CN103940999B

CN103940999B - 一种检测倍他米松的试纸条及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN103940999B
Application number: CN201310020352.9A
Authority: CN
Inventors: 何方洋; 万宇平; 罗晓琴; 吴鹏; 付军权; 蒲小容; 冯静; 彭鸽
Original assignee: Beijing Kwinbon Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Beijing Kwinbon Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2013-01-19
Filing date: 2013-01-19
Publication date: 2016-06-01
Anticipated expiration: 2033-01-19
Also published as: CN103940999A

Abstract

本发明公开了一种检测倍他米松的试纸条及其应用。试纸条包括样品吸收垫（1）、结合物释放垫（2）、反应膜（3）、吸水垫（4）和底板（7），所述反应膜上具有包被有倍他米松半抗原-载体蛋白偶联物的检测线（5）和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线（6），所述结合物释放垫（2）喷涂有倍他米松单克隆抗体-胶体金标记物。本发明还提供了一种应用上述倍他米松试纸条检测化妆品中倍他米松残留的方法。本发明所提供的试纸条具有操作简单、灵敏度高、检测速度快、成本低等特点，适合大量样本的筛查和现场监控。

Description

一种检测倍他米松的试纸条及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种检测倍他米松的试纸条及其应用，具体涉及一种用于检测倍他米松的胶体金试纸条，其特别适用于化妆品中倍他米松残留的检测。

背景技术

倍他米松属于肾上腺皮质激素类药物，具有抗菌、消炎的作用。由于其具有广谱高效的杀菌作用，常被添加到祛痘类产品中以达到消炎、祛痘、除螨及抗粉刺的目的。但这种药物的不良反应较多，有滁钠作用，对生长的抑制作用较强；还能引起皮质炎固醇激素引起的各种不良反应，如肌肉骨骼、胃肠道、皮肤、神经系统、内分泌系统的异常和水电解质紊乱等。鉴于以上这些不良反应，长期使用添加有倍他米松的化妆品或皮肤性接触此种药物可严重影响人体健康，因此，我国卫生部颁布的2007年版《化妆品卫生规范》中规定，化妆品中不得添加倍他米松。

目前关于倍他米松检测的文献报道大都是针对倍他米松原料和药品，也有关于动物组织中倍他米松检测的研究，主要有旋光法、分光光度法、高效液相色谱法和液相色谱-串联质谱法等。旋光法影响因素较多，需要标准对照品和样品的量较多，不适宜微量分析；分光光度法操作繁琐，样品处理过程中损失较多，且检出限较高，重复性较差；高效液相色谱法和液相色谱-串联质谱法灵敏、准确，特异性强、分离度好，可以同时测定多种药物，但需要昂贵的仪器、样品的前处理复杂、繁琐费时、检测的成本较高，不能现场操作，而且需专业人员操作，所以限制了其应用。因此，针对现有倍他米松检测技术上的不足，我们设计了一种用胶体金免疫层析技术检测化妆品中倍他米松的方法，该方法特异性好、灵敏度高、操作简便、检测成本低、适合于批量样品的筛选检测，是理想的快速筛选手段，能够更好地满足我国化妆品企业、政府职能监管部门等开展检测工作。

发明内容

本发明的目的是提供一种灵敏度高、操作简单、成本低、检测时间短的倍他米松残留检测试纸条。

本发明所提供的检测倍他米松残留的试纸条，包括样品吸收垫（1）、结合物释放垫（2）、反应膜（3）、吸水垫（4）和底板（7）；所述反应膜上具有包被有倍他米松半抗原-载体蛋白偶联物的检测线（5）和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线（6），所述结合物释放垫（2）喷涂有倍他米松单克隆抗体-胶体金标记物。

所述倍他米松半抗原-载体蛋白偶联物是由倍他米松半抗原与载体蛋白偶联得到，所述载体蛋白可为牛血清白蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白、甲状腺蛋白、人血清白蛋白。

所述倍他米松单克隆抗体是以倍他米松半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得，是由倍他米松单克隆抗体杂交瘤细胞株E-3-1CGMCCNo.6501分泌获得；所述羊抗鼠抗抗体是将鼠源抗体免疫羊得到。

所述样品吸收垫（1）、结合物释放垫（2）、反应膜（3）、吸水垫（4）依次粘贴在底板（7）上，所述结合物释放垫1/3~1/2被覆盖于样品吸收垫下。

所述底板可为PVC底板或其他硬质不吸水的材料；所述样品吸收垫可为吸滤纸或滤油纸；所述结合物释放垫可为玻璃棉或聚酯材料；所述吸水垫为吸水纸；所述反应膜可为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜。

本发明的另一个目的是提供一种制备上述试纸条的方法，其包括步骤：

1）制备喷涂有倍他米松单克隆抗体-胶体金标记物的结合物释放垫；

2）制备具有包被有倍他米松半抗原-载体蛋白偶联物的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线的反应膜；

3）将1）和2）制备好的结合物释放垫、反应膜与样品吸收垫、吸水垫和底板组装成试纸条。

具体地说，步骤包括：

1）半抗原制备：将倍他米松与丙二胺反应得到倍他米松半抗原；

2）将倍他米松半抗原与载体蛋白偶联，得到倍他米松半抗原-载体蛋白偶联物；

3）用倍他米松半抗原-载体蛋白偶联物免疫小鼠，将小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞通过融合、筛选，得到倍他米松单克隆杂交瘤细胞株；

4）提取小鼠IgG免疫健康山羊，得到羊抗鼠抗抗体；

5）用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金；

6）将步骤3）制备的倍他米松单克隆抗体加入步骤5）制备的胶体金中，得到倍他米松单克隆抗体-胶体金标记物；

7）将倍他米松单克隆抗体-胶体金标记物喷涂在结合物释放垫上，37℃烘1h后取出，置于干燥环境中保存备用；

8）将倍他米松半抗原-载体蛋白偶联物包被在反应膜上构成检测线，将羊抗鼠抗抗体包被在反应膜上构成质控线；

9）将样品吸收垫用含0.5%牛血清白蛋白（体积分数）、pH为7.2、0.1mol/L磷酸盐缓冲液浸泡2h，37℃下烘干2h；

10）在底板上按顺序粘贴上样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫，样品吸收垫盖住结合物释放垫，最后切成3mm宽的小条，加塑料盒，真空包装，4~30℃条件下可保存12个月。

本发明的另一个目的是提供一种应用上述试纸条检测化妆品中倍他米松残留的方法，它包括步骤：

（1）样品前处理；

（2）用试纸条进行检测；

（3）分析检测结果。

本发明的倍他米松快速检测试纸条采用高度特异性的抗体抗原反应及免疫层析分析技术，将倍他米松单克隆抗体-胶体金标记物固定于结合物释放垫上，样品中的倍他米松在流动过程中，与结合物释放垫上的倍他米松单克隆抗体-胶体金标记物结合，形成药物-抗体-胶体金标记物。样本中的药物与反应膜检测线上的倍他米松半抗原-载体蛋白偶联物竞争结合倍他米松单克隆抗体-胶体金标记物，根据检测线红色条带有无或颜色深浅来判断待测样品液中是否含有倍他米松残留。

检测时，样品经处理后滴入试纸条卡孔内，当倍他米松在样品中的浓度低于检测限或为零时，单克隆抗体-胶体金标记物在层析过程中会与固定在反应膜上的倍他米松半抗原-载体蛋白偶联物结合，在检测线（T）和质控线（C）内各出现一条红色条带；如果倍他米松在样品中的浓度等于或高于检测限，单克隆抗体-胶体金标记物会与倍他米松全部结合，从而在T线处因为竞争反应不会与倍他米松半抗原-载体蛋白偶联物结合而不出现红色条带。如图2所示。

阴性：当质控线（C）显示出红色条带，检测线（T）同时也显示出红色条带，判为阴性。

阳性：当质控线（C）显示出红色条带，而检测线（T）不显色，判为阳性。

无效：当质控线（C）不显示出红色条带，则无论检测线（T）显示出红色条带与否，该试纸条均判为无效。

本发明的试纸条具有灵敏度高、特异性强、成本低、操作简单、检测时间短、适合各种单位使用、储存简单、保质期长的优点。用本发明试纸条检测倍他米松残留的方法简便、快速、直观、准确、适用范围广、成本低、易推广使用。

附图说明

图1为试纸条剖面结构示意图。

图2为试纸条检测结果判定图。

图3为倍他米松半抗原合成图。

图4为倍他米松半抗原核磁共振氢谱图。

具体实施方式

下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用来限制本发明的范围。

实施例1倍他米松检测试纸条的制备

该试纸条的制备方法主要包括以下步骤：

3）将1）和2）制备好的结合物释放垫、反应膜与样品吸收垫、吸水垫和PVC底板组装成试纸条。

下面分步详细叙述：

1、倍他米松半抗原的制备

将0.39g倍他米松溶解在10ml吡啶中，室温下缓慢滴加入0.3ml1,3-丙二胺，滴加完毕后，升温至60℃，继续反应20h，旋蒸除去吡啶和未反应的丙二胺，在正己烷-乙酸乙酯体系中重结晶得到白色结晶，即为目标半抗原倍他米松-3-氨丙基烯胺，合成路线如图3。

取上述产物经核磁共振氢谱测定，如图4所示，1.0-2.7ppm间增加的3组峰为丙二胺片段上的烷基信号峰，说明目标半抗原合成成功。

2、免疫原的制备

取半抗原15mg用2.2ml二甲基甲酰胺（DMF）溶解完全，制成溶液Ⅰ；取牛血清白蛋白（BSA）70mg用6.8ml0.1mol/LPBS（pH7.0）溶解完全，制成溶液Ⅱ；将溶液Ⅰ加入溶液Ⅱ中，制成溶液Ⅲ；取碳化二亚胺（EDC）100mg用1ml水溶解后加入溶液Ⅲ中，室温反应24h；用0.01mol/LPBS透析三天，每天换液三次，得到免疫原。

3、包被原的制备

取半抗原15mg用2.2mlDMF溶解完全，制成溶液Ⅰ；取卵清蛋白（OVA）70mg用6.8ml0.1mol/LPBS（pH7.0）溶解完全，制成溶液Ⅱ；将溶液Ⅰ加入溶液Ⅱ中，制成溶液Ⅲ；取EDC100mg用1ml水溶解后加入溶液Ⅲ中，室温反应24h；用0.01mol/LPBS透析三天，每天换液三次，得到包被原。

4、倍他米松单克隆抗体的制备

（1）动物免疫

将步骤2得到的免疫原注入Balb/c小鼠体内，免疫剂量为150μg/只，使其产生抗血清。

（2）细胞融合和克隆化

取免疫Balb/c小鼠脾细胞，按8:1（数量配比）比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA法测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，并意外发现，其中一株效价显著高于其它杂交瘤细胞株，将该倍他米松单克隆抗体杂交瘤细胞株命名为E-3-1，该细胞株已于2012年8月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所），保藏号为CGMCCNo.6501。

（3）细胞冻存和复苏

将杂交瘤细胞用冻存液制成1×10⁶个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。

（4）单克隆抗体的制备与纯化

增量培养法：将杂交瘤细胞置于细胞培养基中，在37℃条件下进行培养，用辛酸-饱和硫酸铵法将得到的培养液进行纯化，得到单克隆抗体，-20℃保存。

所述细胞培养基为向RPMI1640培养基中添加小牛血清和碳酸氢钠，使小牛血清在细胞培养基中的终浓度为20%（质量分数），碳酸氢钠在细胞培养基中的终浓度为0.2%（质量分数）；所述细胞培养基的pH为7.4。

5、羊抗鼠抗抗体的制备

以羊作为免疫动物，以鼠源抗体为免疫原对无病原体羊进行免疫，得到羊抗鼠抗抗体。

6、倍他米松单克隆抗体-胶体金标记物的制备

（1）胶体金的制备

用双蒸去离子水将1%氯金酸稀释成0.01%（质量分数），取100ml置于锥形瓶中，用恒温电磁搅拌器加热至沸腾，在持续高温、持续搅拌下加入2.5ml1%柠檬酸三钠，继续匀速搅拌加热至溶液呈透亮的红色时停止，冷却至室温后用去离子水恢复到原体积，4℃保存。制备好的胶体金外观纯净、透亮、无沉淀和漂浮物。

（2）倍他米松单克隆抗体-胶体金标记物的制备

在磁力搅拌下，用0.2mol/L碳酸钾溶液调胶体金的pH值至7.0，按每毫升胶体金溶液中加入20~50μg的标准向胶体金溶液中加入倍他米松单克隆抗体，继续搅拌混匀30min，加入10%BSA，使其在胶体金溶液中的终浓度为1%（体积分数），静置10min。12000r/min、4℃离心40min，弃上清液，沉淀用复溶缓冲液洗涤两次，用体积为初始胶体金体积1/10的复溶缓冲液将沉淀重悬，置4℃备用。

复溶缓冲液：含酪蛋白0.02%~0.1%（质量分数）、吐温-800.05%~0.2%（质量分数）、pH7.2的0.02mol/L磷酸盐缓冲液。

7、结合物释放垫的制备

将结合物释放垫浸泡于含有牛血清白蛋白（牛血清白蛋白在缓冲液中的浓度为0.5%）、pH为7.2、0.5mol/L的磷酸盐缓冲液中，均匀浸湿1h，37℃烘3h备用。用Isoflow喷膜仪将制备好的倍他米松单克隆抗体-胶体金标记物均匀喷涂在结合物释放垫上，每1cm结合物释放垫喷涂0.01ml倍他米松单克隆抗体-胶体金标记物后，置于37℃环境中（湿度＜20%）60min后取出，置于干燥环境（湿度＜20%）中保存备用。

8、反应膜的制备

将倍他米松半抗原-卵清蛋白偶联物包被到反应膜上构成检测线，将羊抗鼠抗抗体包被在反应膜上构成质控线。

包被过程：用磷酸缓冲液将倍他米松半抗原-卵清蛋白偶联物稀释到10mg/ml，用Isoflow点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的检测线（T线），包被量为0.8μl/cm；用0.01mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液将羊抗鼠抗抗体稀释到200μg/ml，用Isoflow点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的质控线（C线），包被量为1.0μl/cm。将包被好的反应膜置于37℃条件下干燥2h，备用。

9、样品吸收垫的制备

将样品吸收垫置于含0.5%牛血清白蛋白（体积分数）、pH7.2、0.1mol/L磷酸盐缓冲液中浸泡2h，37℃烘2h备用。

10、试纸条的组装

将样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫依次按顺序粘贴在PVC底板上；结合物释放垫从起始端有1/3区域被样品吸收垫覆盖，结合物释放垫的末端与反应膜的始端连接，反应膜的末端与吸水垫的始端相连，样品吸收垫的始端与PVC底板的始端对齐，吸水垫的末端与PVC底板的末端对齐；所述反应膜上有检测线和质控线，检测线（T线）和质控线（C线）均为与所述试纸条的长相垂直的条状带；检测线位于靠近结合物释放垫的末端的一侧；质控线位于远离结合物释放垫的末端的一侧；将试纸条用机器切成3mm宽的小条，装在特制的塑料制卡中，4~30℃条件下可保存12个月。

实施例2样品中倍他米松残留的检测

1、样品的前处理

称取0.1g±0.01g（霜状、乳液）或0.1ml（化妆水）样品于10ml离心管中，加入10ml0.02mol/L的磷酸盐缓冲溶液，涡动1min，待检。

2、用试纸条进行检测

用吸管吸取待检样品溶液垂直滴加2~3滴于加样孔，液体流动时开始计时，反应5~10min，判定结果。

3、分析检测结果

阴性（-）：T线和C线都显色，表示样品中倍他米松浓度低于检测限，如图2（a）。

阳性（+）：T线无显色C线显色，表示样品中倍他米松浓度等于或高于检测限，如图2（b）。

无效：未出现C线，表明不正确的操作过程或试纸条已变质失效，如图2（c）。在此情况下，应再次仔细阅读说明书，并用新的试纸条重新测试。

实施例3样品检测实例

1、检测限试验

取空白化妆品样本（霜、乳液或化妆水），在其中分别添加倍他米松至终浓度为0.5、1、2mg/kg(L)，取试纸条进行检测，每个样本重复测定三次。

用试纸条检测化妆品样本时，当其中倍他米松添加浓度为0.5mg/kg(L)时，试纸条上显示出肉眼可见的两条红色线条，呈阴性；当其中倍他米松添加浓度为1、2mg/kg(L)时，试纸条质控线显色，检测线不显色，呈阳性，表明本试纸条对化妆品中倍他米松的检测限为1mg/kg(L)。

2、假阳性率、假阴性率试验

取已知倍他米松含量大于1mg/kg(L)的化妆品阳性样本20份和含量小于1mg/kg(L)的化妆品阴性样本20份，用三批试纸条进行检测，计算其阴阳性率。结果见表1。

表1检测样本结果

结果表明：用3个批次生产的试纸条检测阳性化妆品样本时，结果全为阳性，可知阳性样本符合率为100%，假阴性率为0；检测20份阴性化妆品样本时，结果全为阴性，可知阴性符合率为100%，假阳性率为0。说明本发明的检测倍他米松的试纸条可以对化妆品中倍他米松残留进行快速检测。

3、特异性试验

将氢化泼尼松、泼尼松、地塞米松、氢化可的松、可的松、甲基氢化泼尼松用pH7.2、0.2mol/L的磷酸盐缓冲液稀释至100mg/L，用倍他米松试纸条进行检测。结果显示，用该试纸检测100mg/L氢化泼尼松、泼尼松、地塞米松时，试纸条质控线显色，检测线不显色，呈阳性；检测100mg/L氢化可的松、可的松、甲基氢化泼尼松时，试纸条质控线和检测线均显色，呈阴性。说明本试纸条对氢化泼尼松、泼尼松、地塞米松有一定的交叉反应，对氢化可的松、可的松、甲基氢化泼尼松无交叉反应。

Claims

1.一种检测倍他米松的试纸条，包括样品吸收垫(1)、结合物释放垫(2)、反应膜(3)、吸水垫(4)和底板(7)，其特征在于所述反应膜上具有包被有倍他米松半抗原-载体蛋白偶联物的检测线(5)和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线(6)，所述结合物释放垫(2)喷涂有倍他米松单克隆抗体-胶体金标记物；

其中，所述倍他米松半抗原-载体蛋白偶联物由倍他米松半抗原与载体蛋白偶联得到，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白、甲状腺蛋白或人血清白蛋白，所述倍他米松半抗原是由倍他米松与丙二胺反应得到，其分子结构式为：

2.如权利要求1所述的试纸条，其特征在于所述样品吸收垫(1)、结合物释放垫(2)、反应膜(3)、吸水垫(4)依次粘贴在底板(7)上。

3.如权利要求2所述的试纸条，其特征在于所述结合物释放垫1/3～1/2被覆盖于样品吸收垫下。

4.如权利要求1所述的试纸条，其特征在于所述倍他米松单克隆抗体-胶体金标记物中的倍他米松单克隆抗体是以倍他米松半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得，所述羊抗鼠抗抗体是将鼠源抗体免疫羊得到。

5.如权利要求4所述的试纸条，其特征在于所述倍他米松单克隆抗体是由倍他米松单克隆抗体杂交瘤细胞株E-3-1分泌获得，所述细胞株的保藏号为CGMCCNo.6501。

6.一种制备权利要求1-5任一项所述试纸条的方法，其包括步骤：

1)制备喷涂有倍他米松单克隆抗体-胶体金标记物的结合物释放垫；

2)制备具有包被有倍他米松半抗原-载体蛋白偶联物的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线的反应膜；

3)将1)和2)制备好的结合物释放垫、反应膜与样品吸收垫、吸水垫和底板组装成试纸条。

7.一种检测化妆品中倍他米松残留的方法，其包括步骤：

1)样本前处理；

2)用权利要求1-5任一项所述的试纸条进行检测；

3)分析检测结果。