CN104569399A - 一种检测赭曲霉毒素a的试纸条及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测赭曲霉毒素A的试纸条及其应用。试纸条包括样品吸收垫（1）、结合物释放垫（2）、反应膜（3）、吸水垫（4）和底板（7），所述反应膜上具有包被有赭曲霉毒素A半抗原-载体蛋白偶联物的检测线（5）和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线（6），所述结合物释放垫（2）喷涂有赭曲霉毒素A单克隆抗体-胶体金标记物。本发明还提供了一种应用上述赭曲霉毒素A试纸条检测谷物及饲料中赭曲霉毒素A残留的方法。本发明所提供的试纸条具有操作简单、灵敏度高、检测速度快、成本低等特点，适合大量样本的筛查和现场监控。

Description

一种检测赭曲霉毒素A的试纸条及其应用

技术领域

本发明涉及一种检测赭曲霉毒素A的试纸条及其应用，具体涉及一种用于检测赭曲霉毒素A的胶体金试纸条，其特别适用于黄豆、玉米等谷物及饲料（原料、配合料、浓缩料）中赭曲霉毒素A残留的检测。

背景技术

赭曲霉毒素A是由多种生长在粮食（小麦、玉米、大麦、燕麦、黑麦、大米和黍类等）、花生、蔬菜（豆类）等农作物上的曲霉和青霉产生的。动物摄入了霉变的饲料后，这种毒素也可能出现在猪和母鸡等的肉中。赭曲霉毒素A主要侵害动物肝脏与肾脏。这种毒素主要是引起肾脏损伤，大量的毒素也可能引起动物的肠黏膜炎症和坏死。OA产生菌广泛分布于自然界，对人类健康和畜牧业发展构成潜在威胁。我国对配合饲料和玉米中OA的允许量为≤100μg/kg，谷类和豆类的限量≤5μg/kg。

目前检测粮食和饲料中OA的仪器方法有液相色谱、气相色谱、质谱和毛细管电泳法等，这些方法灵敏度较高，结果稳定，但所需仪器设备昂贵，样品准备耗时长，不适于大量样品的现场筛选，限制了其应用。因此，针对现有赭曲霉毒素A检测技术上的不足，我们设计了一种用胶体金免疫层析技术检测黄豆、玉米等谷物及饲料（原料、配合料、浓缩料）赭曲霉毒素A的方法，该方法特异性好、灵敏度高、操作简便、检测成本低、适合于批量样品的筛选检测，是理想的快速筛选手段，能够更好地满足我国食品企业、政府职能监管部门等开展检测工作。

发明内容

本发明的目的是提供一种灵敏度高、操作简单、成本低、检测时间短的赭曲霉毒素A残留检测试纸条。

本发明所提供的检测赭曲霉毒素A残留的试纸条，包括样品吸收垫（1）、结合物释放垫（2）、反应膜（3）、吸水垫（4）和底板（7）；所述反应膜上具有包被有赭曲霉毒素A半抗原-载体蛋白偶联物的检测线（5）和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线（6），所述结合物释放垫（2）喷涂有赭曲霉毒素A单克隆抗体-胶体金标记物。

所述赭曲霉毒素A半抗原-载体蛋白偶联物是由赭曲霉毒素A半抗原与载体蛋白偶联得到，所述载体蛋白可为牛血清白蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白、甲状腺蛋白、人血清白蛋白。

所述赭曲霉毒素A单克隆抗体是以赭曲霉毒素A半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得，是由赭曲霉毒素A单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌获得；所述羊抗鼠抗抗体是将鼠源抗体免疫羊得到。

所述样品吸收垫（1）、结合物释放垫（2）、反应膜（3）、吸水垫（4）依次粘贴在底板（7）上，所述结合物释放垫1/3～1/2被覆盖于样品吸收垫下。

所述底板可为PVC底板或其他硬质不吸水的材料；所述样品吸收垫可为吸滤纸或滤油纸；所述结合物释放垫可为玻璃棉或聚酯材料；所述吸水垫为吸水纸；所述反应膜可为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜。

本发明的另一个目的是提供一种制备上述试纸条的方法，其包括步骤：

1）制备喷涂有赭曲霉毒素A单克隆抗体-胶体金标记物的结合物释放垫；

2）制备具有包被有赭曲霉毒素A半抗原-载体蛋白偶联物的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线的反应膜；

3）将1）和2）制备好的结合物释放垫、反应膜与样品吸收垫、吸水垫和底板组装成试纸条。

具体地说，步骤包括：

1）半抗原制备：将赭曲霉毒素A与对苯二胺反应得到赭曲霉毒素A半抗原；

2）将赭曲霉毒素A半抗原与载体蛋白偶联，得到赭曲霉毒素A半抗原-载体蛋白偶联物；

3）用赭曲霉毒素A半抗原-载体蛋白偶联物免疫小鼠，将小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞通过融合、筛选，得到赭曲霉毒素A单克隆杂交瘤细胞株；

4）提取小鼠IgG免疫健康山羊，得到羊抗鼠抗抗体；

5）用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金；

6）将步骤3）制备的赭曲霉毒素A单克隆抗体加入步骤5）制备的胶体金中，得到赭曲霉毒素A单克隆抗体-胶体金标记物；

7）将赭曲霉毒素A单克隆抗体-胶体金标记物喷涂在结合物释放垫上，37℃烘1h后取出，置于干燥环境中保存备用；

8）将赭曲霉毒素A半抗原-载体蛋白偶联物包被在反应膜上构成检测线，将羊抗鼠抗抗体包被在反应膜上构成质控线；

9）将样品吸收垫用含0.5%牛血清白蛋白（体积分数）、pH为7.2、0.1mol/L磷酸盐缓冲液浸泡2h，37℃下烘干2h；

10）在底板上按顺序粘贴上样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫，样品吸收垫盖住结合物释放垫，最后切成3mm宽的小条，加塑料盒，真空包装，4～30℃条件下可保存12个月。

本发明的另一个目的是提供一种应用上述试纸条检测黄豆、玉米等谷物及饲料（原料、配合料、浓缩料）中赭曲霉毒素A残留的方法，它包括步骤：

（1）样品前处理；

（2）用试纸条进行检测；

（3）分析检测结果。

本发明的赭曲霉毒素A快速检测试纸条采用高度特异性的抗体抗原反应及免疫层析分析技术，将赭曲霉毒素A单克隆抗体-胶体金标记物固定于结合物释放垫上，样品中的赭曲霉毒素A在流动过程中，与结合物释放垫上的赭曲霉毒素A单克隆抗体-胶体金标记物结合，形成药物-抗体-胶体金标记物。样本中的药物与反应膜检测线上的赭曲霉毒素A半抗原-载体蛋白偶联物竞争结合赭曲霉毒素A单克隆抗体-胶体金标记物，根据检测线红色条带有无或颜色深浅来判断待测样品液中是否含有赭曲霉毒素A残留。

检测时，样品经处理后滴入试纸条卡孔内，当赭曲霉毒素A在样品中的浓度低于检测限或为零时，单克隆抗体-胶体金标记物在层析过程中会与固定在反应膜上的赭曲霉毒素A半抗原-载体蛋白偶联物结合，在检测线（T）和质控线（C）内各出现一条红色条带；如果赭曲霉毒素A在样品中的浓度等于或高于检测限，单克隆抗体-胶体金标记物会与赭曲霉毒素A全部结合，从而在T线处因为竞争反应不会与赭曲霉毒素A半抗原-载体蛋白偶联物结合而不出现红色条带。如图2所示。

阴性：当质控线（C）显示出红色条带，检测线（T）同时也显示出红色条带，判为阴性。

阳性：当质控线（C）显示出红色条带，而检测线（T）不显色，判为阳性。

无效：当质控线（C）不显示出红色条带，则无论检测线（T）显示出红色条带与否，该试纸条均判为无效。

本发明的试纸条具有灵敏度高、特异性强、成本低、操作简单、检测时间短、适合各种单位使用、储存简单、保质期长的优点。用本发明试纸条检测赭曲霉毒素A残留的方法简便、快速、直观、准确、适用范围广、成本低、易推广使用。

附图说明

图1为试纸条剖面结构示意图。

图2为试纸条检测结果判定图。

图3为赭曲霉毒素A半抗原合成图。

图4为赭曲霉毒素A半抗原核磁共振氢谱图。

具体实施方式

下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用来限制本发明的范围。

实施例1赭曲霉毒素A检测试纸条的制备

该试纸条的制备方法主要包括以下步骤：

1）制备喷涂有赭曲霉毒素A单克隆抗体-胶体金标记物的结合物释放垫；

2）制备具有包被有赭曲霉毒素A半抗原-载体蛋白偶联物的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线的反应膜；

3）将1）和2）制备好的结合物释放垫、反应膜与样品吸收垫、吸水垫和PVC底板组装成试纸条。

下面分步详细叙述：

1、赭曲霉毒素A半抗原的制备

40mg赭曲霉毒素，30mg对苯二胺及少量DMAP加入5ml干燥的DMF中，0℃下缓慢滴加40mg DCC在1ml干燥的DMF中的混合液，滴加完毕后自然升温至室温，继续反应20h。蒸除溶剂，柱层析纯化后得到赭曲霉毒素与对苯二胺的单缩合物，得率50%。合成路线如图3。

取上述产物经核磁共振氢谱测定，如图4所示，6.2和7.4ppm处增加的两组芳环信号峰，9.7ppm左右增加的酰胺信号峰说明半抗原合成成功。

2、免疫原的制备

取9mg半抗原，溶解于1ml DMF中；取戊二醛水溶液0.1ml加入半抗原溶液中，室温下搅拌24h，即可得到反应液A；称取BSA30mg，使之充分溶解在2.7ml0.1mol/L CB（pH9.6）中，将反应液A逐滴缓慢滴加到蛋白溶液中，并于室温下搅拌24h，用5M的硼氢化钠水溶液0.2ml还原反应4小时，用0.01mol/L PBS4℃透析3d，每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质，得到免疫原。

3、包被原的制备

取9mg半抗原，溶解于1ml DMF中；取戊二醛水溶液0.1ml加入半抗原溶液中，室温下搅拌24h，即可得到反应液A；称取OVA30mg，使之充分溶解在2.7ml0.1mol/L CB（pH9.6）中，将反应液A逐滴缓慢滴加到蛋白溶液中，并于室温下搅拌24h，用5M的硼氢化钠水溶液0.2ml还原反应4小时，用0.01mol/L PBS4℃透析3d，每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质，得到包被原。

4、赭曲霉毒素A单克隆抗体的制备

（1）动物免疫

将步骤2得到的免疫原注入Balb/c小鼠体内，免疫剂量为150μg/只，使其产生抗血清。

（2）细胞融合和克隆化

取免疫Balb/c小鼠脾细胞，按8:1（数量配比）比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA法测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

（3）细胞冻存和复苏

将杂交瘤细胞用冻存液制成1×10⁶个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。

（4）单克隆抗体的制备与纯化

增量培养法：将杂交瘤细胞置于细胞培养基中，在37℃条件下进行培养，用辛酸-饱和硫酸铵法将得到的培养液进行纯化，得到单克隆抗体，-20℃保存。

所述细胞培养基为向RPMI1640培养基中添加小牛血清和碳酸氢钠，使小牛血清在细胞培养基中的终浓度为20%（质量分数），碳酸氢钠在细胞培养基中的终浓度为0.2%（质量分数）；所述细胞培养基的pH为7.4。

5、羊抗鼠抗抗体的制备

以羊作为免疫动物，以鼠源抗体为免疫原对无病原体羊进行免疫，得到羊抗鼠抗抗体。

6、赭曲霉毒素A单克隆抗体-胶体金标记物的制备

（1）胶体金的制备

用双蒸去离子水将1%氯金酸稀释成0.01%（质量分数），取100ml置于锥形瓶中，用恒温电磁搅拌器加热至沸腾，在持续高温、持续搅拌下加入2.5ml1%柠檬酸三钠，继续匀速搅拌加热至溶液呈透亮的红色时停止，冷却至室温后用去离子水恢复到原体积，4℃保存。制备好的胶体金外观纯净、透亮、无沉淀和漂浮物。

（2）赭曲霉毒素A单克隆抗体-胶体金标记物的制备

在磁力搅拌下，用0.2mol/L碳酸钾溶液调胶体金的pH值至7.0，按每毫升胶体金溶液中加入20～50μg的标准向胶体金溶液中加入赭曲霉毒素A单克隆抗体，继续搅拌混匀30min，加入10%BSA，使其在胶体金溶液中的终浓度为1%（体积分数），静置10min。12000r/min、4℃离心40min，弃上清液，沉淀用复溶缓冲液洗涤两次，用体积为初始胶体金体积1/10的复溶缓冲液将沉淀重悬，置4℃备用。

复溶缓冲液：含酪蛋白0.02%～0.1%（质量分数）、吐温-80 0.05%～0.2%（质量分数）、pH7.2的0.02mol/L磷酸盐缓冲液。

7、结合物释放垫的制备

将结合物释放垫浸泡于含有牛血清白蛋白（牛血清白蛋白在缓冲液中的浓度为0.5%）、pH为7.2、0.5mol/L的磷酸盐缓冲液中，均匀浸湿1h，37℃烘3h备用。用Isoflow喷膜仪将制备好的赭曲霉毒素A单克隆抗体-胶体金标记物均匀喷涂在结合物释放垫上，每1cm结合物释放垫喷涂0.01ml赭曲霉毒素A单克隆抗体-胶体金标记物后，置于37℃环境中（湿度＜20%）60min后取出，置于干燥环境（湿度＜20%）中保存备用。

8、反应膜的制备

将赭曲霉毒素A半抗原-卵清蛋白偶联物包被到反应膜上构成检测线，将羊抗鼠抗抗体包被在反应膜上构成质控线。

包被过程：用磷酸缓冲液将赭曲霉毒素A半抗原-卵清蛋白偶联物稀释到10mg/ml，用Isoflow点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的检测线（T线），包被量为0.8μl/cm；用0.01mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液将羊抗鼠抗抗体稀释到200μg/ml，用Isoflow点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的质控线（C线），包被量为1.0μl/cm。将包被好的反应膜置于37℃条件下干燥2h，备用。

9、样品吸收垫的制备

将样品吸收垫置于含0.5%牛血清白蛋白（体积分数）、pH7.2、0.1mol/L磷酸盐缓冲液中浸泡2h，37℃烘2h备用。

10、试纸条的组装

将样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫依次按顺序粘贴在PVC底板上；结合物释放垫从起始端有1/3区域被样品吸收垫覆盖，结合物释放垫的末端与反应膜的始端连接，反应膜的末端与吸水垫的始端相连，样品吸收垫的始端与PVC底板的始端对齐，吸水垫的末端与PVC底板的末端对齐；所述反应膜上有检测线和质控线，检测线（T线）和质控线（C线）均为与所述试纸条的长相垂直的条状带；检测线位于靠近结合物释放垫的末端的一侧；质控线位于远离结合物释放垫的末端的一侧；将试纸条用机器切成3mm宽的小条，装在特制的塑料制卡中，4～30℃条件下可保存12个月。

实施例2样品中赭曲霉毒素A残留的检测

1、样品的前处理

称取3.0±0.05g粉碎的饲料样品至15ml或50ml聚苯乙烯离心管中；加入6ml乙腈，将瓶塞盖紧，振荡5min；室温（20-25℃），3000g以上离心5min；移取1ml上清液到玻璃离心管中，于50～60℃水浴氮气流下吹干；加入0.4ml样品复溶液，涡动30s，待检。

2、用试纸条进行检测

用吸管吸取待检样品溶液垂直滴加3滴于加样孔，液体流动时开始计时，反应5～10min，判定结果。

3、分析检测结果

阴性（-）：T线和C线都显色，表示样品中赭曲霉毒素A浓度低于检测限，如图2（a）。

阳性（+）：T线无显色C线显色，表示样品中赭曲霉毒素A浓度等于或高于检测限，如图2（b）。

无效：未出现C线，表明不正确的操作过程或试纸条已变质失效，如图2（c）。在此情况下，应再次仔细阅读说明书，并用新的试纸条重新测试。

实施例3样品检测实例

1、检测限试验

取空白谷物及饲料样本，在其中分别添加赭曲霉毒素A至终浓度为50、100、200ng/ml，取试纸条进行检测，每个样本重复测定三次。

用试纸条检测谷物及饲料样本时，当其中赭曲霉毒素A添加浓度为50ng/ml时，试纸条上显示出肉眼可见的两条红色线条，呈阴性；当其中赭曲霉毒素A添加浓度为100、200ng/ml时，试纸条质控线显色，检测线不显色，呈阳性，表明本试纸条对谷物及饲料中赭曲霉毒素A的检测限为100ng/ml。

2、假阳性率、假阴性率试验

取已知赭曲霉毒素A含量大于100ng/ml的谷物及饲料阳性样本各20份和含量小于100ng/ml的谷物及饲料阴性样本各20份，用三批试纸条进行检测，计算其阴阳性率。结果见表1-2。

表1检测谷物样本结果

表2检测饲料样本结果

结果表明：用3个批次生产的试纸条检测阳性谷物及饲料样本时，结果全为阳性，可知阳性样本符合率为100%，假阴性率为0；检测20份阴性谷物及饲料样本时，结果全为阴性，可知阴性符合率为100%，假阳性率为0。说明本发明的检测赭曲霉毒素A的试纸条可以对谷物及饲料中赭曲霉毒素A残留进行快速检测。

3、特异性试验

用赭曲霉毒素A试纸条检测100ug/ml玉米赤霉烯酮毒素、黄曲霉毒素B1、呕吐毒素等药物。结果显示，试纸条质控线和检测线均显色，呈阴性。说明本试纸条对100ug/ml玉米赤霉烯酮毒素、黄曲霉毒素B1、呕吐毒素等药物无交叉反应。

Claims (8)

1.一种检测赭曲霉毒素A的试纸条，包括样品吸收垫（1）、结合物释放垫（2）、反应膜（3）、吸水垫（4）和底板（7），其特征在于所述反应膜上具有包被有赭曲霉毒素A半抗原-载体蛋白偶联物的检测线（5）和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线（6），所述结合物释放垫（2）喷涂有赭曲霉毒素A单克隆抗体-胶体金标记物。

2.如权利要求1所述的试纸条，其特征在于所述样品吸收垫（1）、结合物释放垫（2）、反应膜（3）、吸水垫（4）依次粘贴在底板（7）上。

3.如权利要求1-2任一项所述的试纸条，其特征在于所述结合物释放垫1/3～1/2被覆盖于样品吸收垫下。

4.如权利要求1所述的试纸条，其特征在于所述赭曲霉毒素A半抗原-载体蛋白偶联物由赭曲霉毒素A半抗原与载体蛋白偶联得到，所述载体蛋白可为牛血清白蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白、甲状腺蛋白、人血清白蛋白。

5.如权利要求1或4任一项所述的试纸条，其特征在于所述赭曲霉毒素A半抗原是由赭曲霉毒素A与对苯二胺反应得到，其分子结构式为：

6.如权利要求1所述的试纸条，其特征在于所述赭曲霉毒素A单克隆抗体是以赭曲霉毒素A半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得，所述羊抗鼠抗抗体是将鼠源抗体免疫羊得到。

7.一种制备权利要求1-6任一项所述试纸条的方法，其包括步骤：

1）制备喷涂有赭曲霉毒素A单克隆抗体-胶体金标记物的结合物释放垫；

2）制备具有包被有赭曲霉毒素A半抗原-载体蛋白偶联物的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线的反应膜；

3）将1）和2）制备好的结合物释放垫、反应膜与样品吸收垫、吸水垫和底板组装成试纸条。

8.一种检测谷物及饲料中赭曲霉毒素A残留的方法，其包括步骤：

1）样本前处理；

2）用权利要求1-6任一项所述的试纸条进行检测；

3）分析检测结果。