CN103499690B

CN103499690B - 喹乙醇代谢物免疫层析试纸卡及其制备方法

Info

Publication number: CN103499690B
Application number: CN201310478059.7A
Authority: CN
Inventors: 张慧辉; 姜金庆; 王自良; 李广领; 杨雪峰; 范国英; 杨理; 赵旭娜; 刘长忠
Original assignee: Henan Institute of Science and Technology
Current assignee: Henan Institute of Science and Technology
Priority date: 2013-10-14
Filing date: 2013-10-14
Publication date: 2016-04-27
Anticipated expiration: 2033-10-14
Also published as: CN103499690A

Abstract

本发明公开了一种喹乙醇代谢物免疫层析试纸卡及其制备方法，属于兽药残留的免疫化学快速检测技术领域。本发明的喹乙醇代谢物免疫层析试纸卡包括塑料卡壳和封装于塑料卡壳内的试纸条，所述塑料卡壳上开有加样孔和观察窗；所述试纸条的底层为支撑层，该支撑层上由左到右依次附着有交叠连接的样品垫、金标垫、检测垫和吸水垫。本发明还公开了该喹乙醇代谢物免疫层析试纸卡的制备方法。本发明的试纸卡具有操作简单、快速准确、灵敏度高、特异性强、结果显示形象、直观等优点，能够现场监控且适合大量样本的筛查。

Description

喹乙醇代谢物免疫层析试纸卡及其制备方法

技术领域

本发明属于兽药残留的免疫化学快速检测技术领域，具体涉及一种喹乙醇代谢物免疫层析试纸卡及其制备方法。

背景技术

喹乙醇（Olaquindox）又称喹酰胺醇、快育灵，是20世纪70年代初由西德拜尔药厂研制合成的饲料添加剂，因其具有广谱抗菌效果和促生长作用，被广泛用于畜禽养殖、抗菌治疗和水产动物的疫病防控。然而大量生物毒性试验表明：过量的喹乙醇会在动物体内残留，具有明显的蓄积毒性，致癌、致畸变作用和DNA损伤等毒副作用。鉴于对人类健康造成的危害，欧盟委员会EC2788/98决议将喹乙醇列为禁用药，国内NY5070-2002准则中也规定喹乙醇禁用渔药。但喹乙醇本身不稳定，在动物体内能够短时间内代谢成十多种产物，其中3-甲基喹噁啉-2-羧酸（MQCA）是主要代谢物之一，其在体内相对稳定，是国际食品法典委员会认定的残留标识物之一，因此通常将喹乙醇代谢物MQCA作为残留分析和监控的目标物。2003年我国农业部规定了肌肉和肝脏组织中MQCA的最大残留量分别为4μg/kg和50μg/kg。

喹乙醇及其代谢物的残留检测方法主要包括薄层色谱法、高效液相色谱法、质谱法、高效液相－质谱联用法等，这些方法灵敏准确、特异性强，分离度好，但需要昂贵的仪器设备，样品前处理复杂、繁琐费时、检测成本高，不能现场操作，而且需要专业技术人员；与之相比，酶联免疫方法具有特异性强、灵敏度高、操作简便、检测成本低、适合于批量样品的筛选等优点，而且所需设备少，操作简单易学，成本低廉，能够更好地满足我国水产养殖、食品加工企业、药物残留监控部门等开展检测工作。

胶体金免疫层析法是近年来迅速发展的一种新型分析技术，其特点是简便快速、成本低、无污染、无需培训，非常适合于现场检测。与ELISA相比，具有样品前处理简单，显色时间短（3-5min），且所有试剂包含在一根试纸条上，无需使用仪器等优点，具有广阔的市场前景和应用价值。因此，研制快速、灵敏、高效的喹乙醇代谢物免疫层析试纸卡对于保障动物性食品安全具有十分重要的意义。

发明内容

本发明解决的技术问题是提供了一种操作简便、快速准确、灵敏度高、特异性强、成本低廉、稳定性好且可进行批量检测的喹乙醇代谢物免疫层析试纸卡及其制备方法。

本发明的技术方案是：

一种喹乙醇代谢物免疫层析试纸卡，其特征在于包括塑料卡壳和封装于塑料卡壳内的试纸条，所述的塑料卡壳是由底座和面盖嵌合在一起构成的，底座上设有放置试纸条的槽和与面盖相嵌合的卡口，面盖上设有观察窗和加样孔以及与底座相嵌合的卡齿，在观察窗旁边分别印有代表检测线的T和代表质控线的C，其中代表检测线的T靠近加样孔的一侧；所述的试纸条的底层为支撑层，该支撑层上由左到右依次附着有交叠连接的样品垫、金标垫、检测垫和吸水垫，其中检测垫的位置与塑料卡壳上观察窗的位置相对应，样品垫的位置与塑料卡壳上加样孔的位置相对应，所述的检测垫以硝酸纤维素膜为基础，包含3-甲基喹噁啉-2-羧酸-鸡卵清白蛋白偶联物溶液喷涂的检测线和羊抗鼠IgG溶液喷涂的质控线，所述金标垫上灌注有胶体金标记的抗喹乙醇代谢物特异性单克隆抗体，所述的样品垫、金标垫和吸水垫上方覆盖有胶膜保护层。

本发明所述的样品垫的制备方法为：将玻璃纤维棉用含有质量浓度为2%的BSA、质量浓度为1%的蔗糖、质量浓度为0.5%的硼酸钠和质量浓度为0.1%的NaN₃的PBS缓冲液处理后，干燥备用，即为样品垫。

本发明所述的金标垫的制备方法为：将玻璃纤维棉裁成4mm宽的细条，放入含有质量浓度为5%的BSA、质量浓度为2%的蔗糖、质量浓度为0.8%的NaCl和质量浓度为0.05%的NaN₃的PBS缓冲液中20min，37℃恒温烘干，然后将胶体金标记的抗喹乙醇代谢物特异性单克隆抗体灌注已处理好的玻璃纤维棉上，真空冻干4h，即为金标抗体结合垫。

本发明所述的检测垫的制备方法为：将硝酸纤维素膜置于X-only单向喷点仪平台上，3-甲基喹噁啉-2-羧酸-鸡卵清白蛋白偶联物溶液放于A池，羊抗鼠IgG溶液（GaMIgG）放于B池，展平压紧，开机后将检测抗原和二抗分别点射喷涂于硝酸纤维素膜上，形成检测线和质控线，室温自然干燥后，将其浸入BSA质量浓度为1%的PBS缓冲液，pH值为7.4的封闭液中30min，37℃烘干后，加入干燥剂，4℃密封保存。

本发明所述的吸水垫的制备方法为：将以植物长纤维为原材料制作的纯白滤纸用切割机切成4mm宽的细条，并用胶膜进行一侧封闭，干燥备用，即为吸水垫。

本发明所述的检测线上喷涂的偶联抗原是3-甲基喹噁啉-2-羧酸-鸡卵清白蛋白偶联物溶液，其制备方法为：在N,N-二环已基碳二亚胺（DCC）活化和催化下，喹乙醇代谢物3-甲基喹噁啉-2-羧酸半抗原与N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）发生酯化反应，反应产物再与鸡卵清白蛋白偶联，制得检测抗原。

本发明所述的金标垫上标记的抗体是抗喹乙醇代谢物特异性单克隆抗体，其制备方法为：（1）人工抗原合成：采用活泼酯法将喹乙醇代谢物3-甲基喹噁啉-2-羧酸和载体蛋白偶联，制得免疫原和包被原；（2）动物免疫：以雌性Balb/C小鼠作为免疫动物，背皮下多点注射法免疫5-6次；（3）细胞融合：在聚乙二醇的1500（PEG-1500）作用下，将免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤NS0细胞进行融合；（4）杂交瘤细胞株筛选：用间接ELISA和间接竞争ELISA（ciELISA）筛选强阳性、抑制率高、生长状态好的杂交瘤细胞株；（5）细胞亚克隆：采用有限稀释法将阳性孔细胞株进行亚克隆，制得纯化的单克隆源杂交瘤细胞；（6）单抗制备：体内诱生腹水法制备抗喹乙醇代谢物单克隆抗体，饱和硫酸胺法纯化抗体后，进行胶体金标记。

本发明所述的喹乙醇代谢物免疫层析试纸卡的制备方法，其特征在于：首先将样品垫、金标垫、检测垫和吸水垫依次附着于支撑层上，由左到右交叠连接，叠压宽度2mm，然后用切割机制成宽4mm，长60mm的试纸条，封装于带有加样孔和观察窗的塑料卡壳内，制得喹乙醇代谢物免疫层析试纸卡。

本发明的试纸卡具有操作简单、快速准确、灵敏度高、特异性强、结果显示形象、直观等优点，能够现场监控且适合大量样本的筛查。

附图说明

图1为单克隆源细胞株M1D2和M3A6间接竞争ELISA标准曲线图，图2为本发明试纸卡的结构示意图，图3为本发明试纸卡中试纸条的侧视图，图4为本发明试纸卡中试纸条的俯视图。

图面说明：1、塑料卡壳，2、试纸条，3、支撑层，4、样品垫，5、金标垫，6、检测垫，7、吸水垫，8、加样孔，9、观察窗，10、质控线（C线），11、检测线（T线），12、胶膜保护层，13、标记线。

具体实施方式

结合附图详细描述实施例。一种喹乙醇代谢物免疫层析试纸卡，包括塑料卡壳1和封装于塑料卡壳1内的试纸条2，所述试纸条2的底层为支撑层3，该支撑层3上由左到右依次附着有交叠连接的样品垫4、金标垫5、检测垫6和吸水垫7，所述塑料卡壳1上开有加样孔8和观察窗9，该加样孔8的位置与试纸条2上样品垫4的位置相对应，观察窗9与试纸条2上检测垫6的位置相对应，所述的检测垫6上有3-甲基喹噁啉-2-羧酸-鸡卵清白蛋白（MQCA-OVA）偶联物溶液喷涂的检测线（T线）11和羊抗鼠IgG溶液喷涂的质控线（C线）10，两者间距5mm，其中检测线11位于靠近样品垫4的一侧，所述金标垫5上灌注有胶体金标记的抗喹乙醇代谢物特异性单克隆抗体。

本发明所述的支撑层3是由聚氯乙烯树脂与稳定剂及辅料配合制成的PVC板，所述的吸水垫7是由吸水能力极强的植物长纤维为原材料制成的纯白滤纸，所述的样品垫4和金标垫5是由玻璃纤维棉制作而成的，所述的样品垫4和金标垫5的叠压宽度为2mm，吸水垫7与检测垫6的叠压宽度为2mm，所述的样品垫4、金标垫5和吸水垫7上方覆盖有胶膜保护层12，所述的检测垫6两端分界处有标记线13。

实施例

检测抗原的制备

准确称取3-甲基喹噁啉-2-羧酸（MQCA）40mg，N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）12mg，N,N-二环已基碳二亚胺（DCC）45mg，溶入到2ml1,4-二氧六环溶液中，37℃避光搅拌反应12h，离心后去沉淀，称为A液。将20mg的OVA溶于5ml碳酸盐缓冲溶液中（CBS，0.05mol/L,pH9.6），称为B液。搅拌条件下将A液逐滴加入到B液中，4℃振荡反应过夜。反应完成后离心，上清用PBS缓冲溶液透析6天，制得的检测抗原MQCA-OVA冻干保存。检测抗原合成路线如下述反应方程式所示。

抗喹乙醇代谢物特异性单克隆抗体的制备方法

1、人工抗原合成：采用活泼酯法将喹乙醇代谢物3-甲基喹噁啉-2-羧酸和载体蛋白偶联，制得免疫原（MQCA-BSA）和包被原（MQCA-OVA），其合成路线如上述反应方程式所示。

2、小鼠免疫：用MQCA-BSA免疫8~10周龄雌性Balb/C小鼠5只，剂量为60μg/只，体积为0.2ml。首免用PBS稀释的免疫原与等体积FCA完全乳化，以后每隔3w加强免疫一次，换用FIA乳化。免疫5次后断尾采血分离血清，用间接ELISA和间接竞争ELISA（ciELISA）筛选效价高，抑制效果好的小鼠作为融合备用鼠。融合前3d超免小鼠，尾静脉和腹腔各注射60μg免疫原。

3、细胞融合：融合前4~5d用含有8-氮鸟嘌呤的完全培养基（含15%FBS的RPMI-1640）传代培养NS0细胞；前1d用HAT培养滋养细胞；融合时眶下窦采血，脱颈致死小鼠。无菌取脾脏制备脾细胞，在PEG-1500作用下与NS0细胞融合（细胞数量比约为10：1），将融合后的细胞悬液加入到已铺有滋养细胞的96孔细胞板中，HAT培养。

4、杂交瘤细胞株的筛选：融合后10~14d用间接ELISA和ciELISA筛选强阳性、抑制率高、生长状态好的杂交瘤细胞株，用有限稀释法进行3次亚克隆，筛选灵敏度高、特异性强的单克隆源细胞株，共取得6株。其中，细胞株M1D2和M3A6间接竞争ELISA标准曲线如图1所示。

5、单克隆抗体的制备：将M1D2或M3A6细胞株转移到24孔细胞板及50ml细胞瓶中扩大培养。筛选的杂交瘤细胞浓度达到约10⁷/ml时，向10d前经液体石蜡处理过的经产母鼠腹腔内注射单克隆细胞10⁸/只。10~12d后抽取腹水，饱和硫酸胺法纯化抗喹乙醇代谢物特异性单克隆抗体，进行胶体金标记。

MQCA单克隆抗体－胶体金标记物的制备

1、胶体金溶液的制备：取超纯水溶解的0.01%氯金酸溶液100ml，置电炉加热至沸腾，3min后边搅拌，边迅速加入1%的柠檬酸三钠溶液2ml。继续加热，溶液颜色由无色转为浅黄色，最后变为橙红色时停止加热。冷却后用超纯水恢复至原体积，进行透射电镜扫描，鉴定胶体金质量及颗粒大小。胶体金悬液中加入最终质量浓度为0.05%的叠氮钠（NaN₃），4℃冰箱中保存备用。

2、抗体预处理：高浓度的抗体长时间冷冻保存会发生不同程度的聚集，这些聚集物会影响标记的稳定性。因此标记前，将抗MQCA特异性单克隆抗体10000r/min，4℃条件下离心30min，弃沉淀，上清液用0.01mol/LPBS稀释成1mg/ml。

3、待标mAb实际用量的确定：酶标板用每孔50μl双蒸水铺底，纵排加入倍比稀释的MQCAmAb，每孔50μl，设空白对照（BC）。用0.1mol/LK₂CO₃调节胶体金溶液至pH9.0，加入到酶标板中，每孔50μl混匀。室温孵育15min后，加入10%NaCl溶液100μl，混匀，静置。对照孔与mAb量不足以稳定金溶胶的各孔呈现由红变蓝的聚沉现象，而mAb量达到或超过最低稳定量的各孔仍保持红色不变。选择不聚沉时mAb的最低量，在此基础上增加20%，即为待标MQCAmAb的实际用量。

4、金标抗体的制备：将事先确定的最佳标记蛋白量与胶体金偶联，常温搅拌30min，5000r/min离心20min，弃上清后，加入10%BSA硼酸钠溶液，使BSA终浓度为1%作为稳定剂。金标抗体溶液10000r/min离心30min，弃上清，用20mmol/L的硼酸盐稀释液（含1%BSA和0.1%叠氮钠）将金标抗体恢复至原体积的1/10，放置在4℃冰箱备用。

喹乙醇代谢物免疫层析试纸卡的制备方法

1、样品垫的制备：将玻璃纤维棉用含质量浓度为2%的BSA，质量浓度为1%的蔗糖，质量浓度为0.5%的硼酸钠和质量浓度为0.1%的NaN₃的PBS处理后，干燥备用，即为样品垫。

2、金标垫的制备：将玻璃纤维棉裁成4mm宽的细条，放入含质量浓度为5%的BSA，质量浓度为2%的蔗糖，质量浓度为0.8%的NaCl和质量浓度为0.05%的NaN₃的PBS处理液中20min，37℃恒温烘干，然后将MQCA单克隆抗体－胶体金标记物灌注已处理好的玻璃纤维棉上，真空冻干4h，即为金标垫。

3、检测垫的制备：将硝酸纤维素膜置于X-only单向喷点仪平台上，检测抗原放于A池，GaMIgG放于B池，展平压紧，开机后将抗原和二抗分别点射于硝酸纤维素膜上，形成检测线（T线）和质控线（C线）。室温自然干燥后，将其浸入封闭液（质量浓度为1%的BSA的PBS缓冲液，pH7.4）中30min，37℃烘干后，加入干燥剂，4℃密封保存。

4、试纸卡的组装：将样品垫、金标垫、检测垫、吸水垫和胶膜保护层等按图3、图4所示的顺序依次粘附在支撑层（PVC板）上，由左到右交叠连接，叠压宽度2mm。然后用CM4000切割机制成宽4mm，长60mm的试纸条，封装于带有加样孔和观察窗的塑料卡壳内，真空包装，即为本发明喹乙醇代谢物免疫层析试纸卡。试纸卡的结构如图2所示。

本发明喹乙醇代谢物免疫层析试纸卡的检测原理

试纸卡根据抗原抗体竞争性免疫层析原理设计。滴加样品液后，在吸水垫和NC膜的毛细作用下，样品溶液向上迁移，到达金标垫时，金标抗体将被溶解。当样品中含有MQCA药物残留时，它们将和金标抗体结合，并一起向上迁移，到达固定有MQCA-OVA的检测线位置时，检测抗原将和MQCA竞争结合金标抗体上有限的抗原结合位点。样品中MQCA残留含量越高，检测抗原和金标抗体结合数量就越少，T线显色就越弱；当样品中MQCA残留含量高于一定数值时，检测抗原就无法和金标抗体结合，T线不显色。无论样品中是否有MQCA存在，过量的金标抗体或检测抗原与金标抗体的结合物都将和二抗GaMIgG结合，在C线形成红色。

本发明喹乙醇代谢物免疫层析试纸卡的使用方法

1、样品前处理

称取1.00±0.05g已绞碎的动物组织样品于50ml具拧盖的塑料离心管中，加入9mlPBS－乙酸乙酯溶液（v/v，20/80），用振荡器均质5min；再加入2mol/LH₂SO₄溶液1ml，振荡30s，3500r/min离心10min。取1ml上清液至玻璃试管中，加入4mlPBS缓冲液，混匀后待检。

2、样品检测：将试纸卡平放后，用滴管将样品溶液滴入试纸卡加样孔内3~4滴，3~5min后即可观察结果。

3、结果判定：

阴性：若检测垫上质控线（C线）和检测线（T线）同时出现两条红色“Ⅱ”印迹时，判为阴性，说明样品中不含待测物。

阳性：若检测垫上质控线（C线）显示一条红色“Ⅰ”印迹，而检测线（T线）不显色，判为阳性，说明样品中含有待测物。

无效：若检测垫上质控线（C线）不显示红色条带，则无论检测线（T线）是否出现红色印迹，该试纸卡均判为无效。

Claims

1.一种喹乙醇代谢物免疫层析试纸卡，其特征在于包括塑料卡壳和封装于塑料卡壳内的试纸条，所述的塑料卡壳是由底座和面盖嵌合在一起构成的，底座上设有放置试纸条的槽和与面盖相嵌合的卡口，面盖上设有观察窗和加样孔以及与底座相嵌合的卡齿，在观察窗旁边分别印有代表检测线的T和代表质控线的C，其中代表检测线的T靠近加样孔的一侧；所述的试纸条的底层为支撑层，该支撑层上由左到右依次附着有交叠连接的样品垫、金标垫、检测垫和吸水垫，其中检测垫的位置与塑料卡壳上观察窗的位置相对应，样品垫的位置与塑料卡壳上加样孔的位置相对应，所述的检测垫以硝酸纤维素膜为基础，包含3-甲基喹噁啉-2-羧酸-鸡卵清白蛋白偶联物溶液喷涂的检测线和羊抗鼠IgG溶液喷涂的质控线；

所述3-甲基喹噁啉-2-羧酸-鸡卵清白蛋白偶联物的制备方法为：称取3-甲基喹噁啉-2-羧酸（MQCA）40mg，N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）12mg，N,N-二环已基碳二亚胺（DCC）45mg，溶入到2ml1,4-二氧六环溶液中，37℃避光搅拌反应12h，离心后去沉淀，称为A液，将20mg的OVA溶于5ml0.05mol/L,pH9.6的碳酸盐缓冲溶液中，称为B液，搅拌条件下将A液逐滴加入到B液中，4℃振荡反应过夜，反应完成后离心，上清用PBS缓冲溶液透析6天，制得的检测抗原3-甲基喹噁啉-2-羧酸-鸡卵清白蛋白偶联物冻干保存；

所述金标垫上灌注有胶体金标记的抗喹乙醇代谢物特异性单克隆抗体，其中抗喹乙醇代谢物特异性单克隆抗体由3-甲基喹噁啉-2-羧酸-牛血清白蛋白偶联物免疫Balb/C小鼠制备而来。

2.根据权利要求1所述的喹乙醇代谢物免疫层析试纸卡，其特征在于：所述的样品垫、金标垫和吸水垫上方覆盖有胶膜保护层。

3.一种权利要求1所述的喹乙醇代谢物免疫层析试纸卡的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）样品垫的制备：将玻璃纤维棉用含有质量浓度为2%的BSA、质量浓度为1%的蔗糖、质量浓度为0.5%的硼酸钠和质量浓度为0.1%的NaN₃的PBS缓冲液处理后，干燥备用，即为样品垫；

（2）金标垫的制备：将玻璃纤维棉裁成4mm宽的细条，放入含有质量浓度为5%的BSA、质量浓度为2%的蔗糖、质量浓度为0.8%的NaCl和质量浓度为0.05%的NaN₃的PBS缓冲液中20min，37℃恒温烘干，然后将胶体金标记的抗喹乙醇代谢物特异性单克隆抗体灌注已处理好的玻璃纤维棉上，真空冻干4h，即为金标抗体结合垫；

（3）检测垫的制备：将硝酸纤维素膜置于X-only单向喷点仪平台上，3-甲基喹噁啉-2-羧酸-鸡卵清白蛋白偶联物溶液放于A池，羊抗鼠IgG溶液放于B池，展平压紧，开机后将检测抗原和二抗分别点射喷涂于硝酸纤维素膜上，形成检测线和质控线，室温自然干燥后，将其浸入BSA质量浓度为1%的PBS缓冲液，pH值为7.4的封闭液中30min，37℃烘干后，加入干燥剂，4℃密封保存；

（4）吸水垫的制备：将以植物长纤维为原材料制作的纯白滤纸用切割机切成4mm宽的细条，并用胶膜进行一侧封闭，干燥备用，即为吸水垫；

（5）喹乙醇代谢物免疫层析试纸卡的制备：首先将制备的样品垫、金标垫、检测垫和吸水垫依次附着于支撑层上，由左到右交叠连接，叠压宽度2mm，然后用切割机制成宽4mm，长60mm的试纸条，封装于带有加样孔和观察窗的塑料卡壳内，即制得喹乙醇代谢物免疫层析试纸卡。

4.根据权利要求3所述的喹乙醇代谢物免疫层析试纸卡的制备方法，其特征在于：所述的检测线上喷涂的检测抗原是3-甲基喹噁啉-2-羧酸-鸡卵清白蛋白偶联物溶液，其制备方法为：在N,N-二环已基碳二亚胺活化和催化下，喹乙醇代谢物3-甲基喹噁啉-2-羧酸半抗原与N-羟基琥珀酰亚胺发生酯化反应，反应产物再与鸡卵清白蛋白偶联，即制得检测抗原。

5.根据权利要求3所述的喹乙醇代谢物免疫层析试纸卡的制备方法，其特征在于：所述的金标垫上标记的抗体是抗喹乙醇代谢物特异性单克隆抗体，其制备方法为：（1）人工抗原合成：采用活泼酯法将喹乙醇代谢物3-甲基喹噁啉-2-羧酸和载体蛋白偶联，制得免疫原和包被原；（2）动物免疫：以雌性Balb/C小鼠作为免疫动物，背皮下多点注射法免疫5-6次；（3）细胞融合：在聚乙二醇1500的作用下，将免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤NS0细胞进行融合；（4）杂交瘤细胞株筛选：用间接ELISA和间接竞争ELISA筛选强阳性、抑制率高、生长状态好的杂交瘤细胞株；（5）细胞亚克隆：采用有限稀释法将阳性孔细胞株进行亚克隆，制得纯化的单克隆源杂交瘤细胞；（6）单抗制备：体内诱生腹水法制备抗喹乙醇代谢物单克隆抗体，饱和硫酸胺法纯化抗体后，进行胶体金标记。