CN101261274A - 胶体金免疫浸出和免疫层析结合快速检测药物残留的方法 - Google Patents

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Abstract

胶体金免疫浸出和免疫层析结合快速检测药物残留的方法是被测样本先在容器中把经过标记的胶体金颗粒浸出、充分混合，检测物和标记物充分免疫结合，然后把此反应液滴加到层析试剂上进行免疫竞争反应，整个检测过程免疫结合和竞争分步进行，此方法反应充分、灵敏度高，同时又集操作简便和快速等优点，应用于种植、养殖、饲养、牧业、食品加工等生产领域现场快速检测食品和饲料中药物残留，也为家庭食品安检提供了简便手段。应用实施本发明的试剂，由五部分组成：硝酸纤维素膜、标签、滤样垫玻纤、PVC底板和容器。

Description

胶体金免疫浸出和免疫层析结合快速检测药物残留的方法
技术领域
本发明是药物残留检测方法，应用免疫化学和免疫学原理，通过胶体金的免疫反应再借助免疫层析技术达到检测低浓度药物残留目的，应用于快速检测食品和饲料中的药物残留。
背景技术
时常摄入含兽药、农药或毒物残留食品，对人危害可想而知，例抗生素可使某些菌株产生耐药性，耐药菌株又能将耐药因子传递给其他敏感细胞，使其他异种菌株变成耐药菌株，导致人体对抗生素的耐药性，如长期食用抗生素残留的食物，使菌群平衡失调或引起核黄素缺乏症和紫癜性损伤，也会造成三致(致畸、致癌、致突变)。牛乳中抗生素的残留量达到相当水平，还会引起酸奶发酵失败，给乳品工业带来严重损失，由此在种植、养殖、饲养、牧业食品加工等生产领域建立快速准确检测食品中药物残留相当迫切。目前主要检测方法有微生物培养法，酶联免疫法，色谱法和胶体金层析法，微生物培养法敏感度低，重复性差，时间长；酶联免疫法和色谱法需用设备、耗时且必须专业人员和实验室才能完成；胶体金层析法，快速简便，此方法把标记抗体的胶体金颗粒包被在多孔疏松支撑物后干燥，检测时样品流经多孔疏松支撑物并将包被标记的胶体金颗粒从多孔疏松支持物溶解下来，同时样本中抗原(药物残留)、包被硝酸纤维素膜上的完全抗原和胶体金标记的抗体进行免疫竞争反应，由于这种免疫竞争反应在溶解和层析过程中同时进行，显然存在以下问题，一是在短时间内标记胶体金从支撑物上溶解不彻底，以致免疫反应不完全；其次样品中被测抗原和包被硝酸纤维素膜上抗原几乎同时竞争标记抗体，这种时间差小影响了检测灵敏；再支撑材料的组织不均匀影响液体的毛细吸现象导致层析均匀不理想等诸多因素造成此法检测灵敏度下降，因此很难通过胶体金免疫竞争层析法检测到ppb级残留。
本发明克服胶体金免疫竞争层析法的缺陷，采用将标记好胶体金抗体包被在类似酶联反的容器(微孔条筒)内，检测时先将被测样品和包被在容器上标记胶体金颗粒溶出，样品中的抗原(药物)同时和标记抗体进行充分反应，然后把此反应液滴加到已包被完全抗原的试条上免疫层析反应。这样解决了胶体金层析法反应时间短、溶解不充分、免疫结合不完全等造成检测灵敏度低的问题，使检测灵敏度显著提高，例用同样原料制成胶体金层析法试剂和本发明方法制成的试剂，检测乳品中相应药物残留，前者青霉素检测到30-40ng/ml，氯霉素10-20ng/ml，四环素300-400ng/ml，后者分别为3-6ng/ml，0.3-1.0ng/ml，50-100ng/ml，显然后者能达到规定要求，由于此方法兼胶体金层析法的优点，快速、简便、准确，此类试剂适合现场快速检测，也为家庭食品安检提供手段。
发明内容
胶体金免疫浸出和免疫层析结合快速检测药物残留的方法是，将标记好胶体金加入类似酶联反的容器(微孔条筒)里抽干，检测时先将被测样品加入此容器并将在容器(微孔条筒)内的胶体金颗粒溶出，然后将混合液滴加到已包被相应的完全抗原的试条或试卡上进行免疫层析反应。整个检测过程分二步进行，即免疫结合和免疫竞争，由于这个特点，所以反应充分，灵敏提高，此方法操作简便，检测是特异性抗原抗体反应，所以具有特异性强、准确性高的特点。
本发明方法是通过以下技术方案和工作原理实现的。特异性抗体标记在胶体金颗粒或彩色乳胶颗粒上，标记物加到容器内抽干，标记物便附着在容器内壁上；将相应完全抗原(药物-BSA结合物)包被并固定硝酸纤维素膜的检测区(T)上，硝酸纤维素膜粘贴在PVC底板上，始端有供加样用的滤样垫玻纤，末端有供助层析用的吸水纸组成试条，或将试条镶嵌入塑卡中，组成试剂。检测时，先将被测样品加入微孔内，把附着在容器壁上的胶体金颗粒溶出、充分混合，同时如被检测样本含有相应的抗原(药物)与标记的胶体金颗粒结合发生免疫反应，此反应液再滴加到试条的加样滤样垫玻纤上进行免疫层析，由于被测样本中相应的抗原(药物)和复溶的金标记抗体发生了免疫反应，此时混合液层析到检测区上时包被抗原无法竞争到标记抗体，检测区内没有出现反应线，即阳性，相反如被测样本没有被测抗原(相应药物)，则标记的抗体层析到检测区时和包被膜上的抗原结合形成紫红线，即阴性。为了证明试剂有效性和易判读，分别在质控区(C)包被羊抗兔IgG为质控线，所以不管结果怎样质控线C始终出现。
应用本发明方法制成的试剂由五部分组成：硝酸纤维素膜、吸水纸、滤样垫玻纤、PVC底板和容器。
硝酸纤维素膜是含有包被在检测区(T)上对应完全抗原(相应的药物-BSA结合物)的检测线，和质控区(C)羊抗兔IgG质控线。
吸水纸贴有印有对应测试药物的名称，方便用户辨认品种。
滤样垫玻纤是用缓冲液处理过用于调整样品pH值的特定滤样垫玻纤。
PVC底板是支撑硝酸纤维素膜、吸水纸和滤样垫玻纤的粘性板。
容器含有干燥标记对应测试药物特异性抗体的胶体金颗粒。
附图说明
附图1是本发明操作方法示意图。
附图2是本发明实施例1的结构示意图。
图中1.硝酸纤维素膜、2.吸水纸、3.滤样垫玻纤、4.PVC底板、5.试剂外壳、6.容器。
附图3是本发明实施例2的结构示意图。
图中1.硝酸纤维素膜、2.吸水纸、3.滤样垫玻纤、4.PVC底板、5.容器。
附图4是本发明实施例1的阳性结果示意图。
附图5是本发明实施例1的阴性结果示意图。
附图6是本发明实施例2的阳性结果示意图。
附图7是本发明实施例2的阴性结果示意图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
实施例1，青霉素残留检测试剂盒。
在图2中，包被有检测青霉素-BSA结合物的硝酸纤维素膜(1)粘贴在PVC底板(4)中间，其顶端粘贴有印刷有青霉素名称的吸水纸(2)，其底端粘贴处理滤样垫玻纤(3)。粘贴有硝酸纤维素膜(1)、吸水纸(2)和滤样垫玻纤(3)的PVC底板(4)放置在试剂外壳(5)，试剂外壳(5)盖紧。标记的抗青霉素的单克隆抗体胶体金颗粒附着在容器(微孔条筒)(6)内壁。
1.将一定浓度的青霉素-BSA结合物和羊抗兔IgG包被于硝酸纤维素膜上的检测线和控制线的位置。
2.将制得的硝酸纤维素膜与处理滤样垫玻纤、贴有印“青霉素”标签吸水纸一起依次粘贴在PVC底板上。
3.将此PVC底板装配在试剂外壳底内，合上试剂外壳盖组装而成。
4.抗青霉素单克隆抗体标记胶体金制备：用柠檬酸三钠还原四氯化金制备粒径40～60nm胶体金，调节pH后每毫升胶体金和10-15ug抗青霉素单克隆抗体混合进行标记并在450nm下测OD。
5.将10-20ul的2-3OD抗青霉素单克隆抗体标记的胶体金加到容器(微孔条筒)内并抽干，容器(微孔条筒)内壁即附着上经标记的胶体金颗粒。
6.检测步骤：
a.吸取一定量的牛奶滴入容器(微孔条筒)内中，用吸管将其中的溶液进行反复吸放，浸出胶体金颗粒，直至容器(微孔条筒)底部及四壁的胶体金全部溶解并混合均匀，约一分钟，即得待检样品。
b.取出试剂盒，平放在桌面上。
c.用吸管吸取混合均匀的样品，滴加2-3滴于加样孔中，并开始计时。
d.在5分钟内读取结果。
e.结果判定：图4为阳性结果(控制线C位置出现红色线条，而检测线T位置不显示红色线条，或出现的红线条颜色明显浅于控制线C时，判为阳性)；图5为阴性结果(检测线T位置出现红色线条，控制线C位置也出现红色线条，判为阴性)。
7.性能指标
灵敏度：应用本实施例，青霉素浓度在4ng/ml以上为阳性。
实施例2，青霉素残留检测试条。
在图3中，包被有检测药物-BSA结合物的硝酸纤维素膜(1)粘贴在PVC底板(4)中间，其顶端粘贴有青霉素名称的吸水纸(2)，其底端粘贴处理滤样垫玻纤并在硝酸纤维素膜和滤样垫玻纤间贴有“MAX”箭头(3)。PVC底板(4)粘贴有硝酸纤维素膜(1)、吸水纸(2)和滤样垫玻纤(3)即成试条。药物单克隆抗体标记的胶体金颗粒干燥后附着在容器(微孔条筒)(6)内壁。
1.将一定浓度的青霉素-BSA结合物和羊抗兔IgG包被于硝酸纤维素膜上的检测线和控制线的位置。
2.将制得的硝酸纤维素膜与处理滤样垫玻纤、贴有印“青霉素”标签吸水纸一起依次粘贴在PVC底板上，并在硝酸纤维素膜和滤样垫玻纤间贴有“MAX”箭头。
8.抗青霉素单克隆抗体标记胶体金制备：用柠檬酸三钠还原四氯化金制备粒径40～60nm胶体金，调节pH后每毫升胶体金和10-15ug抗青霉素单克隆抗体混合进行标记并在450nm下测OD。
9.将10-20ul的2-3OD抗青霉素单克隆抗体标记的胶体金加到容器(微孔条筒)内并抽干，容器(微孔条筒)内壁即附着上经标记的胶体金颗粒。
3.操作步骤：
a.吸取一定量的牛奶滴入容器(微孔条筒)内中，用吸管将其中的溶液进行反复吸放，浸出胶体金颗粒，直至容器(微孔条筒)底部及四壁的胶体金全部溶解并混合均匀，约一分钟，即得待检样品。
a.取出试剂，平放在桌面上。
b.用吸管吸取混合均匀的样品，滴加2-3滴于“MAX”箭头指示以下区域或把试条“MAX”箭头指示以下区域插入样品液体内，并开始计时。
c.在5分钟内读取结果。
d.结果判定：图6为阳性结果(控制线C位置出现红色线条，而检测线T位置不显示红色线条，或出现的红线条颜色明显浅于控制线C时，判为阳性)；图7为阴性结果(检测线T位置出现红色线条，控制线C位置也出现红色线条，判为阴性)。
4.性能指标
灵敏度：应用本实施例，青霉素浓度在4ng/ml以上为阳性。
根据本发明的公开内容，本领域的熟练技术人员无须过多实验即可对本发明所要求保护的内容进行实施，并达到预期效果。本发明公开的实施例仅是对本发明进行详细描述，但并不是构成对本发明的限制。本领域的熟练技术人员用相似替代物或改造，或用某些在化学相似的试剂替代在此描述的试剂，如用彩色乳胶代替胶体金，或对本发明的有关内容进行变动，但不超出本发明的精神、范围和思想，均落入本发明要求保护的范围。

Claims (7)

1. 胶体金免疫浸出和免疫层析结合快速检测药物残留的方法，其特征是，采用检测样品首先浸出干燥后附着在容器内经抗药物单克隆抗体标记的胶体金，在容器内充分混合反应，然后将此反应液滴加到免疫层析试剂盒的加样孔中，含有胶体金的反应液与包被在硝酸纤维素膜上的药物-BSA结合物进行免疫竞争反应，特别适合检测浓度很低的药物残留。
2. 胶体金免疫浸出和免疫层析结合快速检测药物残留的方法，其特征是，经标记的胶体金干燥后附着在容器内。
3. 权利要求2所述的容器，其特征是，容器可以是将标记有抗青霉素特异性抗体的胶体金颗粒干燥后得到的小杯，抗氯霉素特异性抗体的胶体金颗粒干燥后得到的小杯，抗四环素特异性抗体的胶体金颗粒干燥后得到的小杯，抗链霉素特异性抗体的胶体金颗粒干燥后得到的小杯，抗磺胺类特异性抗体的胶体金颗粒干燥后得到的小杯，抗黄曲霉毒素B1特异性抗体的胶体金颗粒干燥后得到的小杯，抗黄曲霉毒素M1特异性抗体的胶体金颗粒干燥后得到的小杯，抗赭曲霉素特异性抗体的胶体金颗粒干燥后得到的小杯等抗抗生素、抗毒素、抗兽药、抗农药特异性抗体的胶体金颗粒干燥后得到的小杯中的一种。
4. 胶体金免疫浸出和免疫层析结合快速检测药物残留的方法，其特征是，样品先加入由权利要求3所述容器，浸出胶体金并与之充分反应，得到反应液。
5. 胶体金免疫浸出和免疫层析结合快速检测药物残留的方法，其特征是，把由权利要求4所述反应液加到试剂上进行层析。
6. 胶体金免疫浸出和免疫层析结合快速检测药物残留的方法的试剂，其特征是，试剂由五部分组成：硝酸纤维素膜、吸水纸、滤样垫玻纤、PVC底板和容器。
7. 一种由权利要求6所述的试剂，其特征是，硝酸纤维素膜可以是包被对应测试抗生素、毒素、兽药、农药等类型中的一种与BSA结合物或其类似蛋白形成的结合物于硝酸纤维素膜上。
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