CN103105490A - 一种检测四环素类药物的试剂盒及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测四环素类药物的试剂盒及方法。试剂盒包括微孔试剂和试纸，所述微孔试剂中冻干有胶体金标记的四环素类药物特异性抗体，所述四环素类药物特异性抗体可为四环素类药物单克隆抗体或四环素类药物多克隆抗体；所述试纸由样品吸收垫、反应膜、吸水垫、保护膜、底板依次连接组成，所述反应膜上包括检测区和质控区，检测区包被有四环半抗原-载体蛋白偶联物，质控区包被有抗抗体。用本发明试剂盒检测四环素类药物的方法简单、快速、直观、准确、适用范围广、成本低、易推广使用。

Description

一种检测四环素类药物的试剂盒及方法

技术领域

本发明涉及一种检测四环素类药物的试剂盒及方法，具体涉及一种用于检测牛奶样品中四环素类药物的胶体金试纸条及其检测方法。

技术背景

四环素类药物(TCs)具有广谱高效的杀菌抗生功效，可以与大多数药物或饲料添加剂混用，已被广泛应用于畜禽生产中。但过量使用不可避免的造成了严重的药物残留，成为严重危害人类健康的食品安全隐患之一。为此世界各国对TCs残留的检测十分关注。欧盟第675/92号令中初步规定在肌肉及牛奶中的四环素类化合物的总量不得超过100μg/kg，在肾脏、肝脏及鸡蛋中分别不得超过600μg/kg、300μg/kg及200μg/kg。日本肯定列表制度规定奶和鸡蛋中四环素类化合物的总量分别不得超过100ng/mL和400ng/mg。

已报道的四环素类药物残留的检测方法有微生物法、薄层色谱法、高效液相测定法、高效液相色谱-串联质谱法、毛细管电泳、电化学分析、化学发光、酶联免疫法、胶体金免疫法等，仪器检测方法对待测样品的前处理要求高，操作繁琐，需要精密仪器设备。免疫学方法具有快速、灵敏、特异性高等特点，是四环素类药物残留检测的有效方法之一。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种检测四环素类药物的试剂盒。

本发明所提供的试剂盒包括微孔试剂和试纸，微孔试剂具有微孔塞，试纸包括底板、样品吸收垫、反应膜、吸水垫、保护膜，其依次连接；所述微孔试剂中冻干有四环素类药物特异性抗体-胶体金标记物；四环素类药物特异性抗体可为四环素类药物单克隆抗体或四环素类药物多克隆抗体；反应膜上包括检测区和质控区；当四环素类药物特异性抗体为四环素类药物单克隆抗体时，检测区包被四环素半抗原-载体蛋白偶联物，质控区包被羊抗鼠抗抗体；当四环素类药物特异性抗体为四环素类药物多克隆抗体时，检测区包被四环素半抗原-载体蛋白偶联物，质控区包被羊抗兔抗抗体。

所述四环素半抗原-载体蛋白偶联物是由四环素半抗原与载体蛋白偶联得到，所述载体蛋白可为牛血清白蛋白、卵清白蛋白、血蓝蛋白、甲状腺蛋白、人血清白蛋白。

所述四环素类药物特异性抗体-胶体金标记物中的四环素类药物特异性抗体是以四环素半抗原-载体蛋白作为免疫原制备获得。

所述四环素类药物为四环素、金霉素、强力霉素和土霉素。

所述保护膜粘贴样品吸收垫上，为检测端，上面有MAX标记线。

所述检测区位于靠近有MAX标记的保护膜的一端，所述质控区位于远离有MAX标记的保护膜的一端。

所述底板可为PVC底板或其他硬质不吸水的材料；所述样品吸收垫可为吸滤纸或滤油纸；所述吸水垫为吸水纸；所述反应膜可为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜；所述保护膜为PE材质保护膜。

本发明的另一个目的是提供一种制备上述试剂盒的方法，其包括步骤：

1)制备冻干有四环素类药物特异性抗体-胶体金标记物的微孔试剂，将微孔试剂加上微孔塞；

2)制备具有包被四环素半抗原-载体蛋白偶联物的检测区和包被抗抗体的质控区的反应膜；

3)将2)制备好的反应膜与样品吸收垫、吸水垫、保护膜、底板组装成试纸；

4)将1)和3)制备好的冻干有四环素类药物特异性抗体-胶体金标记物的微孔试剂、试纸组装成试剂盒。

具体地说，步骤包括：

1)合成四环素半抗原：取1.1-2.2g四环素，四环素的用量优选为1.1g，0.37-0.75g 4-哌啶甲酸，4-哌啶甲酸的用量优选为0.37g，2-5ml 37％甲醛，甲醛的用量优选为2ml，在50-100ml乙醇中混合，乙醇的用量优选为50ml，在60％微波强度下反应3-5分钟；除去溶剂后，反相柱层析分离，得到黄色固体。

2)将四环素半抗原与载体蛋白偶联，制备四环素类药物-载体蛋白偶联物；

3)用四环素半抗原-载体蛋白偶联物免疫小鼠，将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞通过融合、筛选，得到分泌四环素类药物单克隆抗体的杂交瘤细胞株或用四环素半抗原-载体蛋白免疫兔，得到四环素类药物多克隆抗体；

4)提取小鼠IgG或兔IgG免疫健康山羊，得到羊抗鼠IgG抗体或羊抗兔抗抗体；

5)用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金；

6)将制备的四环素类药物特异性抗体加入到制备的胶体金中，得到四环素类药物特异性抗体-胶体金标记物；

7)将四环素类药物特异性抗体-胶体金标记物冻干在微孔试剂中后，将微孔试剂加上微孔塞；

8)将样品吸收垫用含牛血清白蛋白(牛血清白蛋白在缓冲液中的终浓度为0.5％体积百分含量)、pH为7.2、0.1mol/L磷酸盐缓冲液浸泡2h，37℃下烘干2h；

9)在底板上按顺序粘贴上样品吸收垫、反应膜、吸水垫和保护膜；

10)将制备好的微孔试剂、试纸组装成试剂盒，2～8℃条件下保存12个月。

本发明的另一个目的是提供一种应用上述试剂盒检测牛奶样品中四环素类药物残留的方法，它包括步骤：

(1)用试剂盒进行检测；

(2)分析检测结果。

用本发明上述任一所述试剂盒进行检测。

本发明中用试剂盒检测时，将待检牛奶样品溶液滴加于微孔试剂中，混匀后，孵育5min，将标有MAX标记线端向下，插入孵育后的微孔试剂，待检样品液与微孔中的金标抗体结合后一起向反应膜扩散；若待检样品液中四环素类药物的含量高，则扩散过程中待检样品液中的四环素类药物可与金标抗体相结合，进而完全封闭金标抗体上四环素类药物的抗原结合点，阻止金标抗体与反应膜上四环素半抗原-载体蛋白偶联物结合，检测区不显色，而抗抗体则可与金标抗体结合，质控区显色；若待检样品液中四环素类药物的含量低或无，则金标抗体上的抗原结合位点不能被封闭，进而金标抗体会与反应膜上四环素半抗原-载体蛋白偶联抗原结合，检测区显色，同时抗抗体也可与金标抗体结合，质控区显色。如果质控区不显色，则试纸失效。如图4所示。

阳性：当质控区(C)显示出条带，而检测区(T)不显示，判为阳性，用“+”表示。

阴性：当质控区(C)和检测区(T)均显示出条带，判为阴性，用“-”表示。

无效：当质控区(C)不显示条带，试纸失效。

本发明的试剂盒具有灵敏度高、特异性强、成本低、操作简单、检测时间短等优点。其中，采用高特异性的四环素类药物单克隆抗体，保证了检测结果的可靠性；将金标抗体冻干在微孔试剂中，在检测过程中，能够使金标抗体与待检样品液充分接触，充分反应，增加整个体系的反应灵敏度，不需要将牛奶样品稀释直接将样品滴加于微孔试剂中，操作更简单。用本发明试剂盒检测四环素类药物的方法，简便、快速、直观、准确、适用范围广、成本低、易推广使用。

附图说明

图1为试纸剖面结构示意图。

图2为试纸俯视图。

图3为微孔试剂图。

图4为试纸检测结果判定图。

图5为四环素半抗原合成图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1检测四环素类药物的试剂盒的构成

一、试纸(称作试纸条)(图1)

所述试纸是由底板、样品吸收垫、反应膜、吸水垫、保护膜组成；

所述样品吸收垫1、反应膜2、吸水垫3和保护膜7依次按顺序粘贴在底板6上，样品吸收垫的末端与反应膜相连，反应膜的末端与吸水垫相连，样品吸收垫的始端与底板的始端对齐，吸水垫的末端与底板的末端对齐；

所述试纸样品吸收垫端粘贴有保护膜，保护膜7覆盖在样品吸收垫上的检测端，在检测端保护膜上印有MAX字样(图2)；

所述反应膜上有检测区4和质控区5，均呈与所述试纸条的长相垂直的条带状，检测区位于靠近有MAX标记的保护膜的一端，质控区位于远离有MAX标记的保护膜的一端。检测区包被有四环素半抗原-载体蛋白偶联物，质控区包被有羊抗鼠抗抗体；

所述底板为PVC底板；所述样品吸收垫为吸滤纸；所述吸水垫为吸水纸；所述反应膜为硝酸纤维素膜；所述保护膜为PE材质保护膜。

二、微孔试剂(图3)

所述微孔试剂上冻干有四环素类药物单克隆抗体-胶体金标记物，冻干量0.20～0.25μg/mL；

所述微孔试剂具有微孔塞9。

将上述微孔试剂、试纸组装成试剂盒，在2～8℃环境中保存，有效期12个月。

实施例2实施例1中所述试剂盒的制备方法

一、试剂盒的制备

该试剂盒的制备方法主要包括以下步骤：

1)制备冻干有四环素类药物单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂，将微孔试剂加上微孔塞；

2)制备具有包被四环素半抗原-载体蛋白偶联物的检测区和包被羊抗鼠抗抗体的质控区的反应膜；

3)将2)制备好的反应膜与样品吸收垫、吸水垫、保护膜、底板组装成试纸；

4)将1)和3)制备好的冻干有四环素类药物单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂和试纸组装成试剂盒。

下面分步详细叙述：

(一)各部件的制备

1.四环素半抗原-载体蛋白偶联物的合成与鉴定

(1)四环素半抗原的制备(路线如图5)

取1.1g四环素，0.37g 4-哌啶甲酸，2ml 37％甲醛，在50ml乙醇中混合，在60％微波强度下反应3-5分钟；除去溶剂后，反相柱层析分离，得到黄色固体。

(2)免疫原的制备

将四环素半抗原与牛血清白蛋白(BSA)偶联得到免疫原，具体步骤方法如下：

1)取10mg四环素半抗原用1ml二甲基甲酰胺(DMF)溶解，冷却至10℃，加入10μl氯甲酸异丁酯，10℃搅拌反应30min，得到溶液A；

2)取40mg BSA用3ml 50mmol/L Na₂CO₃溶解，与溶液A混合，10℃反应4h，然后4℃过夜，得到溶液B；

3)溶液B用0.01mol/L PBS 4℃透析3天，每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质，得到免疫原，分装，于-20℃保存备用。

(3)包被原的制备

将四环素半抗原与卵清白蛋白(OVA)偶联得到包被原，具体步骤方法如下：

1)取18mg四环素半抗原溶解于2ml DMF中；

2)取25mg碳化二亚胺(EDC)用0.2ml水充分溶解后加入上述步骤1)的溶液中，室温下搅拌24h，即可得到反应液A；

3)称取OVA 36mg，使之充分溶解在8ml PBS(pH 7.2)中，将反应液A逐滴缓慢滴加到蛋白溶液中，并于室温下搅拌24h，得到溶液B；

4)溶液B用0.01mol/L PBS 4℃透析3天，每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质，得到包被原，分装，于-20℃保存备用。

(4)四环素半抗原-载体蛋白偶联物的鉴定

将载体蛋白、四环素半抗原、四环素半抗原-载体蛋白偶联物用pH7.4的PBS配成0.5mg/mL的溶液，以0.01mol/L pH7.4PBS调零，用紫外分光光度计在波长200～800nm范围内扫描，得到载体蛋白、四环素半抗原、四环素半抗原-载体蛋白偶联物的吸收曲线。三者出现不同的吸收曲线，表明四环素半抗原与载体蛋白偶联成功。

2.四环素类药物单克隆抗体的制备

(1)动物免疫

将步骤1得到的免疫原注入Balb/c小鼠体内，免疫剂量为150μg/只，使其产生抗血清。

(2)细胞融合和克隆化

取免疫Balb/c小鼠脾细胞，按8∶1(数量配比)比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，筛选得到稳定分泌四环素类药物单克隆抗体的四环素类药物单克隆杂交瘤细胞株。

(3)细胞冻存和复苏

将杂交瘤细胞用冻存液制成1×10⁹个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。

(4)单克隆抗体的制备与纯化

增量培养法：将杂交瘤细胞置于细胞培养基中，在37℃条件下进行培养，用辛酸-饱和硫酸铵法将得到的培养液进行纯化，得到单克隆抗体，-20℃保存。

所述细胞培养基为向RPMI-1640培养基中添加小牛血清和碳酸氢钠，使小牛血清在细胞培养基中的终浓度为20％(质量百分含量)，使碳酸氢钠在细胞培养基中的终浓度为0.2％(质量百分含量)；所述细胞培养基的pH为7.4。

3.羊抗鼠抗抗体的制备

以羊作为免疫动物，以鼠源抗体为免疫原对无病原体羊进行免疫，得到羊抗鼠抗抗体。

4.四环素类药物单克隆抗体-胶体金标记物的制备

(1)胶体金的制备

用双蒸去离子水将1％氯金酸(购于sigma公司，产品目录号T09041)稀释成0.01％(质量百分含量)，取100ml置于锥形瓶中，用恒温电磁搅拌器加热至沸腾，在持续高温、持续搅拌下加入2.5ml 1％柠檬酸三钠(购于广州化学试剂厂，产品目录号BG11-AR-01KG)，继续匀速搅拌加热至溶液呈透亮的红色时停止，冷却至室温后用去离子水恢复到原体积，4℃保存。制备好的胶体金外观纯净、透亮、无沉淀和漂浮物。

(2)四环素类药物单克隆抗体-胶体金标记物的制备

在磁力搅拌下，用0.1mol/L碳酸钾调胶体金的pH值至8.2，按每毫升胶体金溶液中加入50～100μg抗体的标准向胶体金溶液中加入上述四环素类药物单克隆抗体，继续搅拌混匀10min，加入5％牛血清白蛋白(BSA)使其在胶体金溶液中的终浓度为1％(体积百分含量)，静置10min。12000rpm，4℃离心60min，弃上清液，沉淀用复溶缓冲液洗涤两次，用体积为初始胶体金体积1/10的复溶缓冲液将沉淀重悬，得到的四环素类药物单克隆抗体-胶体金标记物溶液的浓度为50μg/mL，置4℃备用。

复溶缓冲液：含牛血清白蛋白(BSA)0.1％～0.3％(体积百分含量)、吐温-800.05％～0.2％(质量百分含量)、pH7.2的0.02mol/L磷酸盐缓冲液。

5.将四环素类药物单克隆抗体-胶体金标记物冻干到微孔试剂上

向微孔试剂微孔板中加入100μl四环素类药物单克隆抗体-胶体金标记物，放入冷冻干燥机中，在冷阱温度为-70℃条件下，预冻4h后，再冻干14h，即可取出，得到冻干有四环素类药物单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂，将微孔试剂加上微孔塞。四环素类药物单克隆抗体-胶体金标记物冻干量0.20～0.25μg/mL。

6.样品吸收垫的制备

将样品吸收垫置于含牛血清白蛋白(牛血清白蛋白在缓冲液中的终浓度为0.5％(体积百分含量))、pH7.2、0.1mol/L磷酸盐缓冲液中浸泡2h，37℃烘2h备用。

7.反应膜的制备

包被过程：用磷酸缓冲液将四环素半抗原-卵清白蛋白偶联物稀释到10mg/mL，用Biodot点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的检测区(T)，包被量为1.0μg/cm²；用0.01mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液将羊抗鼠IgG抗体稀释到200μg/mL，用Biodot点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的质控区(C)，包被量为1.0μg/cm²。将包被好的反应膜置于37℃条件下干燥2h，备用。

(二)各部件的组装

1.试纸的组装

将所述样品吸收垫、反应膜、吸水垫、保护膜依次按顺序粘贴在所述底板上；样品吸收垫的末端与反应膜的始端相连，反应膜的末端与吸水垫的始端相连，样品吸收垫的始端与底板的始端对齐，吸水垫的末端与底板的末端对齐；在组装好的试纸的样品吸收垫上粘贴保护膜，保护膜上印有MAX标记线。

2.试剂盒的组装

将上述步骤1得到的试纸、微孔试剂组装成试剂盒，在2～8℃的环境中贮存，有效期12个月。

实施例3牛奶样品中四环素类药物的检测

1.用试剂盒检测

从原包装中取出试剂桶(若低温存放需要预先平衡至室温)，打开后取出所需数目的微孔试剂和试纸条，并做好标记；吸取待检牛奶样品，用微量移液器移取200μl于微孔中，缓慢抽吸且充分与微孔中试剂混匀，室温(20℃-25℃)孵育5min；将标记好的试纸条插入微孔中——印有“MAX”线端朝下，使之充分浸入溶液中；室温(20℃-25℃)孵育5min后，取出试纸条，判定结果。

2.检测结果分析(图4)

阳性：当质控区(C)显示出条带，检测区(T)不显示，判为阳性，用“+”表示，如图4(a)；阴性：当质控区(C)和检测区(T)均显示出条带，判为阴性，用“-”表示，如图4(b)；无效：当质控区(C)不显示条带，试纸失效，如图4(c)和(d)所示。

实施例4试剂盒技术参数的确定

1.灵敏度试验

将四环素、强力霉素、金霉素、土霉素标准品(购自Sigma公司)稀释为以下浓度：四环素0、20、40、80μg/L，强力霉素0、20、40、80μg/L，金霉素0、20、40、80μg/L，土霉素0、40、80、160μg/L；所用稀释液为pH7.2、0.2mol/L的磷酸盐缓冲液。

用试剂盒进行检测，结果为：当四环素标准品浓度为0、20μg/L，强力霉素标准品浓度为0、20μg/L，金霉素标准品浓度为0、20μg/L，土霉素标准品浓度为0、40μg/L时，试纸条上显示出肉眼可见的两条红色条线，呈阴性；当四环素标准品浓度为40、80μg/L，强力霉素标准品浓度为40、80μg/L，金霉素标准品浓度为40、80μg/L，土霉素标准品浓度为80、160μg/L时，试纸条质控区显色，但检测区不显色，呈阳性，表明本试剂盒对四环素、强力霉素、金霉素、土霉素检测灵敏度分别为40μg/L、40μg/L、40μg/L、80μg/L。

2.假阳性率、假阴性率试验

取已知四环素含量大于40μg/L的牛奶阳性样品20份和四环素含量小于40μg/L的牛奶阴性样品20份，用3个批次生产的试剂盒分别进行检测，计算其阴阳性率。结果见表1、表2。

表1、检测阳性样品结果

表2、检测阴性样品结果

结果表明：用3个批次生产的试剂盒检测阳性样品时，结果全为阳性，可知阳性样本符合率为100％，假阴性率为0。检测20份阴性牛奶样品时，结果全为阴性，可知阴性符合率为100％，假阳性率为0。本发明的检测四环素类药物试剂盒可以对四环素类药物残留进行快速检测。

3.特异性试验

特异性常用交叉反应率表示，是指抗体与结构不同的抗原决定簇发生结合的能力。本试剂盒对四环素、强力霉素、金霉素、土霉素的检测灵敏度分别为40μg/L、40μg/L、40μg/L、80μg/L，将牛奶中常检的其他药物(三聚氰胺、磺胺类、氯霉素、氟喹诺酮类、氨基糖苷类和大环内酯类)用pH7.2、0.2mol/L的磷酸盐缓冲液进行稀释，用实施例1中所述的试剂盒进行检测。结果显示，用该试剂盒检测三聚氰胺、磺胺类、氯霉素、氟喹诺酮类、氨基糖苷类和大环内酯类药物时，试纸条质控区和检测区均显色，说明本试剂盒对这些药物无交叉反应。

Claims (9)

1.一种检测四环素类药物的试剂盒，其特征在于包括微孔试剂和试纸，所述试纸包括反应膜、样品吸收垫、吸水垫、保护膜、底板，所述反应膜上有检测区和质控区，检测区包被有四环素半抗原-载体蛋白偶联物，质控区包被有抗抗体，所述微孔试剂中冻干有四环素类药物特异性抗体-胶体金标记物。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述试纸由样品吸收垫、反应膜、吸水垫、保护膜依次粘贴在底板上组成，所述微孔试剂上具有微孔塞。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述保护膜粘贴在样品吸收垫上，为检测端，上面有MAX标记线。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于所述检测区位于靠近有MAX标记的保护膜的一端，所述质控区位于远离有MAX标记的保护膜的一端。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述四环素半抗原是通过四环素与4-哌啶甲酸利用曼尼希反应，在四环素的酰胺的胺基上引入了N-甲基-4-哌啶甲酸基团所得到的衍生物。其分子结构如下：

6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述四环素半抗原-载体蛋白偶联物由四环素半抗原与载体蛋白偶联得到，所述载体蛋白可为牛血清白蛋白、卵清白蛋白、血蓝蛋白、甲状腺蛋白、人血清白蛋白。

7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述四环素药物特异性抗体-胶体金标记物中的四环素药物特异性抗体是以四环素半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得，所述四环素类药物特异性抗体可为四环素类药物单克隆抗体或四环素类药物多克隆抗体。

8.一种制备权利要求1-7任一项所述试剂盒的方法，其包括步骤：

1)制备冻干有四环素类药物特异性抗体-胶体金标记物的微孔试剂，将微孔试剂加上微孔塞；

2)制备具有包被四环素半抗原-载体蛋白偶联物的检测区和包被抗抗体的质控区的反应膜；

3)将2)制备好的反应膜与样品吸收垫、吸水垫、保护膜、底板组装成试纸；

4)将1)和3)制备好的冻干有四环素类药物特异性抗体-胶体金标记物的微孔试剂和试纸组装成试剂盒。

9.一种检测牛奶样品中四环素类药物残留的方法，其包括步骤：

1)用权利要求1-7任一项所述的试剂盒进行检测；

2)分析检测结果。

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