CN201489002U - 食品中高灵敏度真菌毒素检测试纸卡 - Google Patents

Abstract

本实用新型涉及食品中高灵敏度真菌毒素检测试纸卡，试纸卡由外壳盖和外壳底组装成单份的试纸卡，卡内有一条试纸条。试纸条由六部分组成：PVC底板、样品处理垫、玻璃纤维垫、含金颗粒的聚酯膜、硝酸纤维素膜、滤纸。硝酸纤维素膜上包被有真菌毒素-BSA结合物、羊抗兔和兔抗，含金颗粒的聚酯膜上结合有抗真菌毒素单克隆抗体标记的胶体金颗粒，样品处理垫上含有用于调整样品pH值的缓冲液。本实用新型提供了一种操作简便、测试快速、反应灵敏、价格低廉、特异性强的可用于食品加工等生产领域现场快速检测食品中的真菌毒素检测试纸卡。

Description

食品中高灵敏度真菌毒素检测试纸卡

技术领域

本实用新型涉及应用免疫层析技术的一种食品中高灵敏度真菌毒素检测试纸卡。

背景技术

近些年，由于全球温室效应的加重，使粮食或饲料被霉菌及其毒素污染的程度及范围日趋明显。据统计，全世界每年约有25％的谷物被真菌毒素所污染。真菌毒素除直接使畜禽中毒致死外，更为严重的是使畜禽的免疫机能和生产性能下降，长期处于亚健康状态，造成了许多的免疫失败和频频严重发生且难以防治的疾病，同时通过肉、蛋、奶等食物链对人类健康产生危害。现今这一严重问题尚未引起人们足够的重视甚至存在某些误识，对这种现状应给予高度关注。

真菌毒素(Mycotoxins)是产毒霉菌(Moulds)在粮食或饲料上生长繁殖过程中产生的有毒二次代谢产物，至今检测到的毒素已超过350种，其中有几十种已被公认可对动物和人类造成危害。同一种菌株可产生多种不同的毒素；不同的菌株也可产生同一种毒素。目前在我国饲料中霉菌的感染率几近100％，带菌量超过国家标准的约为50％，它主要存在有6种毒素，即黄曲霉毒素(AF)、呕吐霉素(DON)、T-2毒素、玉米赤霉烯酮(F2毒素)、烟曲霉毒素及赭曲霉毒素(OT)，其中对猪危害最大的是黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和呕吐毒素。据对我国饲料及饲料原料真菌毒素调查报告显示，全价饲料中真菌毒素的检出率在90％以上，黄曲霉毒素、T-2毒素、呕吐毒素和玉米赤霉烯酮的检出率高达100％，而又以呕吐毒素、烟曲霉毒素和玉米赤霉烯酮的污染最为严重。

动物摄入被真菌毒素污染的饲料后，可在它的肝、肾、肌肉、血液、乳汁和蛋中检出真菌毒素及其代谢产物，造成动物性食品的污染，通过这种食物链，对人类的健康有极大的潜在危害。

据英国监测中国的玉米样品，有80％被黄曲霉素AFBI和串珠镰孢菌毒B1污染。1996年我国饲料霉变现状调查结果表明，配合饲料及饲料原料污染率分别为100％和99％。但是许多被真菌毒素污染的粮食或饲料的外观常无异常，尤其是受田间霉菌污染时，往往在籽实成熟时已被包埋，霉菌污染的情况被隐蔽，外观仍然正常，仅凭肉眼和手感等难以确定饲料是否含有真菌毒素。如有的见饲料长毛变色、结块有霉味时才认为是发霉，这是一种误识。有人以为长白毛的较黑色毛的发霉轻，实际上白色霉变较黑色霉变所含毒素对猪的毒性更强，如含呕吐霉素、玉米赤霉烯酮的饲料往往呈灰白色霉变。还应注意有些霉菌在夏季高温时分泌毒素旺盛，也有的在寒冷的秋冬时节阴冷潮湿的天气时分泌毒素旺盛，更有的毒素在籽粒收获之前已经存在了，所以饲料真菌毒素一年四季都可发生，应对毒素的产生和存在有全面认识和了解。

如黄曲霉素可分为B1、B2、G1、G2、M1和M2等，其中以B1毒性最强，它是敌敌畏毒性的100倍，砒霜的68倍，氰化钾的10倍。饲料中含黄曲霉素200～400ug/kg以上即出现肝脏形态学损伤；发生中毒性肝炎甚至导致肝癌。赭曲霉毒素200ug/kg就发生肾脏形态学损伤、增重减慢。单端孢菌毒素3ug/kg时采食减少。F2毒素1ug/kg以上即会出现阴道脱垂、假发情等症状。真菌毒素可耐高温及许多理化的加工过程，如加热压制成颗粒饲料，或加工酿成酒类等之后，其毒素依然存在。

黄曲霉毒素(Aflatoxin)是常见霉菌——黄曲霉(Aspergillus flavus)和寄生曲霉(A.parasiticus)中产毒菌株的代谢产物。黄曲霉在自然界的存在较寄生曲霉普遍，此菌能在受侵染的粮食和油料作物(尤其是玉米和花生)上生长繁殖产生毒素。1960年，英国曾发生了约十万只火鸡幼仔短短几个月内相继死亡的严重事故，后来查明是由于火鸡吃了含有霉变花生饼的饲料引起的，并从霉变的花生饼中分离出黄曲霉产毒菌株。1961年即证实了喂饲含有黄曲霉毒素的花生饼可使大鼠发生原发性肝癌。

黄曲霉毒素是一类结构相似的化合物的总称。其基本结构都有一个二呋南环和一个氧杂萘邻酮(香豆素)。最初根据其在紫外光下发生荧光的颜色及薄层层折时Rf值的不同分别命名为黄曲霉毒素B1、B2和G1、G2。在365nm波长下B1、B2呈蓝紫色荧光；G1、G2呈黄绿色荧光。以后又发现这类毒素在动物体内的代谢产物，种类有黄曲霉毒素P1、M1、M2、CM1等等。其中黄曲霉毒素B1的化学结构式如图。

黄曲霉毒素可溶于多种溶剂中，如氯仿、甲醇等，但不溶于已烷、石油醚与乙醚中，在紫外光照射下毒素可产生很强的荧光，此种毒素用有机溶剂提取净化后，可在硅胶板上作薄层层析。

黄曲霉毒素对包括家禽和家富在内的若干动物具有强烈的毒性，其毒性作用主要是对肝脏的损害。大多数产毒黄典霉菌产生黄曲霉毒素B1的量比其它黄曲霉毒素多，而且B1的毒性又最大，因此，一般以B1作为动物毒性试验。动物因种类、性别、年龄、营养状况不同对黄曲霉毒素B1的敏感性有很大差异，最敏感的动物为鸭雏。

动物急性中毒时主要表现为食欲下降，体重减轻，死后解剖肉眼可见肝脏出血、坏死。病理变化主要表现为肝实质细胞变性、坏死、脂肪侵润，纤维化及胆管上皮细胞增生，一次小剂量的黄曲霉毒素造成的生理变化是可以恢复的，如果多次重复摄入则可成不可恢复性病变。除肝脏外，其它脏器如脾、肾、睾等亦可引起退行性病变。

此外，有人以黄曲霉毒素对大鼠进行了连续四代的繁殖试验，第一代和第二代的饲料中各含有黄曲霉毒素量0、1、10ppb，其它两代的饲料中含有10ppb浓度的黄曲霉毒素，并一直喂至21月龄。结果发现，喂低量的雌雄鼠的生存率比对照组(无毒的)高。三代的受孕率相似，仔鼠的存活率与断奶鼠的体重，不论其饲料中含黄曲霉毒素量为1或10ppb，也不论喂养时间的长短，都无显著性差异。特别是，未有一只实验动物发生肝癌，只是饲以含黄曲霉毒素B1 100ppb达76周之久的大鼠肝脏损害率比对照组高。

黄曲霉毒素对实验动物的生物化学影响，一般认为可影响一些与肝脏有关的酶活性变化，如使血清中异柠檬酸脱氢酶、碱性磷酸酶、转氨酶的活性增高，有人还认为可影响酶和脂肪的代谢。

黄曲霉毒素可使鱼类和哺乳类动物诱发肝癌，已有许多报道，这是值得注意的重要问题。各种动物对黄曲霉毒素致癌的敏感性不同，如以最低致癌剂量比较，鱼最敏感，在其饲料中含有黄曲霉毒素B10.1ppb，1个月后即可引起肝癌；大鼠饲料中含黄曲霉毒素B115ppb，67周后导致肝癌。大鼠致癌试验中，大剂量数次摄入和小剂量反复摄入都可导致大鼠发生肝癌，后者出现较前者迟，这说明黄曲霉毒素在致癌性上存在着“剂量与反应”的关系。关于猴的致癌试验，有报导一例雄猴，每日每公斤摄入黄曲霉毒素B10.02mg，5年半年后发生巨大肝细胞癌。

黄曲霉毒素除主要可引发肝癌外，由于毒素侵入试验动物的途径不同，也可引起其它部位如肾、胃、支气管、腺体和皮下组织的癌肿。

有人曾将黄曲霉毒素B1与过去认为致癌性极强的一些化合物进行比较，例如对大白鼠经口摄入致肝癌量，黄曲霉毒素B1为10微克/天，而二甲基亚硝胺则需750微克/天，奶油黄为9000微克/天，由此可见黄曲霉毒素B1是已知致癌化学物质中的最强的一种。

阐明黄曲霉毒素在机体中的代谢情况，对了解其中毒与致癌机理有一定的帮助。有关黄曲霉素素B1的代谢情况，现已初步明确以下几点：

动物摄取黄曲霉毒素B1后，在体内形成代谢物M1。M1是B1的羟基化衍生物，最初在羊奶中发现，故命名。牛、羊等动物食入含有黄曲霉毒素B1的饲料后，其奶中即有M1排出。例如给牛喂饲含有黄曲霉毒素的饲料后12至24小时，奶中即出现有毒性的代谢物，但2至5日后即不能测出具有与B1相等的毒性的代谢物。猴摄入B1后尿中排出代谢物为P1。P1是B1的去甲基衍生物，因而代以一个酚基命名。

动物摄入B1后，在奶、尿液、血液中都有B1或其它代谢物检出。组织器官中以肝脏最为重要，各种动物肝脏均有B1或其它代谢物出现，肾、脾、肾上腺中亦可含有B1，但在肝脏中的蓄积作用显著较其它组织高，这可能由于肝脏是体内进行物质代谢过程的主要器官，许多有毒物质往往在肝脏中进行代谢后，再由肾脏排出，因此尿液中亦有B1及其代谢物的出现。

黄曲霉菌在自然界中普遍存在，很容易污染食品，而且能在粮食及油料等食物上生长繁殖产生毒素。其中最易污染的食品是花生、玉米，其次是小麦、薯干，大米等亦常受污染，比较不易受污染的是豆类，但并非所有黄曲霉菌都是产生毒素的产霉菌株，而且产毒菌株产生毒素也需要一定的条件，并受很多因素的影响，最重要的影响因素是湿度和水份。黄曲霉菌繁殖的温度为20℃至40℃，最适宜温度为37℃左右，湿度为85％以上，当温度在20-32℃，湿度为85％以上时，产生黄曲霉毒素最高，毒素主要在菌丝体中产生，分泌到受污染的食品或培养基中。

黄曲霉毒素虽然对动物有强烈的毒性和致癌性，而且有些食物确实受到重惩污染，但对人类的危害，迄今为止，只有间接的验证，尚缺直接的证据，但根据一些流行病学的调查和研究结果表明，世界上许多肝癌高发区，食品的黄曲霉毒素污染率较高。江苏省启东市是全国肝癌发病率最高的地区，据一些专家研究显示这与当地人们对粮食储存方法不当，再加上气候温暖潮湿，粮食受黄曲霉菌污染所致。

黄曲霉毒素B1是目前已知的化学物质中致癌性最强的一种。虽然黄曲霉毒素B1在食品中的含量非常低，但是由于它毒性剧烈，致癌性强，即使含量非常少，通过生物积累，也能引起人体器官癌变，所以它在食品中的安全限量现在已经降到15ng/ml以下。黄曲霉毒素B1对包括人和若干动物具有强烈的毒性，其毒性作用主要是对肝脏的损害。随着人们生活水平的提高，食品安全意识的增强，各种食品中黄曲霉毒素B1的检测也越来越受到关注。国家有关部门规定黄曲霉毒素B1是大部分食品的必检项目之一。

在实际使用中，真菌毒素的检测方法目前还是以国标推荐的薄层层析法、酶联免疫分析法、微柱筛选法为主，过程繁琐，仅适合法定检验，不适合基层单位快速检测；普通金标法囿于灵敏度不高和没有合适的样品处理法而发展缓慢。

本实用新型旨在提供一种食品中高灵敏度真菌毒素检测试纸卡，解决上述诸法之问题。

本实用新型的目的在于：提供一种食品高灵敏度真菌毒素(包括黄曲霉毒素B1，赭曲霉素A，伏马毒素B1，伏马毒素B2，T2毒素，HT-2毒素，脱氧雪腐镰刀菌烯醇，橘霉素，柄曲霉素，棒曲霉素，玉米赤霉烯酮等真菌毒素)检测试纸卡，解决操作过程繁琐和合适的样品处理问题，充分发挥免疫层析技术反应灵敏、操作简单的特点。

本实用新型的技术方案是：制作高灵敏度真菌毒素检测试纸卡。

制作高灵敏度真菌毒素检测试纸卡的步骤如下：

(1)制备胶体金颗粒。

(2)将抗真菌毒素单克隆抗体标记在胶体金颗粒上。

(3)将相应完全抗原，真菌毒素-BSA结合物，包被并固定硝酸纤维素膜的检测区(T)上。

(4)将羊抗兔和兔抗包被并固定硝酸纤维素膜的控制区(C)上。

(5)将抗真菌毒素单克隆抗体标记的胶体金颗粒均匀分布到聚酯膜上。

(6)将上述聚酯膜粘贴在硝酸纤维素膜上，两者上下部分重叠。

(7)制备含0.01M，pH7.2，PBS缓冲液的玻璃纤维垫。

(8)将上述玻璃纤维垫粘贴在聚酯膜上，两者上下部分重叠。

(9)用聚酯膜制备样品处理垫。

(10)将上述聚酯膜粘贴在玻璃纤维垫上，两者上下部分重叠。

(11)将上述滤纸粘贴在硝酸纤维素膜上的另一端，两者上下部分重叠。

(12)在滤纸上粘贴印刷有“真菌毒素”的标签。

(13)将粘贴完成的大板切成条，把此条装入专门设计的塑料卡中。

应用本实用新型方法制成的试纸卡由下列部分组成：硝酸纤维素膜、含金颗粒的聚酯膜、玻璃纤维垫、样品处理垫、滤纸和PVC底板。

硝酸纤维素膜是含有包被在检测区(T)上对应完全抗原(真菌毒素-BSA结合物)和质控区(C)含羊抗兔和兔抗的硝酸纤维素膜。

聚酯膜是结合有抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体标记的胶体金颗粒，抗赭曲霉素A单克隆抗体标记的胶体金颗粒，抗伏马毒素B1单克隆抗体标记的胶体金颗粒，抗伏马毒素B2单克隆抗体标记的胶体金颗粒，抗T2毒素单克隆抗体标记的胶体金颗粒，抗HT-2毒素单克隆抗体标记的胶体金颗粒，抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇单克隆抗体标记的胶体金颗粒，抗橘霉素单克隆抗体标记的胶体金颗粒，抗柄曲霉素单克隆抗体标记的胶体金颗粒，抗棒曲霉素单克隆抗体标记的胶体金颗粒，抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体标记的胶体金颗粒其中一种的聚酯膜。

滤纸是印有真菌毒素的名称，方便用户辨认品种的滤纸。

玻璃纤维垫是用缓冲液处理过用于调整样品pH值的特定玻璃纤维。

PVC底板是支撑硝酸纤维素膜等的粘性板。

食品中高灵敏度真菌毒素检测试纸卡的样品处理部分由下列部分组成：

(1)粉碎样品用的粉碎机械；

(2)含5.0ml水和5.0ml乙酸乙酯的带盖容器；

(3)小玻璃烧杯；

(4)电吹风；

(5)含0.01M，pH7.2，PBS缓冲液的复溶液容器。

附图1是本实用新型样品处理过程示意图。

图中A.粉碎；B.萃取真菌毒素；C.分层后取上层清液；D.吹干清液；E.用稀释液复溶。

附图2是本实用新型实施例的结构示意图。

图中1.PVC底板、2.样品处理垫、3.玻璃纤维垫、4.含金颗粒的聚酯膜、5.硝酸纤维素膜试剂外壳、6.标签、7.滤纸、8.外壳盖、9.外壳底。

附图3是本实用新型实施例的阳性结果示意图。

附图4是本实用新型实施例的阴性结果示意图。

下面结合附图和实施例对本实用新型进一步说明。

应用本实用新型方法制成的试纸卡由下列部分组成：硝酸纤维素膜(5)、含金颗粒的聚酯膜(4)、玻璃纤维垫(3)、样品处理垫(2)、滤纸(7)、标签(6)和PVC底板(1)；外面装上外壳盖(8)和外壳底(9)。

硝酸纤维素膜是含有包被在检测区(T)上对应完全抗原(真菌毒素-BSA结合物)和质控区(C)含羊抗兔和兔抗的硝酸纤维素膜。

聚酯膜是结合有抗真菌毒素单克隆抗体标记的胶体金颗粒的聚酯膜。

滤纸是贴有印有真菌毒素的名称标签的滤纸，方便用户辨认品种的滤纸。

玻璃纤维垫是用缓冲液处理过用于调整样品pH值的特定玻璃纤维。

PVC底板是支撑硝酸纤维素膜等的粘性板。

检测样品的处理过程如下：

(1)谷类、薯类、豆类：

(a)取大样5g以上粉碎，准确称取2.0g粉碎过20目筛试样于带盖容器中；

(b)准确加入5.0ml水和5.0ml乙酸乙酯，盖紧密封，充分振荡30分钟；

(c)静置后定量取上清液；

(d)用电吹风尽可能吹干清液；

(e)用0.01M，pH7.2，PBS缓冲液溶解后为样品提取液；

(f)每0.5ml复溶液相当与1g样品；

(g)用此复溶液进行检测，阳性结果表明样品中的真菌毒素含量大于2.5ppb，图3。

(h)用此复溶液进行检测，阴性结果表明样品中的真菌毒素含量小于2.5ppb，图4。

(2)花生、核桃：

(a)取大样5g以上粉碎，准确称取2.0g粉碎过20目筛试样于带盖容器中；

(b)准确加入5.0ml水和5.0ml乙酸乙酯，加入8ml正己烷震荡后，静置分层，

放出下层清液于烧杯中，盖紧密封，在充分振荡30分钟；

(c)静置后定量取上清液；

(d)用电吹风尽可能吹干清液；

(e)用0.01M，pH7.2，PBS缓冲液溶解后为样品提取液；

(f)每0.5ml复溶液相当与1g样品；

(g)用此复溶液进行检测，阳性结果表明样品中的真菌毒素含量大于2.5ppb，图3。

[0085](h)用此复溶液进行检测，阴性结果表明样品中的真菌毒素含量小于2.5ppb，图4。

Claims (6)

1.食品中高灵敏度真菌毒素检测试纸卡，其特征是，试纸卡由PVC底板、样品处理垫、玻璃纤维垫、含金颗粒的聚酯膜、硝酸纤维素膜和滤纸组装成长条形的试纸卡。PVC底板一端依次粘附样品处理垫、玻璃纤维垫、含金颗粒的聚酯膜，中间粘附硝酸纤维素膜，另一端粘附滤纸。各组成部分之间相互重叠。

2.根据权利要求1所述的食品中高灵敏度真菌毒素检测试纸卡，其特征是硝酸纤维素膜将羊抗兔和兔抗包被并固定硝酸纤维素膜的控制区(C)上。

3.根据权利要求1所述的食品中高灵敏度真菌毒素检测试纸卡，其特征是，含金颗粒的聚酯膜可以是将抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体标记的胶体金颗粒均匀分布后的聚酯膜，将抗赭曲霉素A单克隆抗体标记的胶体金颗粒均匀分布后的聚酯膜，将抗伏马毒素B1单克隆抗体标记的胶体金颗粒均匀分布后的聚酯膜，将抗伏马毒素B2单克隆抗体标记的胶体金颗粒均匀分布后的聚酯膜，将抗T2毒素单克隆抗体标记的胶体金颗粒均匀分布后的聚酯膜，将抗HT-2毒素单克隆抗体标记的胶体金颗粒均匀分布后的聚酯膜，将抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇单克隆抗体标记的胶体金颗粒均匀分布后的聚酯膜，将抗橘霉素单克隆抗体标记的胶体金颗粒均匀分布后的聚酯膜，将抗柄曲霉素单克隆抗体标记的胶体金颗粒均匀分布后的聚酯膜，将抗棒曲霉素单克隆抗体标记的胶体金颗粒均匀分布后的聚酯膜，将抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体标记的胶体金颗粒均匀分布后的聚酯膜中的一种。

4.根据权利要求1所述的食品中高灵敏度真菌毒素检测试纸卡，其特征是，玻璃纤维垫是含0.01M，pH7.2，PBS缓冲液的玻璃纤维垫。

5.根据权利要求1所述的食品中高灵敏度真菌毒素检测试纸卡，其特征是，样品处理垫用缓冲液处理过，用于调整样品pH值的玻璃纤维。

6.根据权利要求1所述的食品中高灵敏度真菌毒素检测试纸卡，其特征是，PVC底板是支撑样品处理垫、玻璃纤维垫、含金颗粒的聚酯膜、硝酸纤维素膜和滤纸的粘性板。

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