两次，用初始胶体金体积1/20的复溶缓冲液将沉淀重悬，置4℃备用，保存60天。

复溶缓冲液：含酪蛋白0.02～0.1％，吐温-200.05～0.2％，PVP-300吡咯烷酮0.2％，0.02mol/L pH7.2的PBS缓冲液。

6.羊抗鼠IgG抗体的制备

羊抗鼠抗抗体的制备：以山羊作为免疫动物，以鼠源抗体为免疫原对无病原体山羊进行免疫，得到羊抗鼠抗抗体。

7.磺胺类药物快速检测试纸卡检测原理

当磺胺类药物检测试纸卡样品垫端滴加待测样品溶液后，待检溶液通过样品垫与结合物释放垫上的金标抗体一起向反应膜扩散，并最终渗入滤纸中，扩散过程中样品中的磺胺类药物可与金标抗体相结合，进而封闭金抗体上磺胺类药物的抗原结合点，阻止金标抗体与反应膜上包被的磺胺类药物半抗原-载体蛋白偶联物结合，检测线不显色，而羊抗鼠IgG抗体则可与金标抗体结合，质控线显色，呈阳性，相反样本溶液中无磺胺类药物则不能阻止金标抗体与反应膜上偶联磺胺类药物半抗原-载体蛋白检测印迹结合，检测线显示红色，同样羊抗鼠IgG抗体也与金标抗体结合，质控线也显示红色，呈阴性，如果反应膜上没有红色标记显示，则试纸卡无效。

6.磺胺类药物快速检测试纸卡检测实施列操作方法

6.1样本前处理：

动物组织(鸡肉、猪肉)样本：称取1.0±0.05g匀质过的组织样本于离心管中，加入1ml 0.02mol/LPBS缓冲液，盖紧瓶盖在80℃水浴锅中水浴10min，取出后静置回至室温后，4000rpm离心5min，取100μl上清液，用400μl 0.02mol/L的PBST缓冲液进行稀释，取样检测。

牛奶样本：取新鲜牛奶样本直接检测。

6.2用试纸卡检测

将样品用滴管滴入试剂卡孔内，滴加3滴，加后计时，5～8min内观察结果。超过10min样品检测判读无效。

6.3检测结果分析

磺胺类药物在样本中的含量高于或等于试纸卡对其的最低检测限时，磺胺类药物单克隆抗体-胶体金标记物与磺胺类药物结合，金标抗体上的抗原结合位点被封闭，从而在检测区内因为竞争反应，不会与磺胺类药物-载体蛋白偶联物结合而不出现红色条带。阴性样本在检测过程中由于缺少抗原抗体竞争反应，将会在检测线和质控线上出现红色条带。如图3所示。

阳性；当质控区显示一条红色条带，而检测区不显色，判为阳性，如图3中间图所示。

阴性：当质控区显示一条红色条带，检测区同时也显示出一条红色条带，且检测区颜色接近或浅于质控区时，判为阴性，如图3左图所示。

无效：当质控区不显示出红色条带，则无论检测区显示出红色条带与否，该试纸卡判为无效，如图3右图所示。

Claims

1.一种检测磺胺类药物残留的胶体金试纸卡，包括底板、附着在底板上依次紧密相连的样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜和吸水垫，其特征在于，结合物释放垫的二分之一至三分之一区域覆盖于样品吸收垫之下。

2.如权利要求1所述的试纸卡，其特征在于，结合物释放垫的三分之一区域覆盖于样品吸收垫之下。

3.如权利要求1或2所述的试纸卡，其特征在于，所述反应膜上具有包被有磺胺类药物半抗原-载体蛋白偶联物构成的检测线和包被羊抗鼠IgG构成的质控线。

4.如权利要求3所述的试纸卡，其特征在于，所述的检测线与质控线平行。

5.如权利要求3所述的试纸卡，其特征在于，检测线位于距离结合物释放垫一侧0.4cm处。

6.如权利要求1或2所述的试纸卡，其特征在于，在试纸卡的两端分别覆盖有保护膜。

7.如权利要求1或2所述的试纸卡，其特征在于，所述底板为PVC背衬，所述反应膜为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜，所述结合物释放垫由纤维制成，所述样品吸收垫由玻璃棉或聚酯材料制成，所述吸水垫为滤纸层。

8.如权利要求1或2所述的试纸卡，其特征在于，所述的结合物释放垫包被有磺胺类药物单克隆抗体-胶体金结合物。

9.如权利要求1或2所示的试纸卡，其特征在于，所述的保护膜偏向于样品吸收垫的一侧0.5cm喷制样品标记线。