CN101281195A - 检测生物毒素的胶体金免疫层析试纸及其检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物毒素检测技术领域，尤其涉及一种检测生物毒素的胶体金免疫层析试纸及其检测方法。检测生物毒素的胶体金免疫层析试纸，其包括胶体金标记垫、检测线，胶体金标记垫所包被物质为一种生物毒素抗体或多种生物毒素抗体的胶体金标记物的混合物，检测线的条数与胶体金标记垫包被生物毒素抗体的数目相应，每条检测线上分别包被有与胶体金标记抗体相应的单一的生物毒素检测用抗原。本发明的胶体金免疫层析试纸特异性强；操作简单方便，对牛奶、动物尿液可直接检测，饲料、小麦、玉米、大麦等样品简单处理后即可检测，3－5min以后便可观察结果。本方法适用面宽，能满足食品安全、饲料安全及政府检测机构快速检测生物毒素残留的需求。

Description

检测生物毒素的胶体金免疫层析试纸及其检测方法
技术领域
本发明属于生物毒素检测技术领域，尤其涉及一种检测生物毒素的胶体金免疫层析试纸及其检测方法。
背景技术
生物毒素是一种存在于饲料和饲料原料中的抗营养因子，是由不同类属的真菌所产生的次级有毒代谢产物。动物饲料中生物毒素的污染是一个全球性问题，生物毒素既可在作物田间生长时产生也可在仓储期间产生，或两方面都有，用生物毒素污染的饲料饲喂动物会引起急、慢性中毒症状甚至死亡，而且还会在动物的肉、蛋、奶中残留，威胁到人类自身的健康。
动物饲料中生物毒素主要为霉菌毒素，霉菌毒素是由中温型霉菌产生，在谷物及饲料中常见的产毒素霉菌主要有：曲霉属(aspergillus)、青霉属(penicillium)、镰孢菌属(fusarium)和麦角菌属(claviceps)等。各种霉菌可以产生多达数百种霉菌毒素，然而危害畜禽生产的霉菌毒素主要有：呕吐毒素(Vomitoxin，或称脱氧雪腐镰刀菌烯醇Deoxynivalenol，DON)、玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEA)、伏马菌素B1(fumonisin B1，FB1)、黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1，AFB1)、赭曲霉素A(Ochratoxin A，OTA)等。黄曲霉毒素由于毒性最强很早便受到人们的关注，但现已并非主要的霉菌毒素，目前我国的饲料和原料中，赭曲霉素A、呕吐毒素、伏马毒素B1和玉米赤霉烯酮的污染最为严重，而由多种原料配制的配合饲料受多种霉菌毒素污染的危险也就大大增加。
研究表明，低剂量的霉菌毒素会导致动物免疫抑制，引起疫苗免疫后反应强、抗体水平上不去、影响疫苗的免疫效果，增加疾病感染机率和治疗难度，同时干扰营养物质的利用，极大影响动物的生产性能，如饲料转化率下降、生产速度减慢，繁殖性能降低等。高剂量的霉菌毒素会导致动物中毒发病甚至死亡，其产生的临床中毒症状会因在饲料中的毒素种类、剂量、饲喂时间、毒素间的相互影响以及动物本身的品种、年龄及健康状况而有所不同。在生猪饲养方面，霉菌毒素超标会引起猪轻微的反应，而小猪更为敏感。猪对玉米赤霉烯酮、呕吐毒素、伏马毒素B1、黄曲霉毒素、赭曲霉毒素等多种霉菌毒素均较为敏感，其临床症状通常是患猪不吃，中毒轻者表现生长缓慢，营养不良等慢性征兆以及持续发生轻度传染病，严重者出现持续或间歇性发热，全身皮肤有红点，呕吐，咳嗽，气喘关节肿，蹄部坏疽，顽固性拉稀，便秘，脱肛，流产，假发情，休情，死胎等。
鉴于霉菌毒素的危害性，世界范围内80多个国家依据不同物品制定了各自的限量或推荐限量。目前，我国GB2715-2005粮食卫生标准中对小麦、玉米、大麦中脱氧雪腐镰刀菌烯醇和玉米赤霉烯酮做了限量，要求DON≤1000μg/kg，ZEA≤60μg/kg，GB 13078.2-2006饲料卫生标准中赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮的允许量分别为100μg/kg、500μg/kg。
目前，关于霉菌毒素的检测方法主要有三种：生物学检测法、免疫化学检测法和理化检测方法。但这些方法均存在着一定局限性：生物检测法较为简单、成本低，但其所需时间较长、专一性较差；酶联免疫法(ELISA)是目前被公认为是测定霉菌毒素的最佳方法之一(公开号为：CN1963506A、CN1877332A的中国发明专利申请)，灵敏度高、特异性强、无需贵重仪器设备、对样品纯度要求不高、适用于大批量样品的检测，但该方法仍需要在实验室内完成，耗时1-2小时，无法实现现场快速检测的需求；理化检测方法主要有薄层色谱法、高效液相色谱法、气相色谱法以及色谱-质谱联用等，但薄层色谱法检测灵敏度低且该法需要大量接触标准品、不利于保护操作者的健康，高效液相色谱法、气相色谱法以及色谱-质谱联用等方法灵敏准确，但是仪器昂贵、样品处理烦琐费时、成本高、且需专业人员操作。因此，霉菌毒素在动物饲料中快速、稳定可靠残留检测方法的建立成为国内外亟待解决的技术难题。为了保证我国生猪安全生产的可持续发展和保障猪肉食品的安全性，建立生猪饲料中霉菌毒素快速、精确和灵敏的检测方法具有迫切性和必要性。
发明内容
为了解决上述的技术问题，本发明的第一个目的是在于提供一种简便、灵敏、价格低廉的生物毒素胶体金免疫层析试纸，本发明的另外一个目的是提供使用上述的免疫层析试纸进行生物毒素检测的方法。
为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案：
检测生物毒素的胶体金免疫层析试纸，其包括在底板上依次粘贴的样品吸收垫、胶体金标记垫、检测反应区及吸收垫，检测反应区上设有包被有检测用抗原的检测线和包被有二抗的质控线，胶体金标记垫所包被物质为一种生物毒素抗体或多种生物毒素抗体的胶体金标记物的混合物，所述的检测线的条数与胶体金标记垫包被生物毒素抗体的数目相应，每条检测线上分别包被有与胶体金标记抗体相应的单一的生物毒素检测用抗原。
作为优选，上述的生物毒素抗体为霉菌毒素抗体，上述的生物毒素检测用抗原为霉菌毒素检测用抗原。作为再优选，上述的生物毒素抗体分别为玉米赤霉烯酮、伏马菌素B1、赭曲霉毒素A或呕吐毒素的多克隆抗体或单克隆抗体中的一种或多种，检测用抗原相应的分别为玉米赤霉烯酮、伏马菌素B1、赭曲霉毒素A或呕吐毒素的检测用抗原中的一种或多种。
作为优选，上述的试纸为呕吐毒素、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A和伏马菌素B1四联检测试纸，胶体金标记垫包被物质为呕吐毒素抗体、玉米赤霉烯酮抗体、赭曲霉毒素A抗体和伏马菌素B1抗体胶体金标记物的混合，检测线的条数为4条，每条检测线上分别包被呕吐毒素、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A和伏马菌素B1的检测用抗原。
或者，上述的试纸为呕吐毒素、玉米赤霉烯酮和伏马菌素B1三联检测试纸，胶体金标记垫包被物质为呕吐毒素抗体、玉米赤霉烯酮抗体和伏马菌素B1抗体胶体金标记物的混合，检测线的条数为3条，每条检测线上分别包被呕吐毒素、玉米赤霉烯酮和伏马菌素B1的检测用抗原。
或者，上述的试纸为呕吐毒素、玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A三联检测试纸，胶体金标记垫包被物质为呕吐毒素抗体、玉米赤霉烯酮抗体和赭曲霉毒素A抗体胶体金标记物的混合，检测线的条数为3条，每条检测线上分别包被呕吐毒素、玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A的检测用抗原。
或者，上述的试纸为呕吐毒素、赭曲霉毒素A和伏马菌素B1三联检测试纸，胶体金标记垫包被物质为呕吐毒素抗体、赭曲霉毒素A抗体和伏马菌素B1抗体胶体金标记物的混合，检测线的条数为3条，每条检测线上分别包被呕吐毒素、赭曲霉毒素A和伏马菌素B1的检测用抗原。
或者，上述的试纸为赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮和伏马菌素B1三联检测试纸，胶体金标记垫包被物质为玉米赤霉烯酮抗体、赭曲霉毒素A抗体和伏马菌素B1抗体胶体金标记物的混合，检测线的条数为3条，每条检测线上分别包被玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A和伏马菌素B1的检测用抗原。
或者，上述的试纸为呕吐毒素和玉米赤霉烯酮二联检测试纸，胶体金标记垫包被物质为呕吐毒素抗体和玉米赤霉烯酮抗体胶体金标记物的混合，检测线的条数为2条，每条检测线上分别包被呕吐毒素和玉米赤霉的检测用抗原。
或者，上述的试纸为呕吐毒素和伏马菌素B1二联检测试纸，胶体金标记垫包被物质为呕吐毒素抗体和伏马菌素B1抗体胶体金标记物的混合，检测线的条数为2条，每条检测线上分别包被呕吐毒素和伏马菌素B1的检测用抗原。
或者，上述的试纸为伏马菌素B1和玉米赤霉烯酮二联检测试纸，胶体金标记垫包被物质为伏马菌素B1抗体和玉米赤霉烯酮抗体胶体金标记物的混合，检测线的条数为2条，每条检测线上分别包被伏马菌素B1和玉米赤霉烯酮的检测用抗原。
或者，上述的试纸为伏马菌素B1和赭曲霉毒素A二联检测试纸，胶体金标记垫包被物质为伏马菌素B1抗体和赭曲霉毒素A抗体胶体金标记物的混合，检测线的条数为2条，每条检测线上分别包被伏马菌素B1和赭曲霉毒素A的检测用抗原。
或者，上述的试纸为赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮二联检测试纸，胶体金标记垫包被物质为赭曲霉毒素A抗体和玉米赤霉烯酮抗体胶体金标记物的混合，检测线的条数为2条，每条检测线上分别包被赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮的检测用抗原。
或者，上述的试纸为呕吐毒素和赭曲霉毒素A二联检测试纸，胶体金标记垫包被物质为呕吐毒素抗体和赭曲霉毒素A抗体胶体金标记物的混合，检测线的条数为2条，每条检测线上分别包被呕吐毒素和赭曲霉毒素A的检测用抗原。
或者，上述的试纸为玉米赤霉烯酮检测试纸，胶体金标记垫包被物质为玉米赤霉烯酮抗体胶体金标记物，检测线的条数为1条，检测线上包被玉米赤霉烯酮的检测用抗原。
或者，上述的试纸为伏马菌素B1检测试纸，胶体金标记垫包被物质为伏马菌素B1抗体胶体金标记物，检测线的条数为1条，检测线上包被伏马菌素B1的检测用抗原。
或者，上述的试纸为赭曲霉毒素A检测试纸，胶体金标记垫包被物质为赭曲霉毒素A抗体胶体金标记物，检测线的条数为1条，检测线上包被赭曲霉毒素A的检测用抗原。
作为优选，上述的生物毒素抗体可以采用生物毒素单克隆抗体。
作为优选，检测用抗原为生物毒素与载体物质偶联形成的偶合物，其中载体物质选自蛋白质或蛋白质片段中的一种，如血清白蛋白、球蛋白、脂蛋白。作为再优选，载体物质选自牛血清白蛋白、卵清白蛋白、血蓝蛋白与甲状腺球蛋白中的一种。
本发明的胶体金免疫层析试纸特异性强，4-40℃都可使用；操作简单方便，对牛奶、动物尿液可直接检测，饲料、小麦、玉米、大麦等样品简单处理后即可检测，3-5min以后便可观察结果。本方法适用面宽，能满足食品安全、饲料安全及政府检测机构快速检测生物毒素残留的需求。
附图说明
图1为生物毒素胶体金免疫层析试纸的结构示意图，其中附图标记1为地板，附图标记2为吸收垫、附图标记3为C带、附图标记4为T带、附图标记5为硝酸纤维素膜、附图标记6胶体金垫、附图标记7为样品吸收垫。
图2为四联检测试纸检测结果示意图，结果有效图示。
图3为四联检测试纸检测结果示意图，结果无效图示。
图4为三联检测试纸检测结果示意图，结果有效图示。
图5为三联检测试纸检测结果示意图，结果无效图示。
图6为二联检测试纸检测结果示意图，结果有效图示。
图7为二联检测试纸检测结果示意图，结果无效图示。
图8为单一生物毒素检测试纸检测结果示意图。
具体实施方式
1、生物毒素偶合抗原合成：
(1)玉米赤霉烯酮偶合抗原合成：
取10-20mg载体蛋白溶于1mL的水中，取ZEA(玉米赤霉烯酮，zearalenone)半抗原0.01-0.04mmol溶于二氧六环中，将上述两种溶液缓慢混合。取碳化二亚胺0.02-0.04mmol，溶于1mL水中，逐滴加到混合液中，在20-25℃下，搅拌反应过夜，用盐酸调PH＝6.0，再次加入0.01-0.02mmol碳化二亚胺，后放于4℃冰箱内24-28h，反应完成后将反应液装入透析袋，4℃下，pH＝7.4的PBS中透析，分装，-20℃保存备用。
(2)呕吐毒素抗原的合成：
将10-40mgDON(呕吐毒素)溶解在0.1-0.8ml吡啶中，加入到10ml的反应瓶中，在反应瓶中加入30-120mg的硼酸。混合物在室温下搅拌过夜，再加入30-120mg琥珀酸酐，并通入氮气，密封反应瓶，混合物在沸水浴中搅拌2-3h。将吡啶在室温吹干后，加入5mL乙酸乙酯溶解残余物，离心，取上清液，室温吹干后。加入NHS、DCC溶于尽可能少的DMF中，室温振荡30-60min，离心，取上清液。将上清液缓慢滴加到载体蛋白液中，在4℃振荡反应4h。然后，在0.01M PBS PH7.4中透析，分装，-20℃保存备用。
(3)伏马菌素B1抗原的合成：
取10-40mg载体蛋白，伏马菌素B1 0.01-0.04mmol溶于0.02M PBS PH＝7.4中，室温下搅拌混匀。再缓慢加入0.02-0.06mmol的戊二醛，混合物在室温下搅拌过夜，反应完成后将反应液装入透析袋，4℃下，pH＝7.4的PBS中透析，加入0.01-0.04mmol的伏马菌素B1，后放于4℃冰箱内24h，再加入0.01M Tris继续搅拌4h，反应完成后将反应液装入透析袋，在4℃下透析，分装，-20℃保存备用。
(4)赭曲霉毒素A抗原的合成：
取20-40mg载体蛋白，赭曲霉毒素A 0.02-0.04mmol溶于0.02M PBS PH＝7.4中，室温下搅拌混匀；再缓慢加入0.03-0.06mmol的戊二醛，混合物在室温下搅拌过夜，反应完成后将反应液装入透析袋，4℃下，pH＝7.4的PBS中透析，透析完成后，分装，-20℃保存备用。
2、生物毒素单克隆抗体制备
(1)免疫动物：
取健康6-10周龄雌性二级Balb/c小鼠6只进行免疫。第一次基础免疫将0.5-1.0mg/mL生物毒素免疫用抗原与等量完全弗氏佐剂用搅拌器充分混匀乳化，进行皮下多点注射，注射量0.1-0.3mL/点。三周后开始进行加强免疫，剂量同上，佐剂换为不完全弗氏佐剂，二免后，定期测定抗体效价，每隔三周加强免疫一次，末次免疫3d后取脾脏融合。
(2)脾细胞悬液的制备：
效价高的小鼠，拉颈处死，70％酒精浸泡消毒10min，用手术剪将小鼠腹部剪开一小口，剥开皮肤，露出腹腔，在无菌条件下取出脾脏，用不完全的培养液洗一次，置平皿中不锈钢筛网上，用注射器针芯研磨成细胞悬液后计数。
(3)细胞融合和克隆化：
取对数生长的骨髓瘤细胞，1000rpm离心5分钟，弃上清，用不完全培养液混悬细胞后计数，取所需的细胞数，用不完全培养液洗涤2次。同时制备免疫脾细胞悬液，用不完全培养液洗涤2次。将骨髓瘤细胞与脾细胞按1∶10或1∶5的比例混合在一起，在50ml塑料离心管内用不完全培养液洗1次，1200rpm，5-10分钟。弃上清，轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略加松动。在室温下融合：加入预热的1ml 50％PEG，边加边搅拌；加预热的不完全培养液，终止PEG作用。离心，弃上清，先用6ml左右20％小牛血清轻轻混悬。将融合后细胞悬液加入含有饲养细胞的96孔板，100μl/孔，37℃、5％CO2条件下培养。融合一天后，加HAT选择培养液。融合后7d，用HT培养液换液1次，在13d后根据增殖情况改用20％NBS的完全培养液。待集落长至孔底1/3时，可取上清检测相应的特异性抗体。细胞完全克隆化后，将细胞注入小鼠腹腔，将腹水用蛋白A免疫亲和层析纯化后，即得到生物毒素单克隆抗体。
3、样品吸收垫处理
将醋酸纤维纸浸入pH7.4的PBS中10min，取出，50℃烘干或其他方式干燥。
4、吸收垫处理
将吸水纸室温干燥后，即作为吸收垫。
5、试纸组装
在试纸的底板上依次粘贴有样品吸收垫、胶体金标记垫、检测反应区及吸收垫，即成生物毒素胶体金免疫检测试纸。
本发明所描述的试纸的各部分处理与功能如下：
底板：为一面涂有不干胶的不吸水的韧性材料，如PVC板，起固定支持试纸其他组成部分的作用。
样品吸收垫制备：将醋酸纤维纸浸入pH7.4的PBS中10min，取出，50℃烘干或其他方式干燥。
胶体金标记垫的制备：胶体金溶胶的制备、胶体金标记生物毒素抗体、胶体金标记垫处理。
(1)胶体金溶胶的制备：取250ml三角瓶一个，加100ml超纯水及1ml 1％氯化金，加热沸腾；取2ml的1％柠檬酸钠加入上述溶液中。混匀，再保持沸腾30min，溶液颜色首先变黑，再逐渐变红，即为胶体金溶胶。
(2)胶体金标记生物毒素抗体：磁力搅拌下，用0.1M碳酸钾调胶体金的pH值至8.2，按10-20μg抗体/ml胶体金加入生物毒素抗体，继续搅拌混匀30min，加入10％BSA至终浓度为0.5％，静置30min。12000rpm、4℃离心30min，弃上清，沉淀用1/20初始胶体金体积的0.02M pH9.0的硼酸盐缓冲液(配方：硼酸0.1237g，PEG-20000 1g，用超纯水水定容至1L，调pH至9.0)重悬，置4℃备用，有效期60天。
(3)胶体金标记垫处理：将标记好的抗体倒入一槽中，将玻璃纤维纸浸入1min，取出，室温干燥。
检测反应区制备：硝酸纤维膜上边包被生物毒素检测用抗原线作为检测线(如图2，图3中的T1、T2、T3)，同时包被羊抗鼠IgG线作为质控线(如图2，图3中的C线)。此即为检测反应区，该部分主要作用是将反应结果以肉眼可见的颜色表征出来。
吸收垫制备：将吸水纸室温干燥后，作为吸收垫，作用在于将移动上来的多余的样品溶液吸收。
试纸组装：在试纸的底板上依次粘贴有样品吸收垫、胶体金标记垫、检测反应区及吸收垫，即成生物毒素检测试纸。
检测原理：胶体金标记垫的标记对象为生物毒素抗体，如果样品中含有生物毒素，样品溶液被试纸的样品吸收垫吸收并通过毛细作用上移到达胶体金标记部分，样品溶液中的生物毒素与胶体金标记的生物毒素抗体反应形成结合物，结合物继续上移到检测线，因胶体金标记的生物毒素抗体只有一个结合位点，样品溶液中的相应的生物毒素与之结合后，检测线上的相应的检测用抗原就不能再与胶体金标记的生物毒素抗体结合，于是检测线无色，如图2所示；当样品中没有或低于检测限的相应生物毒素时，胶体金标记的生物毒素抗体到达检测线时被相应的检测用抗原捕获，则形成肉眼可见红色，此即为阴性，如图2所示；无论有无生物毒素，质控线(C线)都显红色；如果都不显色或者质控线(C线)不显红色则表明该试纸已经变质失效，如图3所示。
6、检测方法
(1)牛奶、尿样：
直接滴3滴牛奶或尿于样品垫上，3-5min后，观察颜色。
(2)小麦、玉米、大麦、饲料等样品：
准确称取1g充分研磨的样品，加入2mL PBS(0.01mol/L pH 7.4)中，充分混匀，5000rpm离心10min，取上清液用于检测(注意不要吸到表面的脂肪层)。直接滴3滴于样品垫上，3-5min后，观察颜色。
7、试纸保质期试验：
试纸的保存条件为4-40℃，在常温条件下经过6个月的测定，样品的在试纸上的层析速度、阴性的显色深度、检测灵敏度、实际样品检测准确度均在正常范围内。考虑到冬季和夏季的温度条件，将试纸在40℃和4℃的保存条件下放置6个月，进行稳定性加速试验，结果试纸的各项指标都符合要求。将试纸在70℃条件下可以放置2周，结果试纸的各项指标正常。以上结果表明该试纸可以在常温下的保存时间为2年左右，在40℃和4℃的保存条件下放置6个月以上。
实施例1 呕吐毒素、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A和伏马菌素B1四联检测试纸：
试纸检测线包被有浓度为0.5-2.0mg/mL的生物毒素检测用抗原，如图2所示，T4距离检测区底部4-6mm；质控线包被有浓度为0.5-1.5mg/mL的羊抗鼠IgG，距离检测区顶部4-6mm；C线与T1，T1与T2，T2与T3，T3与T4两条线之间间隔2-4mm。
检测结果判定：
1、如图2中A所示检测线T1、T2、T3、T4和质控线C都显红色，表示检测结果为阴性，表明被检测样品中呕吐毒素、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A和伏马菌素B1三种生物毒素含量低于检测限。
2、如图2中B所示检测线T1、T2、T3和质控线C显红色，检测线T4不显色，检测结果为伏马菌素B1阳性，呕吐毒素、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A阴性，表明被检测样品中伏马菌素B1含量高于检测限，呕吐毒素、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮含量低于检测限。
3、如图2中C所示检测线T1、T2和质控线C显红色，检测线T4、T3不显色，检测结果为呕吐毒素和玉米赤霉烯酮阴性，赭曲霉毒素A和伏马菌素B1阳性，表明被检测样品中呕吐毒素和玉米赤霉烯酮含量低于检测限，赭曲霉毒素A和伏马菌素B1含量高于检测限。
4、如图2中D所示检测线T1和质控线C显红色，检测线T2、T4、T3不显色，检测结果为呕吐毒素阴性，玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A和伏马菌素B1阳性，表明被检测样品中呕吐毒素含量低于检测限，玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A和伏马菌素B1含量高于检测限。
5、如图2中E所示检测线T1、T2、T3、T4都不显色，质控线C显红色，检测结果为呕吐毒素、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A和伏马菌素B1阳性，表明被检测样品中呕吐毒素、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A和伏马菌素B1含量高于检测限。
6、如图2中F所示检测线T2不显色，检测线T1、T3、T4和质控线C都显红色，检测结果为玉米赤霉烯酮阳性，赭曲霉毒素A、呕吐毒素和伏马菌素B1阴性，表明被检测样品玉米赤霉烯酮含量高于检测限，赭曲霉毒素A、呕吐毒素和伏马菌素B1含量低于检测限。
7、如图2中G所示检测线T1不显色，检测线T2、T3、T4和质控线C都显红色，检测结果为呕吐毒素阳性，赭曲霉毒素A、伏马菌素B1和玉米赤霉烯酮阴性，表明被检测样品呕吐毒素含量高于检测限，赭曲霉毒素A、伏马菌素B1和玉米赤霉烯酮含量低于检测限。
8、如图2中H所示检测线T3不显色，检测线T1、T2、T4和质控线C都显红色，检测结果赭曲霉毒素A为阳性，伏马菌素B1、呕吐毒素和玉米赤霉烯酮阴性，表明被检测样品赭曲霉毒素A含量高于检测限，伏马菌素B1、呕吐毒素和玉米赤霉烯酮含量低于检测限。
9、如图2中I所示检测线T3、T2不显色，检测线T1、T4和质控线C都显红色，检测结果为赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮阳性，呕吐毒素和伏马菌素B1阴性，表明被检测样品赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮含量高于检测限，呕吐毒素和伏马菌素B1含量低于检测限。
10、如图2中K所示检测线T1、T2不显色，检测线T3、T4和质控线C都显红色，检测结果为呕吐毒素和玉米赤霉烯酮阳性，赭曲霉毒素A和伏马菌素B1阴性，表明被检测样品呕吐毒素和玉米赤霉烯酮含量高于检测限，赭曲霉毒素A和伏马菌素B1含量低于检测限。
11、如图2中L所示检测线T4、T2不显色，检测线T3、T1和质控线C都显红色，检测结果为伏马菌素B1和玉米赤霉烯酮阳性，呕吐毒素和赭曲霉毒素A阴性，表明被检测样品伏马菌素B1和玉米赤霉烯酮含量高于检测限，呕吐毒素和赭曲霉毒素A含量低于检测限。
12、如图2中M所示检测线T1、T4不显色，检测线T2、T3和质控线C都显红色，检测结果为呕吐毒素和伏马菌素B1阳性，赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮阴性，表明被检测样品呕吐毒素和伏马菌素B1含量高于检测限，赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮含量低于检测限。
13、如图2中N所示检测线T1、T3、T4不显色，检测线T2和质控线C都显红色，检测结果为玉米赤霉烯酮阳性，赭曲霉毒素A、呕吐毒素和伏马菌素B1阴性，表明被检测样品玉米赤霉烯酮含量高于检测限，赭曲霉毒素A、呕吐毒素和伏马菌素B1含量低于检测限。
14、如图2中O所示检测线T3不显色，检测线T1、T2、T4和质控线C都显红色，检测结果为赭曲霉毒素A阳性，伏马菌素B1、呕吐毒素和玉米赤霉烯酮阴性，表明被检测样品赭曲霉毒素A含量高于检测限，伏马菌素B1、呕吐毒素和玉米赤霉烯酮含量低于检测限。
15、如图2中P所示检测线T4不显色，检测线T1、T2、T3和质控线C都显红色，检测结果为伏马菌素B1阳性，赭曲霉毒素A、呕吐毒素和玉米赤霉烯酮阴性，表明被检测样品伏马菌素B1含量高于检测限，赭曲霉毒素A、呕吐毒素和玉米赤霉烯酮含量低于检测限。
16、如图3所示检测线T1、T2、T3、T4和质控线C都不显色，或者质控线C不显红色，检测结果无效。
灵敏度试验：
用PBS配制标准品梯度：0、10、20、50、100ng/ml。用生产的试纸1三批来检测，每批每个浓度重复试验5次。得到的试验结果是以生物毒素试纸1检测玉米赤霉烯酮、呕吐毒素和伏马菌素B1的检测限为20ng/ml，具体结果见表1、表2、表3、表4。
表1 呕吐毒素试纸1灵敏度试验结果
Figure A20081006159800141
表2 玉米赤霉烯酮试纸1灵敏度试验结果
Figure A20081006159800142
表3 伏马菌素B1试纸1灵敏度试验结果
Figure A20081006159800143
表4 赭曲霉毒素A试纸1灵敏度试验结果
Figure A20081006159800144
注：“-”表示检测结果阴性，“+”表示检测结果阳性。
试纸的准确度试验
在牛奶、尿样、饲料、玉米、大麦、小麦等经确证为阴性样品中添加生物毒素使样品中的生物毒素浓度为10ng/g、20ng/g、50ng/g、100ng/g。经过前处理后检测，每个样品重复5次，检测结果与标准品溶液检测结果的检测限符合率100％。具体结果见表5、表6、表7、表8。
表5 呕吐毒素试纸1准确度试验结果
表6 玉米赤霉烯酮试纸1准确度试验结果
Figure A20081006159800152
表7 伏马菌素B1试纸1准确度试验结果
Figure A20081006159800153
  牛奶   -   -   +   +   +
  尿   -   -   +   +   +
  饲料   -   -   +   +   +
  玉米   -   -   +   +   +
  大麦   -   -   +   +   +
  小麦   -   -   +   +   +
表8 赭曲霉毒素A试纸1准确度试验结果
Figure A20081006159800161
注：“-”表示检测结果阴性，“+”表示检测结果阳性。
实施例2 呕吐毒素、玉米赤霉烯酮和伏马菌素B1三联检测试纸：
试纸检测线包被有浓度为0.5-2.0mg/mL的生物毒素检测用抗原，如图4所示，T3距离检测区底部6-8mm；质控线包被有浓度为0.5-1.5mg/mL的羊抗鼠IgG，距离检测区顶部6-8mm；C线与T1，T1与T2，T2与T3两条线之间间隔2-4mm。
检测结果判定：
1、如图4中A所示检测线T1、T2、T3和质控线C都显红色，表示检测结果为阴性，表明被检测样品中呕吐毒素、玉米赤霉烯酮和伏马菌素B1三种生物毒素含量低于检测限。
2、如图4中B所示检测线T1、T2和质控线C显红色，检测线T3不显色，检测结果为伏马菌素B1阳性，呕吐毒素、玉米赤霉烯酮阴性，表明被检测样品中伏马菌素B1含量高于检测限，呕吐毒素和玉米赤霉烯酮含量低于检测限。
3、如图4中C所示检测线T1和质控线C显红色，检测线T2、T3不显色，检测结果为呕吐毒素阴性，玉米赤霉烯酮和伏马菌素B1阳性，表明被检测样品中呕吐毒素含量低于检测限，玉米赤霉烯酮和伏马菌素B1含量高于检测限。
4、如图4中D所示检测线T1、T2、T3不显色，质控线C显红色，检测结果为呕吐毒素、玉米赤霉烯酮和伏马菌素B1阳性，表明被检测样品中呕吐毒素、玉米赤霉烯酮和伏马菌素B1含量高于检测限。
5、如图4中E所示检测线T1、T2不显色，检测线T3和质控线C都显红色，检测结果为呕吐毒素和玉米赤霉烯酮阳性，伏马菌素B1阴性，表明被检测样品呕吐毒素和玉米赤霉烯酮含量高于检测限，伏马菌素B1含量低于检测限。
6、如图4中F所示检测线T1不显色，检测线T2、T3和质控线C都显红色，检测结果为呕吐毒素阳性，玉米赤霉烯酮和伏马菌素B1地西泮阴性，表明被检测样品中呕吐毒素含量高于检测限，玉米赤霉烯酮和伏马菌素B1含量低于检测限。
7、如图4中G所示检测线T2不显色，检测线T1、T3和质控线C都显红色，检测结果为呕吐毒素和伏马菌素B1阴性，玉米赤霉烯酮阳性，表明被检测样品中呕吐毒素和伏马菌素B1含量低于检测限，玉米赤霉烯酮含量高于检测限。
8、如图4中H所示检测线T1、T3不显色，检测线T2和质控线C都显红色，检测结果为玉米赤霉烯酮阴性，呕吐毒素和伏马菌素B1阳性，表明被检测样品中玉米赤霉烯酮含量低于检测限，呕吐毒素和伏马菌素B1含量高于检测限。
9、如图5所示检测线T1、T2、T3和质控线C都不显色，或者质控线C不显红色，检测结果无效。
灵敏度试验：
用PBS配制标准品梯度：0、10、20、50、100ng/ml。用生产的试纸2三批来检测，每批每个浓度重复试验5次。得到的试验结果是以生物毒素试纸2检测玉米赤霉烯酮、呕吐毒素和伏马菌素B1的检测限为20ng/ml，具体结果见表1-1、表2-1、表3-1。
表1-1 呕吐毒素试纸2灵敏度试验结果
Figure A20081006159800171
表2-1 玉米赤霉烯酮试纸2灵敏度试验结果
Figure A20081006159800181
表3-1 伏马菌素B1试纸2灵敏度试验结果
Figure A20081006159800182
注：“-”表示检测结果阴性，“+”表示检测结果阳性。
试纸的准确度试验
在牛奶、尿样、饲料、玉米、大麦、小麦等经确证为阴性样品中添加生物毒素使样品中的生物毒素浓度为10ng/g、20ng/g、50ng/g、100ng/g。经过前处理后检测，每个样品重复5次，检测结果与标准品溶液检测结果的检测限符合率100％。具体结果见表4-1、表5-1、表6-1。
表4-1 呕吐毒素试纸2准确度试验结果
Figure A20081006159800183
表5-1 玉米赤霉烯酮试纸2准确度试验结果
Figure A20081006159800191
表6-1 伏马菌素B1试纸2准确度试验结果
Figure A20081006159800192
注：“-”表示检测结果阴性，“+”表示检测结果阳性。
实施例3 赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮和伏马菌素B1三联检测试纸：
试纸检测线包被有浓度为0.5-2.0mg/mL的生物毒素检测用抗原，如图4所示，T3距离检测区底部6-8mm；质控线包被有浓度为0.5-1.5mg/mL的羊抗鼠IgG，距离检测区顶部6-8mm；C线与T1，T1与T2，T2与T3两条线之间间隔2-4mm。
检测结果判定：
1、如图4中A所示检测线T1、T2、T3和质控线C都显红色，表示检测结果为阴性，表明被检测样品中赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮和伏马菌素B1三种生物毒素含量低于检测限。
2、如图4中B所示检测线T1、T2和质控线C显红色，检测线T3不显色，检测结果为伏马菌素B1阳性，赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮阴性，表明被检测样品中伏马菌素B1含量高于检测限，赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮含量低于检测限。
3、如图4中C所示检测线T1和质控线C显红色，检测线T2、T3不显色，检测结果为赭曲霉毒素A阴性，玉米赤霉烯酮和伏马菌素B1阳性，表明被检测样品中赭曲霉毒素A含量低于检测限，玉米赤霉烯酮和伏马菌素B1含量高于检测限。
4、如图4中D所示检测线T1、T2、T3不显色，质控线C显红色，检测结果为赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮和伏马菌素B1阳性，表明被检测样品中赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮和伏马菌素B1含量高于检测限。
5、如图4中E所示检测线T1、T2不显色，检测线T3和质控线C都显红色，检测结果为赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮阳性，伏马菌素B1阴性，表明被检测样品赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮含量高于检测限，伏马菌素B1含量低于检测限。
6、如图4中F所示检测线T1不显色，检测线T2、T3和质控线C都显红色，检测结果为赭曲霉毒素A阳性，玉米赤霉烯酮和伏马菌素B1地西泮阴性，表明被检测杆品中赭曲霉毒素A含量高于检测限，玉米赤霉烯酮和伏马菌素B1含量低于检测限。
7、如图4中G所示检测线T2不显色，检测线T1、T3和质控线C都显红色，检测结果为赭曲霉毒素A和伏马菌素B1阴性，玉米赤霉烯酮阳性，表明被检测样品中赭曲霉毒素A和伏马菌素B1含量低于检测限，玉米赤霉烯酮含量高于检测限。
8、如图4中H所示检测线T1、T3不显色，检测线T2和质控线C都显红色，检测结果为玉米赤霉烯酮阴性，赭曲霉毒素A和伏马菌素B1阳性，表明被检测样品中玉米赤霉烯酮含量低于检测限，赭曲霉毒素A和伏马菌素B1含量高于检测限。
9、如图5所示检测线T1、T2、T3和质控线C都不显色，或者质控线C不显红色，检测结果无效。
灵敏度试验：
用PBS配制标准品梯度：0、10、20、50、100ng/ml。用生产的试纸3三批来检测，每批每个浓度重复试验5次。得到的试验结果是以生物毒素试纸3检测玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A和伏马菌素B1的检测限为20ng/ml，具体结果见表1-2、表2-2、表3-2。
表1-2 赭曲霉毒素A试纸3灵敏度试验结果
表2-2 玉米赤霉烯酮试纸3灵敏度试验结果
表3-2 伏马菌素B1试纸3灵敏度试验结果
Figure A20081006159800212
注：“-”表示检测结果阴性，“+”表示检测结果阳性。
试纸的准确度试验
在牛奶、尿样、饲料、玉米、大麦、小麦等经确证为阴性样品中添加生物毒素使样品中的生物毒素浓度为10ng/g、20ng/g、50ng/g、100ng/g。经过前处理后检测，每个样品重复5次，检测结果与标准品溶液检测结果的检测限符合率100％。具体结果见表4-2、表5-2、表6-2。
表4-2 赭曲霉毒素A试纸3准确度试验结果
Figure A20081006159800213
表5-2 玉米赤霉烯酮试纸3准确度试验结果
Figure A20081006159800221
表6-2 伏马菌素B1试纸3准确度试验结果
注：“-”表示检测结果阴性，“+”表示检测结果阳性。
实施例4 呕吐毒素、赭曲霉毒素A和伏马菌素B1三联检测试纸：
试纸检测线包被有浓度为0.5-2.0mg/mL的生物毒素检测用抗原，如图4所示，T3距离检测区底部6-8mm；质控线包被有浓度为0.5-1.5mg/mL的羊抗鼠IgG，距离检测区顶部6-8mm；C线与T1，T1与T2，T2与T3两条线之间间隔2-4mm。
检测结果判定：
1、如图4中A所示检测线T1、T2、T3和质控线C都显红色，表示检测结果为阴性，表明被检测样品中呕吐毒素、赭曲霉毒素A和伏马菌素B1三种生物毒素含量低于检测限。
2、如图4中B所示检测线T1、T2和质控线C显红色，检测线T3不显色，检测结果为伏马菌素B1阳性，呕吐毒素、赭曲霉毒素A阴性，表明被检测样品中伏马菌素B1含量高于检测限，呕吐毒素和赭曲霉毒素A含量低于检测限。
3、如图4中C所示检测线T1和质控线C显红色，检测线T2、T3不显色，检测结果为呕吐毒素阴性，赭曲霉毒素A和伏马菌素B1阳性，表明被检测样品中呕吐毒素含量低于检测限，赭曲霉毒素A和伏马菌素B1含量高于检测限。
4、如图4中D所示检测线T1、T2、T3不显色，质控线C显红色，检测结果为呕吐毒素、赭曲霉毒素A和伏马菌素B1阳性，表明被检测样品中呕吐毒素、赭曲霉毒素A和伏马菌素B1含量高于检测限。
5、如图4中E所示检测线T1、T2不显色，检测线T3和质控线C都显红色，检测结果为呕吐毒素和赭曲霉毒素A阳性，伏马菌素B1阴性，表明被检测样品呕吐毒素和赭曲霉毒素A含量高于检测限，伏马菌素B1含量低于检测限。
6、如图4中F所示检测线T1不显色，检测线T2、T3和质控线C都显红色，检测结果为呕吐毒素阳性，赭曲霉毒素A和伏马菌素B1地西泮阴性，表明被检测样品中呕吐毒素含量高于检测限，赭曲霉毒素A和伏马菌素B1含量低于检测限。
7、如图4中G所示检测线T2不显色，检测线T1、T3和质控线C都显红色，检测结果为呕吐毒素和伏马菌素B1阴性，赭曲霉毒素A阳性，表明被检测样品中呕吐毒素和伏马菌素B1含量低于检测限，赭曲霉毒素A含量高于检测限。
8、如图4中H所示检测线T1、T3不显色，检测线T2和质控线C都显红色，检测结果为赭曲霉毒素A阴性，呕吐毒素和伏马菌素B1阳性，表明被检测样品中赭曲霉毒素A含量低于检测限，呕吐毒素和伏马菌素B1含量高于检测限。
9、如图5所示检测线T1、T2、T3和质控线C都不显色，或者质控线C不显红色，检测结果无效。
灵敏度试验：
用PBS配制标准品梯度：0、10、20、50、100ng/ml。用生产的试纸4三批来检测，每批每个浓度重复试验5次。得到的试验结果是以生物毒素试纸4检测赭曲霉毒素A、呕吐毒素和伏马菌素B1的检测限为20ng/ml，具体结果见表1-3、表2-3、表3-3。
表1-3 呕吐毒素试纸4灵敏度试验结果
Figure A20081006159800231
  试纸4批3   -   -   -   +   +   +
表2-3 赭曲霉毒素A试纸4灵敏度试验结果
Figure A20081006159800241
表3-3 伏马菌素B1试纸4灵敏度试验结果
Figure A20081006159800242
注：“-”表示检测结果阴性，“+”表示检测结果阳性。
试纸的准确度试验
在牛奶、尿样、饲料、玉米、大麦、小麦等经确证为阴性样品中添加生物毒素使样品中的生物毒素浓度为10ng/g、20ng/g、50ng/g、100ng/g。经过前处理后检测，每个样品重复5次，检测结果与标准品溶液检测结果的检测限符合率100％。具体结果见表4-3、表5-3、表6-3。
表4-3 呕吐毒素试纸4准确度试验结果
Figure A20081006159800243
  小麦   -   -   +   +   +
表5-3 赭曲霉毒素A试纸4准确度试验结果
Figure A20081006159800251
表6-3 伏马菌素B1试纸4准确度试验结果
Figure A20081006159800252
注：“-”表示检测结果阴性，“+”表示检测结果阳性。
实施例5 呕吐毒素、玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A三联检测试纸：
试纸检测线包被有浓度为0.5-2.0mg/mL的生物毒素检测用抗原，如图4所示，T3距离检测区底部6-8mm；质控线包被有浓度为0.5-1.5mg/mL的羊抗鼠IgG，距离检测区顶部6-8mm；C线与T1，T1与T2，T2与T3两条线之间间隔2-4mm。
检测结果判定：
1、如图4中A所示检测线T1、T2、T3和质控线C都显红色，表示检测结果为阴性，表明被检测样品中呕吐毒素、玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A三种生物毒素含量低于检测限。
2、如图4中B所示检测线T1、T2和质控线C显红色，检测线T3不显色，检测结果为赭曲霉毒素A阳性，呕吐毒素、玉米赤霉烯酮阴性，表明被检测样品中赭曲霉毒素A含量高于检测限，呕吐毒素和玉米赤霉烯酮含量低于检测限。
3、如图4中C所示检测线T1和质控线C显红色，检测线T2、T3不显色，检测结果为呕吐毒素阴性，玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A阳性，表明被检测样品中呕吐毒素含量低于检测限，玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A含量高于检测限。
4、如图4中D所示检测线T1、T2、T3不显色，质控线C显红色，检测结果为呕吐毒素、玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A阳性，表明被检测样品中呕吐毒素、玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A含量高于检测限。
5、如图4中E所示检测线T1、T2不显色，检测线T3和质控线C都显红色，检测结果为呕吐毒素和玉米赤霉烯酮阳性，赭曲霉毒素A阴性，表明被检测样品呕吐毒素和玉米赤霉烯酮含量高于检测限，赭曲霉毒素A含量低于检测限。
6、如图4中F所示检测线T1不显色，检测线T2、T3和质控线C都显红色，检测结果为呕吐毒素阳性，玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A地西泮阴性，表明被检测样品中呕吐毒素含量高于检测限，玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A含量低于检测限。
7、如图4中G所示检测线T2不显色，检测线T1、T3和质控线C都显红色，检测结果为呕吐毒素和赭曲霉毒素A阴性，玉米赤霉烯酮阳性，表明被检测样品中呕吐毒素和赭曲霉毒素A含量低于检测限，玉米赤霉烯酮含量高于检测限。
8、如图4中H所示检测线T1、T3不显色，检测线T2和质控线C都显红色，检测结果为玉米赤霉烯酮阴性，呕吐毒素和赭曲霉毒素A阳性，表明被检测样品中玉米赤霉烯酮含量低于检测限，呕吐毒素和赭曲霉毒素A含量高于检测限。
9、如图5所示检测线T1、T2、T3和质控线C都不显色，或者质控线C不显红色，检测结果无效。
灵敏度试验：
用PBS配制标准品梯度：0、10、20、50、100ng/ml。用生产的试纸5三批来检测，每批每个浓度重复试验5次。得到的试验结果是以生物毒素试纸5检测玉米赤霉烯酮、呕吐毒素和赭曲霉毒素A的检测限为20ng/ml，具体结果见表1-4、表2-4、表3-4。
表1-4 呕吐毒素试纸5灵敏度试验结果
Figure A20081006159800261
  试纸5批2   -   -   -   +   +   +
  试纸5批3   -   -   -   +   +   +
表2-4 玉米赤霉烯酮试纸5灵敏度试验结果
Figure A20081006159800271
表3-4 赭曲霉毒素A试纸5灵敏度试验结果
Figure A20081006159800272
注：“-”表示检测结果阴性，“+”表示检测结果阳性。
试纸的准确度试验
在牛奶、尿杆、饲料、玉米、大麦、小麦等经确证为阴性样品中添加生物毒素使样品中的生物毒素浓度为10ng/g、20ng/g、50ng/g、100ng/g。经过前处理后检测，每个样品重复5次，检测结果与标准品溶液检测结果的检测限符合率100％。具体结果见表4-4、表5-4、表6-4。
表4-4 呕吐毒素试纸5准确度试验结果
Figure A20081006159800273
  大麦   -   -   +   +   +
  小麦   -   -   +   +   +
表5-4 玉米赤霉烯酮试纸5准确度试验结果
Figure A20081006159800281
表6-4 赭曲霉毒素A试纸5准确度试验结果
Figure A20081006159800282
注：“-”表示检测结果阴性，“+”表示检测结果阳性。
实施例6 赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮二联检测试纸：
试纸检测线包被有浓度为0.5-2.0mg/mL的生物毒素检测用抗原，如图6所示，T2距离检测区底部6-8mm；质控线包被有浓度为0.5-1.5mg/mL的羊抗鼠IgG，距离检测区顶部6-8mm；C线与T1，T1与T2两条线之间间隔2-4mm。
检测结果判定：
1、如图6中A所示检测线T1、T2和质控线C都显红色，表示检测结果为阴性，表明被检测样品中赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮含量低于检测限。
2、如图6中B所示检测线T1和质控线C显红色，检测线T2不显色，检测结果为赭曲霉毒素A阴性，玉米赤霉烯酮阳性，表明被检测样品中赭曲霉毒素A含量低于检测限，玉米赤霉烯酮含量高于检测限。
3、如图6中C所示检测线T1、T2不显色，质控线C显红色，检测结果为赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮阳性，表明被检测样品中赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮含量高于检测限。
4、如图6中D所示检测线T1不显色，检测线T2和质控线C都显红色，检测结果为赭曲霉毒素A阳性，玉米赤霉烯酮阴性，表明被检测样品赭曲霉毒素A含量高于检测限，玉米赤霉烯酮含量低于检测限。
5、如图7所示检测线T1、T2和质控线C都不显色，或者质控线C不显红色，检测结果无效。
灵敏度试验：
用PBS配制标准品梯度：0、10、20、50、100ng/ml。用生产的试纸6三批来检测，每批每个浓度重复试验5次。得到的试验结果是以生物毒素试纸6检测玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A的检测限为20ng/ml，具体结果见表7-1、表8-1。
表7-1 赭曲霉毒素A试纸6灵敏度试验结果
Figure A20081006159800291
表8-1 玉米赤霉烯酮试纸6灵敏度试验结果
Figure A20081006159800292
注：“-”表示检测结果阴性，“+”表示检测结果阳性。
试纸的准确度试验
在牛奶、尿样、饲料、玉米、大麦、小麦等经确证为阴性样品中添加生物毒素使样品中的生物毒素浓度为10ng/g、20ng/g、50ng/g、100ng/g。经过前处理后检测，每个样品重复5次，选用生产的试纸6中的其中一批用于检测，检测结果与标准品溶液检测结果的检测限符合率100％。具体结果见表9-1、表10-1。
表9-1 赭曲霉毒素A试纸2准确度试验结果
Figure A20081006159800301
表10-1 玉米赤霉烯酮试纸6准确度试验结果
Figure A20081006159800302
注：“-”表示检测结果阴性，“+”表示检测结果阳性。
实施例7 赭曲霉毒素A和伏马菌素B1二联检测试纸：
试纸检测线包被有浓度为0.5-2.0mg/mL的生物毒素检测用抗原，如图6所示，T2距离检测区底部6-8mm；质控线包被有浓度为0.5-1.5mg/mL的羊抗鼠IgG，距离检测区顶部6-8mm；C线与T1，T1与T2两条线之间间隔2-4mm。
检测结果判定：
1、如图6中A所示检测线T1、T2和质控线C都显红色，表示检测结果为阴性，表明被检测样品中赭曲霉毒素A和伏马菌素B1含量低于检测限。
2、如图6中B所示检测线T1和质控线C显红色，检测线T2不显色，检测结果为赭曲霉毒素A阴性，伏马菌素B1阳性，表明被检测样品中赭曲霉毒素A含量低于检测限，伏马菌素B1含量高于检测限。
3、如图6中C所示检测线T1、T2不显色，质控线C显红色，检测结果为赭曲霉毒素A、伏马菌素B1阳性，表明被检测样品中赭曲霉毒素A、伏马菌素B1含量高于检测限。
4、如图6中D所示检测线T1不显色，检测线T2和质控线C都显红色，检测结果为赭曲霉毒素A阳性，伏马菌素B1阴性，表明被检测样品赭曲霉毒素A含量高于检测限，伏马菌素B1含量低于检测限。
5、如图7所示检测线T1、T2和质控线C都不显色，或者质控线C不显红色，检测结果无效。
灵敏度试验：
用PBS配制标准品梯度：0、10、20、50、100ng/ml。用生产的试纸7三批来检测，每批每个浓度重复试验5次。得到的试验结果是以生物毒素试纸7检测赭曲霉毒素A和伏马菌素B1的检测限为20ng/ml，具体结果见表7-2、表8-2。
表7-2 赭曲霉毒素A试纸7灵敏度试验结果
Figure A20081006159800311
表8-2 伏马菌素B1试纸7灵敏度试验结果
注：“-”表示检测结果阴性，“+”表示检测结果阳性。
试纸的准确度试验
在牛奶、尿样、饲料、玉米、大麦、小麦等经确证为阴性样品中添加生物毒素使样品中的生物毒素浓度为10ng/g、20ng/g、50ng/g、100ng/g。经过前处理后检测，每个样品重复5次，选用生产的试纸7中的其中一批用于检测，检测结果与标准品溶液检测结果的检测限符合率100％。具体结果见表9-2、表10-2。
表9-2 赭曲霉毒素A试纸7准确度试验结果
Figure A20081006159800321
表10-2 伏马菌素B1试纸7准确度试验结果
Figure A20081006159800322
注：“-”表示检测结果阴性，“+”表示检测结果阳性。
实施例8 伏马菌素B1和玉米赤霉烯酮二联检测试纸：
试纸检测线包被有浓度为0.5-2.0mg/mL的生物毒素检测用抗原，如图6所示，T2距离检测区底部6-8mm；质控线包被有浓度为0.5-1.5mg/mL的羊抗鼠IgG，距离检测区顶部6-8mm；C线与T1，T1与T2两条线之间间隔2-4mm。
检测结果判定：
1、如图6中A所示检测线T1、T2和质控线C都显红色，表示检测结果为阴性，表明被检测样品中伏马菌素B1和玉米赤霉烯酮含量低于检测限。
2、如图6中B所示检测线T1和质控线C显红色，检测线T2不显色，检测结果为伏马菌素B1阴性，玉米赤霉烯酮阳性，表明被检测样品中伏马菌素B1含量低于检测限，玉米赤霉烯酮含量高于检测限。
3、如图6中C所示检测线T1、T2不显色，质控线C显红色，检测结果为伏马菌素B1、玉米赤霉烯酮阳性，表明被检测样品中伏马菌素B1、玉米赤霉烯酮含量高于检测限。
4、如图6中D所示检测线T1不显色，检测线T2和质控线C都显红色，检测结果为伏马菌素B1阳性，玉米赤霉烯酮阴性，表明被检测样品伏马菌素B1含量高于检测限，玉米赤霉烯酮含量低于检测限。
5、如图7所示检测线T1、T2和质控线C都不显色，或者质控线C不显红色，检测结果无效。
灵敏度试验：
用PBS配制标准品梯度：0、10、20、50、100ng/ml。用生产的试纸8三批来检测，每批每个浓度重复试验5次。得到的试验结果是以生物毒素试纸8检测玉米赤霉烯酮、伏马菌素B1的检测限为20ng/ml，具体结果见表7-3、表8-3。
表7-3 伏马菌素B1试纸8灵敏度试验结果
Figure A20081006159800331
表8-3 玉米赤霉烯酮试纸8灵敏度试验结果
Figure A20081006159800332
注：“-”表示检测结果阴性，“+”表示检测结果阳性。
试纸的准确度试验
在牛奶、尿样、饲料、玉米、大麦、小麦等经确证为阴性样品中添加生物毒素使样品中的生物毒素浓度为10ng/g、20ng/g、50ng/g、100ng/g。经过前处理后检测，每个样品重复5次，选用生产的试纸8中的其中一批用于检测，检测结果与标准品溶液检测结果的检测限符合率100％。具体结果见表9-3、表10-3。
表9-3 赭曲霉毒素A试纸8准确度试验结果
Figure A20081006159800341
表10-3 玉米赤霉烯酮试纸8准确度试验结果
Figure A20081006159800342
注：“-”表示检测结果阴性，“+”表示检测结果阳性。
实施例9 呕吐毒素和伏马菌素B1二联检测试纸：
试纸检测线包被有浓度为0.5-2.0mg/mL的生物毒素检测用抗原，如图6所示，T2距离检测区底部6-8mm；质控线包被有浓度为0.5-1.5mg/mL的羊抗鼠IgG，距离检测区顶部6-8mm；C线与T1，T1与T2两条线之间间隔2-4mm。
检测结果判定：
1、如图6中A所示检测线T1、T2和质控线C都显红色，表示检测结果为阴性，表明被检测样品中呕吐毒素和伏马菌素B1含量低于检测限。
2、如图6中B所示检测线T1和质控线C显红色，检测线T2不显色，检测结果为呕吐毒素阴性，伏马菌素B1阳性，表明被检测样品中呕吐毒素含量低于检测限，伏马菌素B1含量高于检测限。
3、如图6中C所示检测线T1、T2不显色，质控线C显红色，检测结果为呕吐毒素、伏马菌素B1阳性，表明被检测样品中呕吐毒素、伏马菌素B1含量高于检测限。
4、如图6中D所示检测线T1不显色，检测线T2和质控线C都显红色，检测结果为呕吐毒素阳性，伏马菌素B1阴性，表明被检测样品呕吐毒素含量高于检测限，伏马菌素B1含量低于检测限。
5、如图7所示检测线T1、T2和质控线C都不显色，或者质控线C不显红色，检测结果无效。
灵敏度试验：
用PBS配制标准品梯度：0、10、20、50、100ng/ml。用生产的试纸9三批来检测，每批每个浓度重复试验5次。得到的试验结果是以生物毒素试纸9检测呕吐毒素和伏马菌素B1的检测限为20ng/ml，具体结果见表7-4、表8-4。
表7-4 呕吐毒素试纸9灵敏度试验结果
Figure A20081006159800351
表8-4 伏马菌素B1试纸9灵敏度试验结果
Figure A20081006159800352
  试纸9批3   -   -   -   +   +   +
注：“-”表示检测结果阴性，“+”表示检测结果阳性。
试纸的准确度试验
在牛奶、尿样、饲料、玉米、大麦、小麦等经确证为阴性样品中添加生物毒素使样品中的生物毒素浓度为10ng/g、20ng/g、50ng/g、100ng/g。经过前处理后检测，每个样品重复5次，选用生产的试纸9中的其中一批用于检测，检测结果与标准品溶液检测结果的检测限符合率100％。具体结果见表9-4、表10-4。
表9-4 呕吐毒素试纸9准确度试验结果
Figure A20081006159800361
表10-4 伏马菌素B1试纸9准确度试验结果
Figure A20081006159800362
注：“-”表示检测结果阴性，“+”表示检测结果阳性。
实施例10 呕吐毒素和玉米赤霉烯酮二联检测试纸：
试纸检测线包被有浓度为0.5-2.0mg/mL的生物毒素检测用抗原，如图6所示，T2距离检测区底部6-8mm；质控线包被有浓度为0.5-1.5mg/mL的羊抗鼠IgG，距离检测区顶部6-8mm；C线与T1，T1与T2两条线之间间隔2-4mm。
检测结果判定：
1、如图6中A所示检测线T1、T2和质控线C都显红色，表示检测结果为阴性，表明被检测样品中呕吐毒素和玉米赤霉烯酮含量低于检测限。
2、如图6中B所示检测线T1和质控线C显红色，检测线T2不显色，检测结果为呕吐毒素阴性，玉米赤霉烯酮阳性，表明被检测样品中呕吐毒素含量低于检测限，玉米赤霉烯酮含量高于检测限。
3、如图6中C所示检测线T1、T2不显色，质控线C显红色，检测结果为呕吐毒素、玉米赤霉烯酮阳性，表明被检测样品中呕吐毒素、玉米赤霉烯酮含量高于检测限。
4、如图6中D所示检测线T1不显色，检测线T2和质控线C都显红色，检测结果为呕吐毒素阳性，玉米赤霉烯酮阴性，表明被检测样品呕吐毒素含量高于检测限，玉米赤霉烯酮含量低于检测限。
5、如图7所示检测线T1、T2和质控线C都不显色，或者质控线C不显红色，检测结果无效。
灵敏度试验：
用PBS配制标准品梯度：0、10、20、50、100ng/ml。用生产的试纸10三批来检测，每批每个浓度重复试验5次。得到的试验结果是以生物毒素试纸10检测玉米赤霉烯酮、呕吐毒素的检测限为20ng/ml，具体结果见表7-5、表8-5。
表7-5 呕吐毒素试纸10灵敏度试验结果
Figure A20081006159800371
表8-5 玉米赤霉烯酮试纸10灵敏度试验结果
  试纸10批1   -   -   -   +   +   +
  试纸10批2   -   -   -   +   +   +
  试纸10批3   -   -   -   +   +   +
注：“-”表示检测结果阴性，“+”表示检测结果阳性。
试纸的准确度试验
在牛奶、尿样、饲料、玉米、大麦、小麦等经确证为阴性样品中添加生物毒素使样品中的生物毒素浓度为10ng/g、20ng/g、50ng/g、100ng/g。经过前处理后检测，每个样品重复5次，选用生产的试纸10中的其中一批用于检测，检测结果与标准品溶液检测结果的检测限符合率100％。具体结果见表9-5、表10-5。
表9-5 呕吐毒素试纸10准确度试验结果
Figure A20081006159800381
表10-5 玉米赤霉烯酮试纸10准确度试验结果
Figure A20081006159800382
注：“-”表示检测结果阴性，“+”表示检测结果阳性。
实施例11 呕吐毒素和赭曲霉毒素A二联检测试纸：
试纸检测线包被有浓度为0.5-2.0mg/mL的生物毒素检测用抗原，如图6所示，T2距离检测区底部6-8mm；质控线包被有浓度为0.5-1.5mg/mL的羊抗鼠IgG，距离检测区顶部6-8mm；C线与T1，T1与T2两条线之间间隔2-4mm。
检测结果判定：
1、如图6中A所示检测线T1、T2和质控线C都显红色，表示检测结果为阴性，表明被检测样品中呕吐毒素和赭曲霉毒素A含量低于检测限。
2、如图6中B所示检测线T1和质控线C显红色，检测线T2不显色，检测结果为呕吐毒素阴性，赭曲霉毒素A阳性，表明被检测样品中呕吐毒素含量低于检测限，赭曲霉毒素A含量高于检测限。
3、如图6中C所示检测线T1、T2不显色，质控线C显红色，检测结果为呕吐毒素、赭曲霉毒素A阳性，表明被检测样品中呕吐毒素、赭曲霉毒素A含量高于检测限。
4、如图6中D所示检测线T1不显色，检测线T2和质控线C都显红色，检测结果为呕吐毒素阳性，赭曲霉毒素A阴性，表明被检测样品呕吐毒素含量高于检测限，赭曲霉毒素A含量低于检测限。
5、如图7所示检测线T1、T2和质控线C都不显色，或者质控线C不显红色，检测结果无效。
灵敏度试验：
用PBS配制标准品梯度：0、10、20、50、100ng/ml。用生产的试纸11三批来检测，每批每个浓度重复试验5次。得到的试验结果是以生物毒素试纸11检测赭曲霉毒素A、呕吐毒素的检测限为20ng/ml，具体结果见表7-6、表8-6。
表7-6 呕吐毒素试纸11灵敏度试验结果
Figure A20081006159800391
表8-6 赭曲霉毒素A试纸11灵敏度试验结果
Figure A20081006159800401
注：“-”表示检测结果阴性，“+”表示检测结果阳性。
试纸的准确度试验
在牛奶、尿样、饲料、玉米、大麦、小麦等经确证为阴性样品中添加生物毒素使样品中的生物毒素浓度为10ng/g、20ng/g、50ng/g、100ng/g。经过前处理后检测，每个样品重复5次，选用生产的试纸11中的其中一批用于检测，检测结果与标准品溶液检测结果的检测限符合率100％。具体结果见表9-6、表10-6。
表9-6 呕吐毒素试纸11准确度试验结果
Figure A20081006159800402
表10-6 赭曲霉毒素A试纸11准确度试验结果
Figure A20081006159800403
  大麦   -   -   +   +   +
  小麦   -   -   +   +   +
注：“-”表示检测结果阴性，“+”表示检测结果阳性。
实施例12 赭曲霉毒素A检测试纸：
试纸检测线包被有浓度为0.5-2.0mg/mL的生物毒素检测用抗原，如图8所示，检测线(T线)距离检测区底部8-10mm；质控线包被有浓度0.5-1.5mg/mL的羊抗鼠IgG，距离检测区顶部8-10mm；两条线之间间隔4-6mm。
检测结果判定：
1、如图8中A所示检测线T和质控线C都显红色，表示检测结果为阴性，表明被检测样品中赭曲霉毒素A含量低于检测限。
2、如图8中B所示质控线C显红色，检测线T不显色，检测结果为阳性，表明被检测样品中赭曲霉毒素A含量高于检测限。
3、如图8中C、D所示检测线T和质控线C都不显色，或者质控线C不显红色，检测结果无效。
灵敏度试验：
用PBS配制标准品梯度：0、10、20、50、100ng/ml。用生产的试纸12三批来检测，每批每个浓度重复试验5次。得到的试验结果是以生物毒素试纸12检测赭曲霉毒素A的检测限为20ng/ml，具体结果见表11。
表11 赭曲霉毒素A试纸12灵敏度试验结果
Figure A20081006159800411
注：“-”表示检测结果阴性，“+”表示检测结果阳性。
试纸的准确度试验
在牛奶、尿样、饲料、玉米、大麦、小麦等经确证为阴性样品中添加生物毒素使样品中的生物毒素浓度为10ng/g、20ng/g、50ng/g、100ng/g。经过前处理后检测，每个样品重复5次，选用生产的试纸5中的其中一批用于检测，检测结果与标准品溶液检测结果的检测限符合率100％。具体结果见表12。
表12 赭曲霉毒素A试纸5准确度试验结果
注：“-”表示检测结果阴性，“+”表示检测结果阳性。
实施例13 玉米赤霉烯酮检测试纸：
试纸检测线包被有浓度为0.5-2.0mg/mL的生物毒素检测用抗原，如图8所示，检测线(T线)距离检测区底部8-10mm；质控线包被有浓度0.5-1.5mg/mL的羊抗鼠IgG，距离检测区顶部8-10mm；两条线之间间隔4-6mm。
检测结果判定：
1、如图8中A所示检测线T和质控线C都显红色，表示检测结果为阴性，表明被检测样品中玉米赤霉烯酮含量低于检测限。
2、如图8中B所示质控线C显红色，检测线T不显色，检测结果为阳性，表明被检测样品中玉米赤霉烯酮含量高于检测限。
3、如图8中C、D所示检测线T和质控线C都不显色，或者质控线C不显红色，检测结果无效。
灵敏度试验：
用PBS配制标准品梯度：0、10、20、50、100ng/ml。用生产的试纸13三批来检测，每批每个浓度重复试验5次。得到的试验结果是以生物毒素试纸13检测玉米赤霉烯酮的检测限为20ng/ml，具体结果见表13。
表13 玉米赤霉烯酮试纸13灵敏度试验结果
Figure A20081006159800422
  试纸13批1   -   -   -   +   +   +
  试纸13批2   -   -   -   +   +   +
  试纸13批3   -   -   -   +   +   +
注：“-”表示检测结果阴性，“+”表示检测结果阳性。
试纸的准确度试验
在牛奶、尿样、饲料、玉米、大麦、小麦等经确证为阴性样品中添加生物毒素使样品中的生物毒素浓度为10ng/g、20ng/g、50ng/g、100ng/g。经过前处理后检测，每个样品重复5次，选用生产的试纸13中的其中一批用于检测，检测结果与标准品溶液检测结果的检测限符合率100％。具体结果见表14。
表14 玉米赤霉烯酮试纸13准确度试验结果
Figure A20081006159800431
注：“-”表示检测结果阴性，“+”表示检测结果阳性。
实施例14 伏马菌素B1检测试纸：
试纸检测线包被有浓度为0.5-2.0mg/mL的生物毒素检测用抗原，如图8所示，检测线(T线)距离检测区底部8-10mm；质控线包被有浓度0.5-1.5mg/mL的羊抗鼠IgG，距离检测区顶部8-10mm；两条线之间间隔4-6mm。
检测结果判定：
1、如图8中A所示检测线T和质控线C都显红色，表示检测结果为阴性，表明被检测样品中伏马菌素B1含量低于检测限。
2、如图8中B所示质控线C显红色，检测线T不显色，检测结果为阳性，表明被检测样品中伏马菌素B1含量高于检测限。
3、如图8中C、D所示检测线T和质控线C都不显色，或者质控线C不显红色，检测结果无效。
灵敏度试验：
用PBS配制标准品梯度：0、10、20、50、100ng/ml。用生产的试纸14三批来检测，每批每个浓度重复试验5次。得到的试验结果是以生物毒素试纸14检测伏马菌素B1的检测限为20ng/ml，具体结果见表15。
表15 伏马菌素B1试纸14灵敏度试验结果
Figure A20081006159800441
注：“-”表示检测结果阴性，“+”表示检测结果阳性。
试纸的准确度试验
在牛奶、尿样、饲料、玉米、大麦、小麦等经确证为阴性样品中添加生物毒素使样品中的生物毒素浓度为10ng/g、20ng/g、50ng/g、100ng/g。经过前处理后检测，每个样品重复5次，选用生产的试纸14中的其中一批用于检测，检测结果与标准品溶液检测结果的检测限符合率100％。具体结果见表16。
表16 伏马菌素B1试纸14准确度试验结果
Figure A20081006159800442
注：“-”表示检测结果阴性，“+”表示检测结果阳性。

Claims (10)

1.检测生物毒素的胶体金免疫层析试纸，其包括在底板上依次粘贴的样品吸收垫、胶体金标记垫、检测反应区及吸收垫，检测反应区上设有包被有检测用抗原的检测线和包被有二抗的质控线，其特征在于：胶体金标记垫所包被的物质为一种生物毒素抗体或多种生物毒素抗体的胶体金标记物的混合物，所述的检测线的条数与胶体金标记垫包被生物毒素抗体的数目相应，每条检测线上分别包被有与胶体金标记抗体相应的单一的生物毒素检测用抗原。
2.根据权利要求1所述的检测生物毒素的胶体金免疫层析试纸，其特征在于：生物毒素抗体分别为玉米赤霉烯酮、伏马菌素B1、赭曲霉毒素A或呕吐毒素的多克隆抗体或单克隆抗体中的一种或多种，检测用抗原相应的分别为玉米赤霉烯酮、伏马菌素B1、赭曲霉毒素A或呕吐毒素的检测用抗原中的一种或多种。
3.根据权利要求2所述的检测生物毒素的胶体金免疫层析试纸，其特征在于：所述试纸为呕吐毒素、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A和伏马菌素B1四联检测试纸；呕吐毒素、玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A三联检测试纸；呕吐毒素、赭曲霉毒素A和伏马菌素B1三联检测试纸；赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮和伏马菌素B1三联检测试纸；呕吐毒素、玉米赤霉烯酮和伏马菌素B1三联检测试纸；赭曲霉毒素A和伏马菌素B1三联检测试纸；呕吐毒素和赭曲霉毒素A二联检测试纸；玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A二联检测试纸；呕吐毒素和玉米赤霉烯酮二联检测试纸；呕吐毒素和伏马菌素B1二联检测试纸；伏马菌素B1和玉米赤霉烯酮二联检测试纸；赭曲霉毒素A检测试纸；玉米赤霉烯酮检测试纸；伏马菌素B1检测试纸中的一种。
4.根据权利要求1所述的检测生物毒素的胶体金免疫层析试纸，其特征在于：生物毒素抗体为生物毒素单克隆抗体。
5.根据权利要求4所述的检测生物毒素的胶体金免疫层析试纸，其特征在于：所述的生物毒素单克隆抗体制备的方法如下：
a、免疫动物培养；
取健康6-10周龄小鼠进行免疫；第一次基础免疫将0.5-1.0mg/mL生物毒素免疫用抗原与等量完全弗氏佐剂用搅拌器充分混匀乳化，进行皮下多点注射；三周后开始进行加强免疫，剂量同上，佐剂换为不完全弗氏佐剂，二免后，定期测定抗体效价，每隔三周加强免疫一次；
b、脾细胞悬液的制备：
取效价高的小鼠，处死，酒精浸泡消毒10min，在无菌条件下取出脾脏，用不完全的培养液洗一次，置平皿中不锈钢筛网上，用注射器针芯研磨成细胞悬液后计数；
c、细胞融合和克隆化：
取对数生长的骨髓瘤细胞，1000rpm离心3～7分钟，离心，弃上清，用不完全培养液混悬细胞后计数，取所需的细胞数，用不完全培养液洗涤；同时制备免疫脾细胞悬液，用不完全培养液洗涤；将骨髓瘤细胞与脾细胞按比例混合在一起，在塑料离心管内用不完全培养液洗，1200rpm，5～10分钟离心；弃上清，并使细胞沉淀略加松动；
在室温下融合：加入预热的PEG，边加边搅拌；加预热的不完全培养液，终止PEG作用；离心，弃上清，先用小牛血清轻轻混悬；将融合后细胞悬液加入含有饲养细胞的微孔板中培养；融合一天后，加HAT选择培养液；融合后6～8天，用HT培养液换液1～2次，在11～14天后根据增殖情况改用NBS的完全培养液；待集落长至孔底1/4～1/2时，可取上清检测相应的特异性抗体；细胞完全克隆化后，将细胞注入小鼠腹腔，将腹水用蛋白A免疫亲和层析纯化后，即得到生物毒素单克隆抗体。
6.根据权利要求1所述的检测生物毒素的胶体金免疫层析试纸，其特征在于：检测用抗原为生物毒素与载体物质偶联形成的偶合物，其中，所述的载体物质选自蛋白质或蛋白质片段中的一种。
7.根据权利要求6所述的检测生物毒素的胶体金免疫层析试纸，其特征在于：载体物质选自牛血清白蛋白、卵清白蛋白、血蓝蛋白与甲状腺球蛋白中的一种。
8.根据权利要求6所述的检测生物毒素的胶体金免疫层析试纸，其特征在于：检测用抗原分别为玉米赤霉烯酮、伏马菌素B1、赭曲霉毒素A或呕吐毒素的检测用抗原中的一种或多种，其中：
a、玉米赤霉烯酮偶合抗原的合成方法如下：取10-20mg载体蛋白溶于1mL的水中，取玉米赤霉烯半抗原0.01-0.04mmol溶于二氧六环中，将上述两种溶液缓慢混合；取碳化二亚胺0.02-0.04mmol，溶于1mL水中，逐滴加到混合液中，在20-25℃下，搅拌反应过夜，用盐酸调PH＝6.0，再次加入0.01-0.02mmol碳化二亚胺，后放于4℃冰箱内24～28h，反应完成后将反应液装入透析袋，4℃下，pH＝7.4的PBS中透析，分装，冷冻保存备用；
b、呕吐毒素抗原的合成方法如下：将10-40mg呕吐毒素溶解在0.1-0.8ml吡啶中，加入到10ml的反应瓶中，在反应瓶中加入30-120mg的硼酸，混合物在室温下搅拌过夜，再加入30-120mg琥珀酸酐，并通入氮气，密封反应瓶，混合物在沸水浴中搅拌2-3h，将吡啶在室温吹干后，加入5mL乙酸乙酯溶解残余物，离心，取上清液，室温吹干后，加入NHS、DCC溶于DMF中，室温振荡30-60min，离心，取上清液，将上清液缓慢滴加到载体蛋白液中，在4℃振荡反应4h，然后，在0.01M PBS PH7.4中透析，分装，冷冻保存备用；
c、伏马菌素B1抗原的合成方法如下：取10-40mg载体蛋白，伏马菌素B10.01-0.04mmol溶于0.02M PBS PH＝7.4中，室温下搅拌混匀；再缓慢加入0.02-0.06mmol的戊二醛，混合物在室温下搅拌过夜，反应完成后将反应液装入透析袋，4℃下，pH＝7.4的PBS中透析，加入0.01-0.04mmol的伏马菌素B1，后放于4℃冰箱内24h，再加入0.01M Tris继续搅拌4h，反应完成后将反应液装入透析袋，在4℃下透析，分装，冷冻保存备用。
d、赭曲霉毒素A抗原的合成方法如下：取20-40mg载体蛋白，赭曲霉毒素A0.02-0.04mmol溶于0.02M PBS PH＝7.4中，室温下搅拌混匀；再缓慢加入0.03-0.06mmol的戊二醛，混合物在室温下搅拌过夜，反应完成后将反应液装入透析袋，4℃下，pH＝7.4的PBS中透析，透析完成后，分装，-20℃冷冻保存备用。
9.检测生物毒素的检测方法，其特征在于：被检样品为牛奶或尿样，采用如权利要求1～8任意一项权利要求所述的胶体金免疫层析试纸，直接滴牛奶或尿于样品垫上，3～5min后，观察颜色。
10.检测生物毒素的检测方法，其特征在于：被检样品为小麦、玉米、大麦或饲料，称取充分研磨的样品，加入PBS中，充分混匀，离心，取上清液，采用如权利要求1～8任意一项权利要求所述的胶体金免疫层析试纸，直接滴于样品垫上，3～5min后，观察颜色。
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