CN104215763B - 一种检测t-2毒素的试纸条及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种检测T-2毒素的试纸条及其应用。该试纸条包括样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫和底板；其中，所述反应膜上具有包被有T-2毒素半抗原-载体蛋白偶联物的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线，所述结合物释放垫上喷涂有T-2毒素单克隆抗体-胶体金标记物。本发明还提供一种应用上述试纸条检测样品中T-2毒素的方法。本发明提供的试纸条和检测方法具有操作简单、灵敏度高、检测速度快、成本低、不受检测设备限制的优点，能够实现对大批量的T-2毒素样品进行快速检测和现场监控。<!--1-->

Description

一种检测T-2毒素的试纸条及其应用

技术领域

本发明涉及一种检测T-2毒素的试纸条及其应用，具体涉及一种用于检测T-2毒素的胶体金试纸条。

技术背景

T-2毒素（T-2toxin）是单端孢霉烯族毒素（Trichothecenes）之一，是一种倍半萜烯化合物，学名为4β-1,5-二乙酰氧基-8α-(3-甲基丁酰氧基)-3α-羧基-12,13-环氧单端孢霉-9-烯，分子式为C₂₄H₃₄O₉，分子量为466.22。T-2毒素作为一种常见的真菌毒素，可由多种真菌在湿冷的生长环境和潮湿的储存条件下产生，广泛存在于自然界中，污染玉米、小麦、燕麦、黑麦等谷物，以玉米污染最为常见。T-2毒素能抑制DNA、RNA和蛋白质的合成，干扰生物体能量代谢，可引起机体过氧化损伤，还具有致癌和致畸性，可能还与我国某些地区的大骨节病、食管癌和克山病的高发病率有关，对人类健康及畜牧业构成了较大危害，因此建立灵敏的粮食和饲料中的T-2毒素检测方法十分重要。粮农组织/世界卫生组织食品添加剂联合专家委员会（JACFA）规定的T-2毒素的每日最大耐受摄入量（PMTDI）为60ng/kg，以色列规定谷物饲料中T-2毒素不得超过100μg/kg，欧洲国家规定T-2毒素在谷物中的最高残留限量（MRL）为20~300μg/kg，我国规定猪配合饲料和禽配合饲料中T-2毒素的允许量为1mg/kg。

目前检测T-2毒素的方法主要有薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法、放射免疫法、酶联免疫法和色谱-质谱联用技术。上述方法各有优缺点，但主要存在的问题是对设备依赖性高，并且不能实现对大批量样品的快速检测，限制了这些方法的应用。因此，开发一种不受检测设备限制并且能够实现对大批量样品进行快速检测的产品和方法成为迫切需要解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于克服现有的检测T-2毒素的方法存在的对设备依赖性高，并且不能够实现对大批量样品的快速检测的特点，提供一种操作简单、灵敏度高、检测速度快、成本低、不受检测设备限制的试纸条，以实现对大批量的T-2毒素样品进行快速检测和现场监控。

为了实现本发明的目的，本发明提供了一种检测T-2毒素的试纸条，该试纸条包括样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫和底板；其中，所述反应膜上具有包被有T-2毒素半抗原-载体蛋白偶联物的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线，所述结合物释放垫上喷涂有T-2毒素单克隆抗体-胶体金标记物。

所述T-2毒素半抗原-载体蛋白偶联物是由T-2毒素半抗原与载体蛋白偶联得到，所述T-2毒素半抗原是由T-2毒素与对苯二甲酸反应得到，所述载体蛋白可为牛血清白蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白、甲状腺蛋白、人血清白蛋白。

所述T-2毒素单克隆抗体是以T-2毒素半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得，所述羊抗鼠抗抗体是以鼠源抗体为免疫原对山羊进行免疫制备获得。

所述样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫依次粘贴在底板上，所述结合物释放垫1/3~1/2被覆盖于样品吸收垫下。

所述底板可为PVC底板或其他硬质不吸水的材料；所述样品吸收垫可为吸滤纸或滤油纸；所述结合物释放垫可为玻璃棉或聚酯材料；所述吸水垫为吸水纸；所述反应膜可为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜。

本发明的另一个目的是提供一种制备上述试纸条的方法，该方法包括以下步骤：

1）制备喷涂有T-2毒素单克隆抗体-胶体金标记物的结合物释放垫；

2）制备具有包被有T-2毒素半抗原-载体蛋白偶联物的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线的反应膜；

3）将1）和2）制备好的结合物释放垫、反应膜与样品吸收垫、吸水垫和底板组装成试纸条。

具体地说，步骤包括：

1）将T-2毒素与对苯二甲酸反应，制备T-2毒素半抗原；

2）将T-2毒素半抗原与载体蛋白偶联，制备T-2毒素半抗原-载体蛋白偶联物；

3）用T-2毒素半抗原-载体蛋白偶联物免疫小鼠，将小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞通过融合、筛选，得到分泌T-2毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株；

4）提取小鼠IgG免疫健康山羊，得到羊抗鼠抗抗体；

5）分别将T-2毒素半抗原-载体蛋白偶联物和羊抗鼠抗抗体包被于反应膜的检测线（T）和质控线（C）上；

6）用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金；

7）将制备的T-2毒素单克隆抗体加入到制备的胶体金中，得到T-2毒素单克隆抗体-胶体金标记物；

8）将T-2毒素单克隆抗体-胶体金标记物喷涂在结合物释放垫上，37℃烘1h后取出，置于干燥环境中保存备用；

9）将样品吸收垫用含0.5%牛血清白蛋白（质量分数）、pH7.2的0.1mol/L磷酸盐缓冲液浸泡2h，37℃下烘干2h；

10）在底板上按顺序粘贴上样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫，最后切成3mm宽的小条，加塑料盒，真空包装，4~30℃条件下可保存12个月。

本发明的另一个目的是提供一种应用上述试纸条检测样品中T-2毒素的方法，该方法包括如下步骤：

（1）对样品进行前处理；

（2）用试纸条进行检测；

（3）分析检测结果。

本发明的检测T-2毒素的试纸条采用高度特异性的抗体抗原反应及免疫层析分析技术，将T-2毒素单克隆抗体-胶体金标记物固定于结合物释放垫上，样品中的T-2毒素在流动过程中，与结合物释放垫上的T-2毒素单克隆抗体-胶体金标记物结合，形成毒素-抗体-胶体金标记物。样本中的毒素与反应膜检测线上的T-2毒素半抗原-载体蛋白偶联物竞争结合T-2毒素单克隆抗体-胶体金标记物，根据检测线红色条带有无来判断待测样品液中是否含有T-2毒素残留。

检测时，样品经处理后滴入试纸条卡孔内，当T-2毒素在样品中的浓度低于检测限或为零时，单克隆抗体-胶体金标记物在层析过程中会与固定在反应膜上的T-2毒素半抗原-载体蛋白偶联物结合，在检测线（T）和质控线（C）处各出现一条红色条带；如果T-2毒素在样品中的浓度等于或高于检测限，单克隆抗体-胶体金标记物会与T-2毒素全部结合，从而在T线处因为竞争反应不会与T-2毒素半抗原-载体蛋白偶联物结合而不出现红色条带。如图2所示。

阴性：当质控线（C）显示出红色条带，检测线（T）同时也显示出红色条带，判为阴性。

阳性：当质控线（C）显示出红色条带，而检测线（T）不显色，判为阳性。

无效：当质控线（C）不显示出红色条带，则无论检测线（T）显示出红色条带与否，该试纸条均判为无效。

本发明的试纸条具有灵敏度高、特异性强、成本低、操作简单、检测时间短、不受检测设备限制、适合各种单位使用、储存简单、保质期长的优点。用本发明试纸条检测T-2毒素的方法，简便、快速、直观、准确、适用范围广、成本低、易推广使用。

附图说明

图1为试纸条剖面结构示意图。

图2为试纸条检测结果判定图。

图3为T-2毒素半抗原合成图。

图4为T-2毒素半抗原核磁共振氢谱图。

具体实施方式

下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用来限制本发明的范围。

实施例1检测T-2毒素的试纸条的制备

该试纸条的制备方法主要包括以下步骤：

1）制备喷涂有T-2毒素单克隆抗体-胶体金标记物的结合物释放垫；

2）制备具有包被有T-2毒素半抗原-载体蛋白偶联物的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线的反应膜；

3）将1）和2）制备好的结合物释放垫、反应膜与样品吸收垫、吸水垫和PVC底板组装成试纸条。

下面分步详细叙述：

1、T-2毒素半抗原的制备

将47mgT-2毒素、25mg对苯二甲酸及少量4-二甲氨基吡啶（DMAP）加入5ml干燥的N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，0℃下缓慢滴加40mg二环己基碳二亚胺（DCC）与1ml干燥的DMF的混合液，滴加完毕后自然升温至室温，继续反应24h。蒸除溶剂，柱层析纯化后得到T-2毒素与对苯二甲酸的单缩合物，即为目标半抗原，合成路线见图3。

取上述产物经核磁共振氢谱测定，如图4所示，8.0ppm左右增加的芳环信号峰以及12.6ppm附近增加的羧基信号峰，说明目标半抗原合成成功。

2、免疫原的制备

取15mg半抗原，溶解于0.8mlDMF中；取20mg碳化二亚胺（EDC）用0.2ml水充分溶解后加入半抗原溶液中，室温下搅拌24h，即可得到反应液A；称取牛血清白蛋白（BSA）36mg，使之充分溶解在3ml0.1mol/LCB（pH9.6）中，将反应液A逐滴缓慢滴加到蛋白溶液中，并于室温下搅拌24h，用0.01mol/LPBS4℃透析3d，每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质；分装，于-20℃保存备用。

3、包被原的制备

制备方法同免疫原的制备，将BSA换为卵清蛋白（OVA）即得包被原。

4、T-2毒素单克隆抗体的制备

（1）动物免疫

将步骤2得到的免疫原注入Balb/c小鼠体内，免疫剂量为150μg/只，使其产生抗血清。

（2）细胞融合和克隆化

取产生特异性抗体的Balb/c小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP20融合，采用间接竞争酶联免疫分析方法测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，得到并建立产单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

（3）细胞冻存和复苏

取处于对数生长期的杂交瘤细胞用冻存液制成细胞悬液，分装于冻存管，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。

（4）单克隆抗体的制备与纯化

采用体内诱生法，将Balb/c小鼠（8周龄）腹腔注入灭菌石蜡油，7~14天后腹腔注射杂交瘤细胞，7~10天后采集腹水。经辛酸-饱和硫酸铵法进行腹水纯化，纯度经SDS-PAGE电泳鉴定，小瓶分装，-20℃保存。

5、羊抗鼠抗抗体的制备

以羊作为免疫动物，以鼠源抗体为免疫原对无病原体羊进行免疫，得到羊抗鼠抗抗体。

6、T-2毒素单克隆抗体-胶体金标记物的制备

（1）胶体金的制备

用双蒸去离子水将质量分数为1%的氯金酸溶液稀释成0.01%，取100ml置于锥形瓶中，用恒温电磁搅拌器加热至沸腾，在持续高温、持续搅拌下加入1.5ml质量分数为1%的柠檬酸三钠溶液，继续匀速搅拌加热至溶液呈透亮的酒红色时停止，冷却至室温后用去离子水恢复到原体积，4℃保存。制备良好的胶体金用肉眼观察是清亮透明的，没有混浊，液体表面无漂浮物，在日光下观察胶体金的颜色为酒红色。

（2）T-2毒素单克隆抗体-胶体金标记物的制备

在磁力搅拌下，用0.2mol/L碳酸钾溶液调胶体金的pH至7.2（不同抗体的pH标记范围在7~8之间，可以变化），按每毫升胶体金溶液中加入20~50μg抗体的标准向胶体金溶液中加入上述T-2毒素单克隆抗体，搅拌混匀，室温静置10min，加入10%BSA使其在胶体金溶液中的终质量分数为1%，静置10min。12000r/min，4℃离心40min，弃上清液，沉淀用复溶缓冲液洗涤两次，用体积为初始胶体金体积1/10的复溶缓冲液将沉淀重悬，置4℃备用。

复溶缓冲液：含BSA的质量分数为0.1%~0.3%、吐温-80的质量分数为0.05%~0.2%、pH7.2的0.02mol/L磷酸盐缓冲液。

7、结合物释放垫的制备

将结合物释放垫浸泡于含0.5%BSA（质量分数）、pH7.2的0.5mol/L磷酸盐缓冲液中，均匀浸湿1h，37℃烘3h备用。用Isoflow喷膜仪将制备好的T-2毒素单克隆抗体-胶体金标记物均匀喷涂在结合物释放垫上，每1cm结合物释放垫喷涂0.01mlT-2毒素单克隆抗体-胶体金标记物后，置于37℃环境中（湿度＜20%）60min后取出，置于干燥环境（湿度＜20%）中保存备用。

8、反应膜的制备

将T-2毒素半抗原-卵清蛋白偶联物包被到反应膜上构成检测线，将羊抗鼠抗抗体包被在反应膜上构成质控线。

包被过程：用磷酸缓冲液将T-2毒素半抗原-卵清蛋白偶联物稀释到1mg/ml，用Isoflow点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的检测线（T），包被量为1.0μl/cm；用0.01mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液将羊抗鼠抗抗体稀释到200μg/ml，用Isoflow点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的质控线（C），包被量为1.0μl/cm。将包被好的反应膜置于37℃条件下干燥2h，备用。

9、样品吸收垫的制备

将样品吸收垫用含0.5%牛血清白蛋白（质量分数）、pH7.2的0.1mol/L磷酸盐缓冲液浸泡2h，37℃下烘干2h备用。

10、试纸条的组装

将样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫依次按顺序粘贴在PVC底板上；结合物释放垫从起始端有1/3区域被样品吸收垫覆盖，结合物释放垫的末端与反应膜的始端连接，反应膜的末端与吸水垫的始端相连，样品吸收垫的始端与PVC底板的始端对齐，吸水垫的末端与PVC底板的末端对齐；所述反应膜上有检测线和质控线，检测线（T）和质控线（C）均呈与所述试纸条的长相垂直的条状带；检测线位于靠近结合物释放垫的末端的一侧；质控线位于远离结合物释放垫的末端的一侧；将试纸条用机器切成3mm宽的小条，装在特制的塑料制卡中，4~30℃条件下可保存12个月。

实施例2样品中T-2毒素的检测

1、样品的前处理

称取4.0g±0.05g粉碎的黄豆、玉米等谷物样本或饲料样本至50ml聚苯乙烯离心管中；加入3gNaCl、5ml甲醇和5ml去离子水，用涡旋仪涡动3min；室温（20-25℃）3000g以上离心5min；移取100μl上清液与200μl样本复溶液（0.02mol/L的磷酸盐缓冲液）混匀后待检。

2、用试纸条进行检测

用吸管吸取待检样品溶液垂直滴加2~3滴于加样孔，液体流动时开始计时，反应7~10min，判定结果。

3、分析检测结果

阴性（-）：T线和C线都显色，表示样品中T-2毒素浓度低于检测限，如图2a。

阳性（+）：T线无显色C线显色，表示样品中T-2毒素浓度等于或高于检测限，如图2b。

无效：未出现C线，表明不正确的操作过程或试纸条已变质失效，如图2c。在此情况下，应再次仔细阅读说明书，并用新的试纸条重新测试。

实施例3样品检测实例

1、检测限试验

取空白黄豆、玉米和饲料样品，在其中分别添加T-2毒素至终浓度为250、500、1000μg/kg，取试纸条进行检测，每个样本重复测定三次。

用试纸条检测黄豆、玉米和饲料样品时，当其中T-2毒素添加浓度为250μg/kg时，试纸条上显示出肉眼可见的两条红色线条，呈阴性；当其中T-2毒素添加浓度为500、1000μg/kg时，试纸条质控线显色，检测线不显色，呈阳性，表明本试纸条对黄豆、玉米等谷物和饲料中T-2毒素的检测限为500μg/kg。

2、假阳性率、假阴性率试验

取已知T-2毒素含量大于500μg/kg的黄豆、玉米、饲料阳性样品各20份和含量小于500μg/kg的黄豆、玉米、饲料阴性样品各20份，用三批试纸条进行检测，计算其阴阳性率。

结果表明：用3个批次生产的试纸条检测阳性样品时，结果全为阳性，可知阳性样品符合率为100%，假阴性率为0；检测阴性样品时，结果全为阴性，可知阴性样品符合率为100%，假阳性率为0。说明本发明的检测T-2毒素的试纸条可以对黄豆、玉米等谷物和饲料中的T-2毒素进行快速检测。

3、特异性试验

将玉米赤霉烯酮、呕吐毒素、黄曲霉毒素、赭曲霉毒素等用pH7.2、0.2mol/L的磷酸盐缓冲液稀释至5mg/L，用T-2毒素试纸条进行检测。结果显示，用该试纸条检测5mg/L玉米赤霉烯酮、呕吐毒素、黄曲霉毒素、赭曲霉毒素时，试纸条质控线和检测线均显色，呈阴性。说明本试纸条对玉米赤霉烯酮、呕吐毒素、黄曲霉毒素、赭曲霉毒素无交叉反应。

Claims (6)

1.一种检测T-2毒素的试纸条，其特征在于，该试纸条包括样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫和底板；其中，所述反应膜上具有包被有T-2毒素半抗原-载体蛋白偶联物的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线，所述结合物释放垫上喷涂有T-2毒素单克隆抗体-胶体金标记物；

所述T-2毒素半抗原-载体蛋白偶联物由T-2毒素半抗原与载体蛋白偶联得到，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白、甲状腺蛋白或人血清白蛋白，所述T-2毒素半抗原是由T-2毒素与对苯二甲酸反应得到，其分子结构式为：

2.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫依次粘贴在底板上。

3.根据权利要求1-2任一项所述的试纸条，其特征在于，所述结合物释放垫1/3～1/2被覆盖于样品吸收垫下。

4.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述T-2毒素单克隆抗体是以T-2毒素半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得，所述羊抗鼠抗抗体是以鼠源抗体为免疫原对山羊进行免疫制备获得。

5.一种制备权利要求1-4任一项所述试纸条的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

1)制备喷涂有T-2毒素单克隆抗体-胶体金标记物的结合物释放垫；

2)制备具有包被有T-2毒素半抗原-载体蛋白偶联物的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线的反应膜；

3)将1)和2)制备好的结合物释放垫、反应膜与样品吸收垫、吸水垫和底板组装成试纸条。

6.一种检测样品中T-2毒素的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

1)对样品进行前处理；

2)用权利要求1-4任一项所述的试纸条进行检测；

3)分析检测结果。