CN203148952U

CN203148952U - 一种快速检测饲料中黄曲霉毒素b1的胶体金试剂板

Info

Publication number: CN203148952U
Application number: CN 201220714242
Authority: CN
Inventors: 杨敏; 陈笑笑; 王振国; 桑丽雅; 苑淑宾
Original assignee: HANGZHOU NANKAI BIOTECH CO Ltd
Current assignee: HANGZHOU NANKAI BIOTECH CO Ltd
Priority date: 2012-12-04
Filing date: 2012-12-04
Publication date: 2013-08-21
Anticipated expiration: 2022-12-04

Abstract

本实用新型涉及一种快速检测饲料中黄曲霉毒素B₁的胶体金试剂板，可用于快速检测饲料中的黄曲霉毒素B₁。本实用新型试剂板由上下两块塑料模板和背衬组成，背衬上依次紧密粘贴着样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫。硝酸纤维素膜从样品垫到吸水垫方向上依次喷有检测线和质控线，黄曲霉毒素B₁的检测结果能够以肉眼判断。该试剂板可进行半定量直观检测，整个操作过程仅需20min，且无需任何昂贵实验设备辅助，利于大规模样本筛选，适合于工商部门、检验检疫机构、养殖场以及饲料生产加工企业对饲料中黄曲霉毒素B₁进行大规模的快速检测。

Description

一种快速检测饲料中黄曲霉毒素B1的胶体金试剂板

技术领域

本实用新型涉及一种快速检测饲料中黄曲霉毒素B₁的胶体金试剂板，具体涉及一种检测黄曲霉毒素B₁的免疫胶体金快速检测试剂板。

背景技术

黄曲霉毒素(Aflatoxin)是黄曲霉(Aspergillus flavus)和寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)等产生的一组结构类似的次生代谢产物，其中黄曲霉毒素B₁(AFB₁)的检出率高，毒性大，具强致癌性，可抑制动物免疫机能，降低动物生产性能，引起动物继发感染，甚至死亡，还可在动物产品中残留而威胁人类健康。AFB₁对粮食和饲料的危害有不少报道，检出率高达80％～100％。

各种霉菌毒素的毒力和致病性差异很大，黄曲霉毒素被各国列为最重要的毒素。它的毒性要比呕吐毒素的毒性强30倍，比玉米赤霉烯酮的毒性强20倍，极性毒性是氰化钾的10倍，砒霜的68倍，慢性毒性可诱发癌变，致癌能力为二甲基亚硝胺的75倍，比二甲基偶氨苯高900倍，人的原发性肝癌也很可能与黄曲霉毒素有关。肝脏是黄曲霉毒素的靶器官，黄曲霉毒素中毒的症状主要包括肝坏死、黄肝。

黄曲霉毒素B₁的危害已引起不少国家的重视，一些国家已制定了黄曲霉毒素B₁的限量标准。我国GB2761-2011“食品安全国际标准食品中真菌毒素限量”规定了花生及其制品中黄曲霉毒素B₁的允许限量为20μg/kg；GB13078-2001规定饲料中AFB₁的允许限量是：玉米、花生粕、棉粕、菜粕≤50μg/kg，豆粕≤30μg/kg，仔猪配合饲料及浓缩饲料≤10μg/kg，生长育肥猪、种猪配合饲料及浓缩饲料≤20μg/kg，肉用仔鸡后期、生长鸡、产蛋鸡配合饲料及浓缩饲料≤20μg/kg，鱼粉参照豆粕的标准判定，高于相应允许限量算作超标。

目前，黄曲霉毒素B₁的检测方法主要有薄层色谱法、气相色谱-质谱联用法，高效液相色谱法，高效液相色谱-质谱联用法和免疫学检测法。色谱法应用较为普遍，精确度和灵敏度高，但因其流程繁琐、设备昂贵、检测速度慢等原因，难以实现现场检测和普及推广。基于抗原抗体特异性反应建立起来的免疫学测定方法灵敏度高，特异性强，试样预处理简单，分析时间短，使用方便。因此，在现场监控和基层大规模筛选检测中，免疫学检测方法更实际。

胶体金免疫层析法是在免疫渗滤技术的基础上建立的一种简易快速的免疫学检测技术，除了具备酶联免疫法的诸多优点外，还克服了酶联免疫法的一些不足。该方法将反应所需要的原料的全部或大部分均己整合到试剂中，反应通常只需数分钟至数十分钟，检测结果以肉眼可见的显色条带来判读。此法具有简便快速、操作简单、特异性强、不需要额外设备等优点，现已被广泛应用于生物技术的诸多领域。

实用新型内容

本实用新型针对饲料中的黄曲霉毒素B₁残留开展研究，提供一种用于现场快速筛选黄曲霉毒素B₁阳性饲料样本的免疫胶体金快速检测试剂板。本实用新型具有简单、快速、灵敏度高等特点，无须仪器设备配合测定，检测过程不受地点限制，既可在实验室中进行，也可现场测定，20min左右即可完成对样品中黄曲霉毒素B₁的定性测定。

本试剂板由上下两块塑料模板和背衬组成，背衬上依次紧密粘贴着样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫。在样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫相邻的地方有1～2mm的重叠，一方面是为了保证层析作用从样品垫到吸水垫部位的顺利进行，另一方面是为了使样品溶液与样品垫有充分反应时间，样品垫上的缓冲体系可以中和样品溶液的酸碱度，保证样品溶液中的有效成分与胶体金结合垫上的金标抗体顺利发生反应。

该试剂板选取牛血清白蛋白(BSA)和卵清白蛋白(OVA)分别作为偶联AFB₁的免疫原和包被原载体蛋白。胶体金结合垫上喷有抗黄曲霉毒素B₁单克隆抗体与胶体金的结合物，胶体金颗粒的粒径大小约为40nm；硝酸纤维素膜上从样品垫到吸水垫方向依次喷有AFB₁-OVA偶联物和羊抗鼠IgG，分别作为检测线和质控线。

本实用新型试剂板应用层析式抗体免疫竞争原理，通过抗原和金标抗体反应显色，特异性检测饲料中的AFB₁残留。如果样品溶液含有AFB₁残留，AFB₁先和胶体金颗粒上的抗体反应，因此当胶体金颗粒随样品溶液扩散至检测线时，胶体金颗粒上抗体的活性位点因被样品溶液中的AFB₁占据而无法与检测线上AFB₁特异性抗原结合；当样品中的AFB₁含量超过试剂板检出限时，试剂板上的检测线显色较质控线浅甚至无显色，判定为阳性。相反，当样品中AFB₁含量在试剂板检出限以下或无残留时，试剂板上的检测线显色与质控线相近或偏深，判定为阴性。

本实用新型试剂板的各部分组成成分与功能如下：

塑料模板，起固定试纸条及标示功能区(加样孔、检测区、质控区)的作用。

背衬为一面涂有不干胶的不吸水的韧性材料，如PVC板，起固定支持试纸其他组成部分的作用。

样品垫由玻璃纤维制成，起吸收样品溶液与缓冲样品溶液pH值的作用。

胶体金结合垫由聚酯膜制成，其上喷有抗AFB₁单克隆抗体与胶体金的结合物，是样品溶液中的有效成分与金标抗体发生反应的场所。

硝酸纤维素膜主要作用是将反应结果以肉眼可见的颜色表征出来。

吸水垫为滤纸，作为吸水部分其作用是将移动上来的多余的溶液吸收。

本实用新型试剂板具有如下有益效果：

(1)特异性好、灵敏度高、检出限可调

本实用新型试剂板对AFB₁的交叉反应率为100％，与其他种类的霉菌毒素包括呕吐毒素、玉米赤霉烯酮、伏马霉素、赭曲霉素等均没有交叉反应。

本实用新型试剂板的最低检测限可以达到5μg/kg，完全可以满足国家残留限量要求。根据用户不同需求，试剂板可以通过调节样品溶液稀释比例来选择不同的检出限。

(2)操作简便、快速、对实验设备的依赖性小

本实用新型试剂板整个检测过程只需要20min。样品前处理简单，滴样后5～8min内即可用肉眼读取结果。

本实用新型试剂板除样品前处理过程中需要用到小型离心机外，不涉及其他仪器设备，便于野外及现场操作。

(3)成本低，效益好

本实用新型试剂板生产工艺简单，生产成本低，既可检测单个样本，也适用于大批量样品检测，大大降低了检测费用。

附图说明

图1为黄曲霉毒素B₁免疫胶体金快速检测试剂板结构示意图，其中1为样品垫，2为胶体金结合垫，3为硝酸纤维素膜，4为检测线，5为质控线，6为吸水垫，7为不干胶，8为PVC板。

图2为黄曲霉毒素B₁免疫胶体金快速检测试剂板操作示意图，其中Ｓ为加样孔，T为检测区，C为质控区。

图3、4、5为黄曲霉毒素B₁免疫胶体金快速检测试剂板结果判定示意图，其中T为检测区，C为质控区；图3为阴性结果，图4为阳性结果，图5为无效。

具体实施方式

本实用新型试剂板的制备包括黄曲霉毒素B₁-载体蛋白偶联物的制备、抗AFB₁单抗的制备、胶体金溶液的制备、胶体金标记抗AFB₁单抗的制备和黄曲霉毒素B₁免疫胶体金快速检测试剂板的组装。

１、黄曲霉毒素B₁-载体蛋白偶联物的制备

1.1黄曲霉毒素B₁肟(AFB₁O)的制备

2mg AFB₁和4mg羧甲基羟胺半盐酸盐(CMO)溶于3mL吡啶甲醇双蒸水混合液中(0.5mL吡啶+2mL甲醇+0.5mL双蒸水)，控温回流反应3～4h，每隔45min用薄层层析(TLC)检测反应进程，室温搅拌过夜。旋转蒸发仪将溶剂旋干剩余0.5mL体积，加入2mL水，用2mol/L H₂SO₄调节pH为4，溶液变浑浊，用5mL乙酸乙酯萃取2～3次，合并有机相(10mL)，用水洗涤2次，浓缩液体，得黄色油状半固态物质即是AFB₁O。

1.2AFB₁-BSA的制备

称取8.6mg BSA置于10mL螺口瓶中，用０.13mol/L的NaHCＯ₃溶液制成10％BSA活化溶液，测定pH为7.6。称取1mg AFB₁Ｏ、1.073mg N，N-二环己基碳酰亚胺和0.598mg N-羟基琥珀酰亚胺，将其溶解于无水四氢呋喃，30℃振荡4h，然后4000r/min离心15min，并用无水四氢呋喃洗涤沉淀，然后将上清液合并，待上清液中的四氢呋喃挥发完全后，将残留物溶于0.2mL二甲基甲酰胺，并将此溶液缓慢滴加到活化的BSA中，置于磁力搅拌器上，避光室温反应过夜。反应产物在4℃搅拌下用PBS透析3d，每天换液3～6次，透析后得到纯化的AFB₁-BSA，作为免疫原。

1.3AFB₁-OVA的制备

1mg AFB₁O溶解于0.2mL二甲基甲酰胺和水(V∶V＝6∶9)的混合溶液，加入1mg EDC，25℃避光活化4h，再补加1mg EDC。称3.5mg OVA，用0.13mol/L的NaHCO₃溶液制成10％OVA活化溶液，将OVA溶液逐滴加入上述反应液中，室温搅拌反应24h。反应产物在4℃搅拌下用PBS透析3d，每天换液3～6次，透析后得到纯化的AFB₁-OVA，作为包被原。

2、抗AFB₁单抗的制备

2.1动物免疫

取6～8周龄体重约18～20g的雌性BALB/c小鼠，首次免疫用100μg/AFB₁-BSA，与等量完全福氏佐剂混匀，腹腔注射。2周后，用50μgAFB₁-BSA与等量不完全福氏佐剂混匀后，腹腔注射。此后每隔2周用50μgAFB₁-BSA与等量不完全福氏佐剂混匀，腹腔注射。8周后脾内免疫，50μg AFB₁-BSA作为加强免疫，3d后取脾细胞进行融合。

2.2细胞融合

免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)以10∶1体积比混合，用50％聚乙二醇(PEG)作融合剂，融合细胞悬于含20％小牛血清的选择培养基内，分种于加有BALB/c小鼠腹腔渗出细胞作滋养层的96孔细胞培养板中，置5％CO₂37℃孵箱中培养，当镜检杂交瘤克隆生长达1/3-1/2视野时，取上清进行筛选。

2.3杂交瘤筛选及抗体检测

以AFB₁-BSA为包被抗原，用间接非竞争ELISA法筛选分泌抗AFB₁抗体的细胞孔，用黄曲霉毒素B₁间接竞争抑制性ELISA法验证。以免疫小鼠的血清为阳性对照，以SP2/0细胞培养的上清液为空白对照，以细胞培养板中未长出克隆的细胞培养上清为阴性对照，阳性细胞孔的判定标准为(A试验-A空白)/(A对照-A空白)≥2.1。

2.4单抗的生产

体内诱生腹水：给腹腔注射液体石蜡10d后的小鼠腹腔注射克隆化细胞株10⁷个细胞，7d后抽取腹水。

3、胶体金溶液的制备

胶体金颗粒的平均大小为40nm，其制备方法为在100mL去离子水中加入1mL1％柠檬酸三钠，煮沸后迅速加入1mL1％氯金酸，继续煮沸10min，冷却后，4℃下保存备用。

4、胶体金标记抗AFB₁单抗的制备

加入适量0.1mol/L K₂CO₃溶液调节胶体金溶液至pH8.0；电磁搅拌下，将抗体溶液逐滴缓慢加入胶体金溶液中，继续搅拌30min；电磁搅拌下加入10％BSA至终浓度为1％，以稳定金颗粒的残留表位，再搅拌30min；将金标抗体用2000r/min4℃离心20min，弃沉淀；将上清以10000r/min4℃离心25min，弃上清；将沉淀以原体积的金标重悬液溶解，重复离心1～2次，沉淀溶于原体积1/10金标复溶液中，4℃保存备用。

5、黄曲霉毒素B₁免疫胶体金快速检测试剂板的组装

用点膜机把适当浓度的AFB₁-OVA偶联物及羊抗鼠IgG喷在硝酸纤维素膜上，分别作为检测线和质控线，37℃烘箱干燥8h。以同样方法，将制备好的金标记AFB₁单抗包被在胶体金结合垫上。试剂板组成为一个PVC背衬，在其上按顺序粘上样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫。组装完毕后，干燥箱内烘干。然后用切割机将贴好的大卡切割成3.84mm宽的条，装入塑料模板中制成试剂板，再放入带干燥剂的铝箔袋中密闭储存。

6、黄曲霉毒素B₁免疫胶体金快速检测试剂板检测实施操作方法

6.1样品的前处理

称取2g研碎饲料样品于5mL离心管中，加入4mL提取剂，剧烈震荡3min，4000r/min离心5min，分为两层，根据检测限的不同(见下表)，量取不同的上层溶液和专用稀释液，吹打均匀后，待检。

检出限(μg/kg)	上层溶液(mL)	专用稀释液(mL)
			5	0.1	O.1
10	O.1	0.3
			30	0.02	0.24
50	0.01	O.5

6.2检测步骤

吸取待检样品溶液100μL滴加到加样孔中，加样后开始计时；结果应在5～8min读取，其他时间判读无效。

6.3结果判断

读取结果时，将试剂板水平置于观察者正面。

阴性(-)：T线显色(检测线，靠近加样孔一端)比C线(对照线，即质控线)深或一样深，表示样品中黄曲霉毒素B₁残留含量低于检测限或不含黄曲霉毒素B₁残留。

阳性(+)：T线显色比C线浅，或T线无显色，表示样品中黄曲霉毒素B₁残留含量等于或高于检测限，T线显色比C线越浅，表示样品中黄曲霉毒素B₁含量越高。

无效：未出现C线，可能是操作不当或试剂板已失效。应再次阅读说明书，并用新的试剂板重新测试。

Claims

1.一种快速检测饲料中黄曲霉毒素B₁的胶体金试剂板，其特征在于试剂板由上下两块塑料模板和背衬组成，背衬上依次紧密粘贴着样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫各部分之间有1～2mm的重叠，所述胶体金结合垫上喷有抗黄曲霉毒素B₁单克隆抗体与胶体金的结合物，胶体金颗粒的粒径大小约为40nm，所述硝酸纤维素膜上从样品垫到吸水垫方向依次喷有AFB₁-OVA偶联物和羊抗鼠IgG，分别作为检测线和质控线。

2.根据权利要求1所述的试剂板，其特征在于背衬为一面涂有不干胶的PVC板，样品垫由玻璃纤维制成，胶体金结合垫由聚酯膜制成，吸水垫为滤纸。