CN105137080A - 多种真菌毒素快速联合检测试剂盒及其制备和使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种简便、灵敏、价格低廉的呕吐毒素、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A三种真菌毒素快速联合检测试剂盒、上述试剂盒的制备方法、使用上述的试剂盒进行呕吐毒素-BSA、玉米赤霉烯酮-BSA、赭曲霉毒素A毒素检测的使用方法。

Description

多种真菌毒素快速联合检测试剂盒及其制备和使用方法

技术领域：

本发明涉及多种真菌毒素快速联合检测试剂盒及其制备和使用方法，属于食品安全检测领域。

背景技术：

真菌毒素是由产毒真菌在适宜的环境条件下产生的有毒代谢产物，具有强毒性和致癌性，能够污染几乎所有种类的食用和饲用农产品。联合国粮农组织的数据显示，世界上约有25%的谷物不同程度地受到真菌毒素的污染而不能食用，不仅在经济上造成了巨大的损失，而且由真菌产生的真菌毒素还能引起人畜中毒，严重时甚至可以致癌。

一种真菌可以产生多种不同的真菌毒素，不同的真菌可以产生相同的真菌毒素。目前已知能产生真菌毒素的真菌有150余种，产生的真菌毒素约有300种。真菌的生长和繁殖都需要一定的温湿度条件，最适宜生长温度一般为20～30℃，霉菌繁殖产毒的最适温度为25～30℃。其中曲霉菌属最适宜生长温度为30℃左右，青霉菌属为25℃左右，镰刀菌属一般为25℃左右。当真菌处于干燥低温或处于与其他真菌竞争的应激情况时，就会产生霉菌毒素，由于真菌生长有一定的地域性，因此，不同区域占优势的真菌毒素种类也不同。由于受气候、种植方式、贮藏条件和消费习惯等影响，我国农产品受真菌毒素污染危害更为严重。真菌毒素防控已成为保障我国乃至世界粮食安全、食品安全和环境安全的迫切需求。

呕吐毒素（简称DON即脱氧雪腐镰刀菌烯醇），人畜长期食用低剂量的霉变玉米，毒素会在体内沉积，构成健康危害。特别是对动物而言，毒素会在动物肌肉组织中有很高含量残留，而正常烹饪过程不会对毒素有破坏，因此可以通过动物组织对人类健康构成危害。现在，社会已经注意到药物残留带给人们的危害，而毒素残留的危害远比药物残留危害严重得多，却还没引起人们足够的重视。

赭曲霉毒素A是一种肾脏毒素，并具有致畸、致癌及免疫毒性的真菌毒素。理化性质稳定，人体摄入后主要导致肾脏病变，是一种慢性进行性疾病，往往造成死亡。尸检症状肾脏明显缩小、肾间质纤维化及肾小管变性等，肾盂癌、输尿管癌于此毒素有关。

玉米赤霉烯酮理化性质稳定，玉米中污染最普遍。它是非固醇类、具有雌性激素性质的真菌毒素，主要作用于生殖系统，母猪最敏感，可引起不育症、流产等。未见引起人类中毒的报道，但与雌性激素相关的人类疾病可能与该毒素有关。

为应对真菌毒素的严重危害，100多个国家或地区制定了相应的限量标准和法规，加强残留的检测及监控，建立有效的残留检测方法势在必行。针对这种情况，急需建立一种快速、简便的真菌毒素类残留快速检测方法。目前真菌毒素的检测技术主要有色谱技术和免疫分析技术等。色谱技术为经典技术，主要有高压液相色谱（HPLC），液相色谱质谱连用(LC-MS)，气相色谱-质谱连用(GC-MS)等，这些方法灵敏准确，但样品处理烦琐费时，成本高，而且需要有经过专业培训的专业人员来操作复杂的仪器设备。而免疫分析技术具有敏感、特异、快速的特点，胶体金免疫层析技术是目前最主要的快速分析方法之一，研制成可以商品化的快速检测产品，可以准确检测出样品中的真菌毒素，对于食品安全现场检测、监控具有重要的意义。胶体金技术自上世纪八十年代应用到医学领域作为POCT的检测手段，本世纪初又引入食品安全检测领域，传统的胶体金检测法将胶体金颗粒标记到多孔滤膜上制成胶体金垫，再固定在检测板上制成检测试纸。但胶体金垫在实际使用中存在一定弊端，如胶体金垫释放的速度太慢、硝酸纤维素膜的疏水性会阻碍金标液顺畅的流动等。此外，粮食、饲料等固体样品使用前要进行样品前处理，前处理手段的复杂会影响整体检测的效率。

发明内容：

为解决上述技术问题，本发明的目的一是在于提供一种简便、灵敏、价格低廉的呕吐毒素、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A三种真菌毒素快速联合检测试剂盒，本发明目的二是提供使用上述试剂盒的制备方法，本发明目的三是提供使用上述的试剂盒进行呕吐毒素-BSA、玉米赤霉烯酮-BSA、赭曲霉毒素A毒素检测的使用方法。

为了实现本发明的第一个目的，本发明采用了以下技术方案：

本发明提供的呕吐毒素、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A三种真菌毒素快速联合检测试剂盒包括检测试纸和金标微孔，所述检测试纸包括背板上依次粘贴吸液垫、反应垫和样品吸收垫，吸液垫与反应垫交叠1~2mm，样品吸收垫与反应垫交叠1~2mm，所述反应垫为硝酸纤维素膜上包被有1条质控线和1~3条检测线，质控线和各条检测线相互平行，所述质控线包被有羊抗鼠多克隆抗体，检测线包被有呕吐毒素-BSA、玉米赤霉烯酮-BSA、赭曲霉毒素A-BSA中的一种至三种；所述金标微孔为0.5~4mg/ml呕吐毒素单克隆抗体、0.5~4mg/ml玉米赤霉烯酮单克隆抗体、0.5~4mg/ml赭曲霉毒素A单克隆抗体混合胶体金液，包被于微孔板中。吸液垫采用吸水纸制成，所述样品吸收垫为吸水玻璃纤维素膜与高分子吸水纤维素膜叠加压制而成。检测试纸宽度为4~6mm，吸液垫长16~18mm，反应垫长15~18mm，样品吸收垫长18~20mm。质控线、1~3条检测线之间互相间距均为5~6mm。质控线由PH6~8、0.01~0.05M磷酸缓冲液稀释至0.1~1mg/ml羊抗鼠多克隆抗体包被。检测线由PH5~8、0.01~0.05M磷酸盐缓冲液稀释至0.1~3mg/ml的呕吐毒素-BSA、玉米赤霉烯酮-BSA、赭曲霉毒素A-BSA偶联物包被。

为了实现本发明的第二个目的，本发明采用了以下技术方案：

呕吐毒素-BSA制备：呕吐毒素标品1~4mg加50~200μl二甲基亚砜，加N,N'-羰基二咪唑10~50mg，25~45℃水浴搅拌；牛血清白蛋白1~25mg加100~500μl0.01MpH4~7PBS溶解；搅拌反应1~4h。

玉米赤霉烯酮-BSA制备：称玉米赤霉烯酮标品10~30mg，溶于20~30ml吡啶溶液，室温搅拌反应；浓缩至干，加5~10ml超纯水，用NaOH调pH6~8，用乙酸乙酯萃取三次，弃去有机层；加HCl使水层pH3-4；过滤，加入12~15mg/ml的二环己基碳二亚胺的无水DMF溶液0.1~0.5ml，室温振荡3-5h；加入牛血清白蛋白100mg加10ml0.05MpH8~10碳酸缓冲液。

赭曲霉毒素-BSA制备：50~100mg赭曲霉毒素A溶于15~25mLN,N-二甲基甲酰胺溶液中后，加到20mL溶有400mgBSA的PBS溶液中，合成赭曲霉毒素A-戊二醛-BSA复合物；在上述混合溶液中逐滴加入150μL25%的戊二醛；将此混合物在室温下用磁力搅拌机轻柔搅拌3h；用0.01MpH7.3PBS透析3天，每天换液2次。

免疫动物：选择6周龄雌性BALB/C小鼠，将抗原与福氏完全佐剂等量混合、乳化，经腹部皮下多点注射进行基础免疫。分别隔4周，进行第二、三次免疫。第三次免疫后第7～10天，断尾取血，分离血清，用ELISA方法检测血清效价。用生理盐水稀释免疫原对高效价小鼠进行连续加强免疫。处死小鼠，浸泡于75%酒精1min。将小鼠仰卧在解剖板上，剪开胸部皮肤，纵向拉开皮肤，暴露腹部，用注射器抽取5mL无血清培养液注入腹腔，轻柔腹部1～2min，吸出细胞悬液，移入离心管。用无血清培养液离心洗涤一次。弃去上清液，加入HAT培养液，均匀悬液，接种于96孔培养板，0.1mL/孔。置37℃、5%CO₂及饱和湿度条件下培养备用。

细胞融合：将50%PEG4000、无血清培养液、HAT筛选培养液置37℃CO₂培养箱中预热。收获对数生长期的Sp2/0细胞，用无血清培养液洗涤3次，作活细胞计数。无菌条件下分离脾细胞，作活细胞计数。将1×10⁸脾细胞与1×10⁷Sp2/0细胞在50mL尖底离心管中混匀，离心弃去上清液。将含有脾细胞和Sp2/0瘤细胞的50mL尖底离心管放于水杯中，用1mL吸管吸取0.7mLPEG4000缓慢加入到细胞混悬液中，静置90秒，加15mL37℃预热的无血清培养液，离心弃去上清液，加入37℃预温HAT培养液充分混匀。接种于含有饲养细胞的96孔培养板中，置37℃、5%CO₂及饱和湿度条件下培养。

杂交瘤细胞的筛选和杂交瘤细胞的克隆：融合5天观察有小集落后，用HAT筛选培养液换液，10天后换HT培养液。集落长至1/3～1/2孔时，取培养上清液，用间接ELISA法检测阳性孔。OD₄₅₀值大于1时，判定为阳性孔。将阳性孔细胞转至24孔含有巨噬细胞的培养板，待集落长至1/3～1/2孔时，取培养上清液，用间接ELISA法检测特异性。检出无交叉阳性株，进行克隆化培养，同时转入培养瓶。

采用有限稀释法分别对阳性的杂交瘤细胞株进行了3次克隆，用ELISA法筛选阳性率达到100%的细胞株，且OD₄₅₀值最高的细胞株。扩大培养，冻存，建立细胞株系。

腹水获得：将筛选得到的细胞株生产细胞复苏后，培养扩增。于两周前给小鼠腹腔注射降植烷。然后将扩增的杂交瘤细胞接种于用降植烷处理过的BALB/C小鼠腹腔内。7～11天后小鼠开始产生腹水。采用一次收集的方法收集腹水，离心，弃去上层油脂，吸取淡黄色腹水，分装，-20℃冻存备用。

抗体的分离纯化和鉴定：纯化抗体；SDS-PAGE电泳法鉴定抗体纯度，抗体纯度良好；ELISA方法鉴定抗体活性，OD₄₅₀值大于1，均合格；ELISA方法鉴定抗体特异性，检测单抗只针对该毒素抗原特异，与其它抗原不发生反应，具有较好的特异性；抗体亲和力测定。

反应垫上质控线的制备：将羊抗鼠IgG抗体按0.1~1mg/ml的浓度划线，两膜线间的距离为5~6mm，粗细均匀，喷完检测好的膜需立即放入30~45℃的烘干10~12小时；

反应垫上检测线的制备：将呕吐毒素-BSA、玉米赤霉烯酮-BSA、赭曲霉毒素A-BSA以0.1~3mg/ml的浓度划线，两膜线间的距离为5~6mm，粗细均匀，喷完检测好的膜需立即放入30~45℃烘干10~12小时；

吸液垫为吸水纸制成，所述样品吸收垫为吸水玻璃纤维素膜一层叠加高分子吸水纤维素膜叠一层压制而成，背板为PVC材料，将所述的反应垫、吸液垫、样品吸收垫粘贴于背板上，得到成型板，将成型板切割成宽度3~6mm即制成检测试纸；

金标微孔的制备：在500~1000ml双蒸水中加入0.1~2%的氯化金10~80ml加热搅拌，加入0.5~5%的柠檬酸三钠10~40ml，制成15~40nm金液；称量金液50ml加0.01~1MK2CO30.5~2ml调pH4~7，取0.5~4mg/ml呕吐毒素单克隆抗体、0.5~4mg/ml玉米赤霉烯酮单克隆抗体、0.5~4mg/ml赭曲霉毒素A单克隆抗体中的1~3种加入50ml金液中搅拌，离心1000~5000r5~10分钟，弃上清液，沉淀用PH5~7檬酸磷酸盐缓冲液稀释至50m，制成抗体金；取抗体金1~20ml加PH5~7檬酸磷酸盐缓冲液稀释到30~60ml，加入微孔板中，-40~-70℃10~30小时冻干，即制成金标微孔。

为实现本发明第三个目的，采用如下技术方案：

多种真菌毒素快速联合检测试剂盒的使用方法，其特征在于：多种真菌毒素通用的样品前处理方法，称取5g玉米、小麦、饲料样品研磨至20目，加入0.1~0.5g盐，加入10~30mL60~80%甲醇-水溶液，振荡2~10分钟，于5000~10000rpm离心2~5分钟，弃沉淀，取100μl上清液加入50~200μL纯水混匀待检。赭曲霉毒素A检出水平为5μg/kg，呕吐毒素检出水平为5μg/kg，玉米赤霉烯酮水平为5μg/kg。

具体实施例一、呕吐毒素、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A胶体金试剂盒的制备

1.呕吐毒素-BSA制备：呕吐毒素标品1~4mg加50~200μl二甲基亚砜，加N,N'-羰基二咪唑10~50mg，25~45℃水浴搅拌；牛血清白蛋白1~25mg加100~500μl0.01MpH4~7PBS溶解；搅拌反应1~4h。

玉米赤霉烯酮-BSA制备：称玉米赤霉烯酮标品10~30mg，溶于20~30ml吡啶溶液，室温搅拌反应；浓缩至干，加5~10ml超纯水，用NaOH调pH6~8，用乙酸乙酯萃取三次，弃去有机层；加HCl使水层pH3-4；过滤，加入12~15mg/ml的二环己基碳二亚胺的无水DMF溶液0.1~0.5ml，室温振荡3-5h；加入牛血清白蛋白100mg加10ml0.05MpH8~10碳酸缓冲液。

赭曲霉毒素-BSA制备：50~100mg赭曲霉毒素A溶于15~25mLN,N-二甲基甲酰胺溶液中后，加到20mL溶有400mgBSA的PBS溶液中，合成赭曲霉毒素A-戊二醛-BSA复合物；在上述混合溶液中逐滴加入150μL25%的戊二醛；将此混合物在室温下用磁力搅拌机轻柔搅拌3h；用0.01MpH7.3PBS透析3天，每天换液2次。

2.免疫动物：选择6周龄雌性BALB/C小鼠，将抗原与福氏完全佐剂等量混合、乳化，经腹部皮下多点注射进行基础免疫。分别隔4周，进行第二、三次免疫。第三次免疫后第7～10天，断尾取血，分离血清，用ELISA方法检测血清效价。用生理盐水稀释免疫原对高效价小鼠进行连续加强免疫。处死小鼠，浸泡于75%酒精1min。将小鼠仰卧在解剖板上，剪开胸部皮肤，纵向拉开皮肤，暴露腹部，用注射器抽取5mL无血清培养液注入腹腔，轻柔腹部1～2min，吸出细胞悬液，移入离心管。用无血清培养液离心洗涤一次。弃去上清液，加入HAT培养液，均匀悬液，接种于96孔培养板，0.1mL/孔。置37℃、5%CO₂及饱和湿度条件下培养备用。

细胞融合：将50%PEG4000、无血清培养液、HAT筛选培养液置37℃CO₂培养箱中预热。收获对数生长期的Sp2/0细胞，用无血清培养液洗涤3次，作活细胞计数。无菌条件下分离脾细胞，作活细胞计数。将1×10⁸脾细胞与1×10⁷Sp2/0细胞在50mL尖底离心管中混匀，离心弃去上清液。将含有脾细胞和Sp2/0瘤细胞的50mL尖底离心管放于水杯中，用1mL吸管吸取0.7mLPEG4000缓慢加入到细胞混悬液中，静置90秒，加15mL37℃预热的无血清培养液，离心弃去上清液，加入37℃预温HAT培养液充分混匀。接种于含有饲养细胞的96孔培养板中，置37℃、5%CO₂及饱和湿度条件下培养。

杂交瘤细胞的筛选和杂交瘤细胞的克隆：融合5天观察有小集落后，用HAT筛选培养液换液，10天后换HT培养液。集落长至1/3～1/2孔时，取培养上清液，用间接ELISA法检测阳性孔。OD₄₅₀值大于1时，判定为阳性孔。将阳性孔细胞转至24孔含有巨噬细胞的培养板，待集落长至1/3～1/2孔时，取培养上清液，用间接ELISA法检测特异性。检出无交叉阳性株，进行克隆化培养，同时转入培养瓶。

采用有限稀释法分别对阳性的杂交瘤细胞株进行了3次克隆，用ELISA法筛选阳性率达到100%的细胞株，且OD₄₅₀值最高的细胞株。扩大培养，冻存，建立细胞株系。

腹水获得：将筛选得到的细胞株生产细胞复苏后，培养扩增。于两周前给小鼠腹腔注射降植烷。然后将扩增的杂交瘤细胞接种于用降植烷处理过的BALB/C小鼠腹腔内。7～11天后小鼠开始产生腹水。采用一次收集的方法收集腹水，离心，弃去上层油脂，吸取淡黄色腹水，分装，-20℃冻存备用。

抗体的分离纯化和鉴定：纯化抗体；SDS-PAGE电泳法鉴定抗体纯度，抗体纯度良好；ELISA方法鉴定抗体活性，OD₄₅₀值大于1，均合格；ELISA方法鉴定抗体特异性，检测单抗只针对该毒素抗原特异，与其它抗原不发生反应，具有较好的特异性；抗体亲和力测定。

3.反应垫上质控线的制备：将羊抗鼠IgG抗体按0.1~1mg/ml的浓度划线，两膜线间的距离为5~6mm，粗细均匀，喷完检测好的膜需立即放入30~45℃的烘干10~12小时；

反应垫上检测线的制备：将呕吐毒素-BSA、玉米赤霉烯酮-BSA、赭曲霉毒素A-BSA以0.1~3mg/ml的浓度划线，两膜线间的距离为5~6mm，粗细均匀，喷完检测好的膜需立即放入30~45℃烘干10~12小时；

吸液垫为吸水纸制成，所述样品吸收垫为吸水玻璃纤维素膜一层叠加高分子吸水纤维素膜叠一层压制而成，背板为PVC材料，将所述的反应垫、吸液垫、样品吸收垫粘贴于背板上，得到成型板，将成型板切割成宽度3~6mm即制成检测试纸；

质控线由PH6~8、0.01~0.05M磷酸缓冲液稀释至0.1~1mg/ml羊抗鼠多克隆抗体包被。检测线由PH5~8、0.01~0.05M磷酸盐缓冲液稀释至0.1~3mg/ml的呕吐毒素-BSA、玉米赤霉烯酮-BSA、赭曲霉毒素A-BSA偶联物包被。

4.金标微孔的制备：在500~1000ml双蒸水中加入0.1~2%的氯化金10~80ml加热搅拌，加入0.5~5%的柠檬酸三钠10~40ml，制成15~40nm金液；称量金液50ml加0.01~1MK2CO30.5~2ml调pH4~7，取0.5~4mg/ml呕吐毒素单克隆抗体、0.5~4mg/ml玉米赤霉烯酮单克隆抗体、0.5~4mg/ml赭曲霉毒素A单克隆抗体中的1~3种加入50ml金液中搅拌，离心1000~5000r5~10分钟，弃上清液，沉淀用PH5~7檬酸磷酸盐缓冲液稀释至50m，制成抗体金；取抗体金1~20ml加PH5~7檬酸磷酸盐缓冲液稀释到30~60ml，加入微孔板中，-40~-70℃10~30小时冻干，即制成金标微孔。

5.试剂盒组成：在检测试纸背板上依次粘贴吸液垫、反应垫和样品吸收垫，吸液垫与反应垫交叠1~2mm，样品吸收垫与反应垫交叠1~2mm，所述反应垫为硝酸纤维素膜上包被有1条质控线和1~3条检测线，质控线和各条检测线相互平行，所述质控线包被有羊抗鼠多克隆抗体，检测线包被有呕吐毒素-BSA、玉米赤霉烯酮-BSA、赭曲霉毒素A-BSA中的一种至三种；所述金标微孔为0.5~4mg/ml呕吐毒素单克隆抗体、0.5~4mg/ml玉米赤霉烯酮单克隆抗体、0.5~4mg/ml赭曲霉毒素A单克隆抗体混合胶体金液，包被于微孔板中。吸液垫采用吸水纸制成，所述样品吸收垫为吸水玻璃纤维素膜与高分子吸水纤维素膜叠加压制而成。检测试纸宽度为4~6mm，吸液垫长16~18mm，反应垫长15~18mm，样品吸收垫长18~20mm。质控线、1~3条检测线之间互相间距均为5~6mm。

具体实施例二、使用方法

1、样品前处理方法：多种真菌毒素通用的样品前处理方法，称取5g玉米、小麦、饲料样品研磨至20目，加入0.1~0.5g盐，加入10~30mL60~80%甲醇-水溶液，振荡2~10分钟，于5000~10000rpm离心2~5分钟，弃沉淀，取100μl上清液加入50~200μL纯水混匀待检。

2、检测限：赭曲霉毒素A检出水平为5μg/kg，呕吐毒素检出水平为5μg/kg，玉米赤霉烯酮水平为5μg/kg。

Claims (9)

1.多种真菌毒素快速联合检测试剂盒，其特征在于：其包括检测试纸和金标微孔，所述检测试纸包括背板上依次粘贴吸液垫、反应垫和样品吸收垫，吸液垫与反应垫交叠1~2mm，样品吸收垫与反应垫交叠1~2mm，所述反应垫为硝酸纤维素膜上包被有1条质控线和1~3条检测线，质控线和各条检测线相互平行，所述质控线包被有羊抗鼠多克隆抗体，检测线包被有呕吐毒素-BSA、玉米赤霉烯酮-BSA、赭曲霉毒素A-BSA中的一种至三种；所述金标微孔为0.5~4mg/ml呕吐毒素单克隆抗体、0.5~4mg/ml玉米赤霉烯酮单克隆抗体、0.5~4mg/ml赭曲霉毒素A单克隆抗体混合胶体金液，包被于微孔板中。

2.根据权利要求1所述的多种真菌毒素快速联合检测试剂盒，其特征在于：所述吸液垫采用吸水纸制成，所述样品吸收垫为吸水玻璃纤维素膜与高分子吸水纤维素膜叠加压制而成。

3.根据权利要求1所述的多种真菌毒素快速联合检测试剂盒，其特征在于：所述检测试纸宽度为4~6mm，吸液垫长16~18mm，反应垫长15~18mm，样品吸收垫长18~20mm。

4.根据权利要求1所述的多种真菌毒素快速联合检测试剂，其特征在于：所述质控线、1~3条检测线之间互相间距均为5~6mm。

5.根据权利要求1所述的多种真菌毒素快速联合检测试剂盒，其特征在于：所述质控线由PH6~8、0.01~0.05M磷酸缓冲液稀释至0.1~1mg/ml羊抗鼠多克隆抗体包被。

6.根据权利要求1所述的多种真菌毒素快速联合检测试剂盒，其特征在于：所述检测线由PH5~8、0.01~0.05M磷酸盐缓冲液稀释至0.1~3mg/ml的呕吐毒素-BSA、玉米赤霉烯酮-BSA、赭曲霉毒素A-BSA偶联物包被。

7.多种真菌毒素快速联合检测试剂盒的制备方法，其特征在于：

呕吐毒素-BSA制备：呕吐毒素标品1~4mg加50~200μl二甲基亚砜，加N,N'-羰基二咪唑10~50mg，25~45℃水浴搅拌；牛血清白蛋白1~25mg加100~500μl0.01MpH4~7PBS溶解；搅拌反应1~4h；

玉米赤霉烯酮-BSA制备：称玉米赤霉烯酮标品10~30mg，溶于20~30ml吡啶溶液，室温搅拌反应；浓缩至干，加5~10ml超纯水，用NaOH调pH6~8，用乙酸乙酯萃取三次，弃去有机层；加HCl使水层pH3-4；过滤，加入12~15mg/ml的二环己基碳二亚胺的无水DMF溶液0.1~0.5ml，室温振荡3-5h；加入牛血清白蛋白100mg加10ml0.05MpH8~10碳酸缓冲液；

赭曲霉毒素-BSA制备：50~100mg赭曲霉毒素A溶于15~25mLN,N-二甲基甲酰胺溶液中后，加到20mL溶有400mgBSA的PBS溶液中，合成赭曲霉毒素A-戊二醛-BSA复合物；在上述混合溶液中逐滴加入150μL25%的戊二醛；将此混合物在室温下用磁力搅拌机轻柔搅拌3h；用0.01MpH7.3PBS透析3天，每天换液2次；

反应垫上质控线的制备：将羊抗鼠IgG抗体按0.1~1mg/ml的浓度划线，两膜线间的距离为5~6mm，粗细均匀，喷完检测好的膜需立即放入30~45℃的烘干10~12小时；

反应垫上检测线的制备：将呕吐毒素-BSA、玉米赤霉烯酮-BSA、赭曲霉毒素A-BSA以0.1~3mg/ml的浓度划线，两膜线间的距离为5~6mm，粗细均匀，喷完检测好的膜需立即放入30~45℃烘干10~12小时；

吸液垫为吸水纸制成，所述样品吸收垫为吸水玻璃纤维素膜一层叠加高分子吸水纤维素膜叠一层压制而成，背板为PVC材料，将所述的反应垫、吸液垫、样品吸收垫粘贴于背板上，得到成型板，将成型板切割成宽度3~6mm即制成检测试纸；

金标微孔的制备：在500~1000ml双蒸水中加入0.1~2%的氯化金10~80ml加热搅拌，加入0.5~5%的柠檬酸三钠10~40ml，制成15~40nm金液；称量金液50ml加0.01~1MK₂CO₃0.5~2ml调pH4~7，取0.5~4mg/ml呕吐毒素单克隆抗体、0.5~4mg/ml玉米赤霉烯酮单克隆抗体、0.5~4mg/ml赭曲霉毒素A单克隆抗体中的1~3种加入50ml金液中搅拌，离心1000~5000r5~10分钟，弃上清液，沉淀用PH5~7檬酸磷酸盐缓冲液稀释至50m，制成抗体金；取抗体金1~20ml加PH5~7檬酸磷酸盐缓冲液稀释到30~60ml，加入微孔板中，-40~-70℃10~30小时冻干，即制成金标微孔。

8.多种真菌毒素快速联合检测试剂盒的使用方法，其特征在于：多种真菌毒素通用的样品前处理方法，称取5g玉米、小麦、饲料样品研磨至20目，加入0.1~0.5g盐，加入10~30mL60~80%甲醇-水溶液，振荡2~10分钟，于5000~10000rpm离心2~5分钟，弃沉淀，取100μl上清液加入50~200μL纯水混匀待检。

9.多种真菌毒素快速联合检测试剂盒的使用方法，其特征在于：赭曲霉毒素A检出水平为5μg/kg，呕吐毒素检出水平为5μg/kg，玉米赤霉烯酮水平为5μg/kg。