CN102279268A

CN102279268A - 同时检测玉米赤霉烯酮与伏马毒素的方法

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Publication number: CN102279268A
Application number: CN2011102153775A
Authority: CN
Inventors: 严亚贤; 王元凯; 陈志飞; 李树清; 孙建和
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2011-07-29
Filing date: 2011-07-29
Publication date: 2011-12-14

Abstract

一种生物检测工程技术领域的同时检测玉米赤霉烯酮与伏马毒素的方法，包括如下步骤：1、制备偶联物ZEN-BSA和ZEN-OVA；FB1-KLH和FB1-OVA；2、分别制备抗ZEN的单克隆抗体和抗FB1的单克隆抗体；3、制备胶体金，分别标记抗ZEN的单克隆抗体和抗FB1的单克隆抗体；将标记后的单克隆抗体喷涂到金标垫上；4、在硝酸纤维素膜上进行点样；5、组装成试纸条；6、将待测样品的甲醇提取上清滴入试纸条的样本槽中，获取硝酸纤维素膜上各点样条带的显色结果，鉴定，得到结果。本发明的方法检测对象针对性强，准确率高；检测速度快，所需时间短，减少了使用两种检测方法检测两种毒素带来的人力、物力的损失，并且便于基层推广和运用。

Description

同时检测玉米赤霉烯酮与伏马毒素的方法

技术领域

本发明涉及一种生物检测工程技术领域的方法，具体是一种利用纳米胶体金免疫层

析技术同时检测玉米赤霉烯酮与伏马毒素的方法。

背景技术

玉米赤霉烯酮毒素（Zearalenone，ZEN）是镰刀菌属的一些菌株在一定湿度和温度条件下繁殖所产生的次级代谢产物。在小麦、大麦、玉米、黑麦、高粱等谷物中能够检测到玉米赤霉烯酮，在一些动物组织或产物中（如牛奶、鸡蛋等）也可检测到。玉米赤霉烯酮毒素可引发人和动物的多种疾病，主要为致癌促癌毒性，其与自发性乳腺癌等多种癌症、输卵管和子宫水肿、增生、精细胞畸变、凋亡等多种生殖系统疾病有重要关系。玉米赤霉烯酮毒素具有分布广泛、残留时间长、难处理、和其他毒素一起有增强毒性的现象。

伏马毒素（Fumonisins）是串珠镰刀菌在一定湿度和温度条件下繁殖所产生的次级代谢产物，在全世界范围内分布广泛。伏马毒素能够对玉米及其制品造成污染，还可存在于以谷物为原料的一些产品中，如面条、啤酒、调味品等。伏马毒素与人类食道癌、马脑白质软化症、猪的肺水肿症候群、大鼠肝癌等疾病有关。串珠镰刀菌产生的毒素已经被国际癌症研究会（International Agency for Research on Cancer, IARC）划分到2B类--可能的人类致癌物，其中伏马毒素B1（FB1）的毒性强且污染率高。加入WTO之后，农产品及相关食品的国际贸易量日益增加，随之对进出口产品的生物安全性的要求也越来越高。为了保证这类产品的顺利进出口贸易和食用者的健康，出入境检疫、海关、生产企业、监督部门等部门迫切需要一种特异、快速、简便的玉米赤霉烯酮毒素和伏马毒素B1检测方法。

纳米胶体金标记技术是以纳米胶体金作为示踪标志物，应用抗原抗体反应的一种免疫标记技术。纳米胶体金是由氯金酸(HAuCl₄)在还原剂如白磷、单宁酸/柠檬酸钠和柠檬酸三钠等作用下聚合成纳米级大小的金颗粒，由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，故称为纳米胶体金。纳米胶体金标记，实质上是蛋白质高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。吸附机理是胶体金颗粒表面的负电荷，与蛋白质分子的正电荷基团因静电作用而形成牢固结合。这种球型的胶体金颗粒具有高电子密度，能够对多种生物高分子物质如葡萄球菌、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、BSA（牛血清白蛋白）等非共价结合，形成可见的紫红色，使其成为免疫反应的优良标记物，因此广泛应用于各种物质的检测。酶联免疫吸附实验由于液相中的抗原（或抗体）需经扩散才能与固相上的抗原或抗体反应，需较长时间，各个步骤需彻底地洗涤，并且需要特定的酶和底物显色，因此耗时长，程序繁琐；高效液相色谱法因其对检测样品、仪器及操作人员的要求，不利于基层常规检测使用。纳米胶体金免疫层析法能克服上述方法的不足，胶体金免疫层析试验法利用抗原抗体反应原理，胶体金标记示踪物与固定在膜上的抗原或抗体形成复合物被截留而显色，不需要特定的酶和底物显色，也不需要抗原抗体之间的较长时间的物理吸附，而根据显色与否判定阴阳性结果，安全有效，简单方便。

胶体金免疫层析的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的胶体金标记。固定在NC(硝酸纤维素)膜上的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，金标垫上胶体金标记的抗体或抗原既保留其免疫学活性，又有示踪的功能。在测定时，受检样品（测定其中的抗体或抗原）通过毛细作用向前移行与金标垫上的抗原或抗体起反应。继续向前移行，与固定在T线（检测线）抗原或抗体结合形成免疫复合物被截留而显色，约为一条宽为1mm的棕红色条带，多余的金标抗体继续向前移动，与固定在C线（质控线）的二抗结合被截留而显色，约为一条宽为1mm的棕红色条带。此时T线形成金标复合物与标本中受检物质的量呈一定的比例，故可根据T线呈现的颜色深浅进行定性或半定量分析。本发明采用的是胶体金免疫层析试验竞争结合法，分别以ZEN的偶联物ZEN- OVA（卵清白蛋白）固定T1线、以FB1的偶联物FB1-OVA固定T2线，T1线和T2线在同一硝酸纤维素膜，间隔为0.5cm。胶体金标记抗ZEN和FB1的单克隆抗体混合附着于金标垫，兔抗鼠的多克隆抗体固定C线，将样品液滴入样本槽，根据T1和T2线的显色与否来判定检查结果，C线的显色与否来判定试纸条的本身质量。

关于玉米赤霉烯酮毒素和伏马毒素B1的检测，国内外已建立了多种方法。目前检测ZEN和FB1的方法主要为高效液相色谱法（HPLC），气相色谱-质谱联用法（GC-MS），液谱和质谱联用法（LC-MS）。然而，这些方法需要对检测样品进行严格的预处理，还需要高效液相色谱仪等贵重仪器，同时要求有专业的操作人员，不利于现场常规检测使用。由于玉米赤霉烯酮毒素和伏马毒素都为镰刀菌属菌株所产毒素，在谷物中可同时存在，因此有必要开发一种能够同时快速检测两种毒素的检测方法。尽管目前有分别针对玉米赤霉烯酮和伏马毒素B1的检测试剂盒，但是每一种检测试剂盒只能检测一种毒素，不能够同时检测两种毒素，操作麻烦，又不经济和环保，严重影响了实际工作中对真菌毒素的检测，本发明将从根本上提供一种快速简便的检测方法，为出入境检疫、海关、生产企业、监督部门等单位提供快速的一步法检测玉米赤霉烯酮毒素和伏马毒素B1。

发明内容

本发明的目的在于提供快速检测玉米赤霉烯酮毒素和伏马毒素B1的方法。本发明的方法将两种毒素的检测整合在一个检测试纸条上，检测对象针对性强，准确率高；检测速度快，所需时间短，只需5～10分钟，不需经培训的专业人员就可使用本发明方法来检测，满足粮食储存销售机构、出入境、海关等检验部门快速、正确地判断ZEN和FB1毒素含量的要求；本发明的方法只需一次操作即可以同时检测两种毒素，减少了使用两种检测方法检测两种毒素带来的人力、物力的损失，并且便于基层推广和运用。本发明的同时检测玉米赤霉烯酮与伏马毒素的方法，包括如下步骤:

步骤一，将ZEN半抗原分别与BSA和OVA偶联，得到偶联物ZEN-BSA和ZEN-OVA；将FB1半抗原分别与KLH和OVA偶联，得到FB1-KLH和FB1-OVA；

步骤二，分别用ZEN-BSA和FB1-KLH作为免疫原，采用常规方法制备抗ZEN的单克隆抗体和抗FB1的单克隆抗体；

步骤三，制备胶体金，用该胶体金分别标记抗ZEN的单克隆抗体和抗FB1的单克隆抗体；将标记后的单克隆抗体喷涂到金标垫上；

步骤四，在硝酸纤维素膜上进行ZEN-OVA、FB1-OVA、兔抗鼠二抗的点样，之后将硝酸纤维素膜放入牛血清白蛋白溶液中封闭，干燥；

步骤五，将金标垫，点样后的硝酸纤维素膜，样品垫和吸收垫组装成试纸条；

步骤六，将待测样品用甲醇提取，离心，取上清，将上清滴入试纸条的样本槽中，获取硝酸纤维素膜上各点样条带的显色结果，鉴定，得到结果。

优选地，步骤三中，所述胶体金为40nm的胶体金。

优选地，所述制备胶体金包括如下步骤：将100体积的0.005%HAuCl₄溶液加热至沸腾，之后加入0.5～1体积的1%柠檬酸三钠水溶液，煮沸7～10min，最后加三蒸水至100体积，制备得到40nm的胶体金溶液；所述百分数为质量体积百分数。

优选地，所述抗ZEN的单克隆抗体和抗FB1的单克隆抗体在被标记之前经过透析除盐处理。

优选地，所述标记包括如下步骤：在搅拌的条件下，向胶体金溶液中加入单克隆抗体，使其终浓度达到4μg/mL，25℃下孵育5min，用0.1mol/L K₂CO₃调节胶体金溶液的pH为9.0，然后加入10%BSA至BSA的终浓度为0.1%，10000rpm离心20min，弃上清，再用0.01mM pH为9.0的 Tris缓冲液恢复，重复1次，之后将沉淀重悬于原体积的1/10的0.01mM pH为9.0的Tris缓冲液中，最后加入10%BSA至BSA的终浓度为0.1%，即完成标记；所述百分数为质量体积百分数。

优选地，所述喷涂为：将标记过的抗ZEN的单克隆抗体与标记过的抗FB1的单克隆抗体按浓度比为1:1进行混合，之后喷涂到金标垫上。

优选地，所述金标垫使用前进行如下处理：经PBS缓冲液浸泡30分钟，取出后，真空干燥，待用。

优选地，所述点样为：沿着硝酸纤维素膜层析的方向依次将稀释后的FB1-OVA、稀释后的ZEN-OVA、兔抗鼠二抗各喷涂为一线性条带，各条带之间保持间距。

优选地，所述稀释为用含甲醇的PBS溶液进行稀释，所述PBS溶液浓度为0.05M，pH为7.4。

优选地，所述样品垫使用前进行如下处理：经硼酸盐缓冲液浸泡30分钟，取出后，真空干燥，待用。

本发明具有如下的有益效果：本发明的检测方法中，ZEN-OVA喷涂的条带称为T1线，FB1-OVA喷涂的条带称为T2线，兔抗鼠二抗喷涂的条带称为C线；待测样品若有ZEN或（和）FB1毒素，由于毛细效应向前层析移动，样品液中的ZEN或（和）FB1分布与相对应的金标单克隆抗体形成的复合物，竞争了T1线或（和）T2线上抗原与金标单克隆抗体结合的机会，故而以T1线或（和）T2线不显色或显色很浅来判定样品中有ZEN和FB1；相应地待测样品若没有ZEN或（和）FB1，T1线或（和）T2线则显色，呈现出清晰的红色条带，由此判定食品、动物产品等检测样品中ZEN和FB1的含量。

本发明的方法将两种毒素的检测整合在一个检测试纸条上，检测对象针对性强，准确率高；检测速度快，所需时间短，只需5～10分钟，不需经培训的专业人员就可使用本发明方法来检测，满足粮食储存销售机构、出入境、海关等检验部门快速、正确地判断ZEN和FB1毒素含量的要求；本发明的方法只需一次操作即可以同时检测两种毒素，减少了使用两种检测方法检测两种毒素带来的人力、物力的损失，并且便于基层推广和运用。

附图说明

图1为本发明的制备方法中试纸条的结构示意图；

图2为本发明的制备方法中试纸条的层析结果示意图。

具体实施方式

就以下针对的本技术的特定实施方式或者特定用途的说明而言，这些说明仅为示范性质的，并且仅仅提供示例实施方式的简要描述。因此，本发明并不局限于以下所述的具体实施方式，而是相反，本发明包括落入附带的权利要求书的真实范围内的全部替代方案、改进方案以及等同方案。

本发明中，ZEN指代的含义是玉米赤霉烯酮毒素；BSA为牛血清白蛋白；OVA为卵清白蛋白；FB1为伏马毒素B1；KLH为钥孔血蓝蛋白；ZEN-BSA、ZEN-OVA、FB1-KLH、FB1-OVA分别表示ZEN的偶联物以及FB1的偶联物，这些技术术语都是本领域技术人员所熟知的。

实施例

、抗原的制备

（1）玉米赤霉烯酮免疫抗原的制备

取0.33ml(3mg/ml)ZEN，混合于1.2ml吡啶中，加入2mgO-羧甲基羟胺，室温搅拌反应24h；将溶液真空干燥后，加入4ml蒸馏水，并使其溶解，调整pH至8.0；未反应的ZEN用苯抽提除去（3ml苯，共抽提3次），除去苯相，保留水相。水相调pH至3.0，用乙酸乙酯抽提（10ml乙酸乙酯，共抽提4次），抽出酯相，弃水相。酯相用无水硫酸钠滤过后吹干。吹干后的结晶物溶于0.5ml碱性氧化铝处理过的二氧六环中；称取20mgBSA溶于0.7ml 0.05mol/L（pH7.2）的PBS中；之后，将两溶液于4℃下缓慢混合，得溶液a；取1mg NHS和2mg DCC溶于0.2ml二氧六环中得溶液b，并缓慢将溶液b滴加到溶液a中，进而得到溶液c。将溶液c室温下搅拌反应16h，调pH至6.0，通风橱中吹干，缓慢滴加DCC溶液（2mgDCC溶于0.2ml二氧六环中而得），室温下搅拌反应48h，最后用PBS透析2～3d，-20℃保存，得ZEN-BSA完全抗原。

（2）玉米赤霉烯酮包被抗原的制备

玉米赤霉烯酮包被抗原的制备方法基本同玉米赤霉烯酮免疫抗原的制备方法，所不同地方在于将BSA替换为OVA，制备得到ZEN-OVA完全抗原。

（3）伏马毒素B1免疫抗原的制备

将1ml KLH（10mg/ml）放入透析袋，置于200ml含0.2%（V/V）（戊二醛（GA））的PBS溶液中4℃透析16h，然后转入PBS中透析8h除去未反应的GA。向KLH透析物中加入1mgFB1，4℃反应16h。加入10mg Tris，反应2h，封闭未反应的蛋白位点，最后用PBS透析2～3d，-20℃保存，得到FB1-KLH完全抗原。

（4）伏马毒素B1包被抗原的制备

将2.5mg卵清白蛋白（OVA）溶于0.1ml0.01MPB缓冲液中，加入10ul50%（V/V）GA，室温搅拌过夜。4℃条件下用PBS透析过夜，除去多余GA。取0.5mg伏马毒素（FB1）溶于0.2ml25%（V/V）乙醇，将其加入到激活的OVA透析物（约0.15ml）中，加入0.1ml1M碳酸缓冲液（pH9.5），4℃搅拌过夜。加入0.05ml1M赖氨酸（pH7），4℃反应3h。最后用PBS透析72h，2次换液，-20℃保存，制备得到FB1-OVA完全抗原。

、单克隆抗体的制备

（1）玉米赤霉烯酮单克隆抗体的制备

将ZEN-BSA完全抗原溶解于PBS中，测定完全抗原中载体蛋白的浓度。将抗原与等量的弗氏完全佐剂充分乳化，皮下注射免疫6周龄Balb/C小鼠，每只0.1ml；二免：两周后，改用弗氏不完全佐剂，用同样的方法和剂量，进行免疫；三免，操作同二免。免疫5天后眼底静脉采血测效价，效价达到1:10000以上时加强免疫：腹腔注射不加佐剂的抗原0.1ml，三天后处死小鼠，取其脾脏，与骨髓瘤细胞融合。用间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞。通过小鼠腹腔注射杂交瘤细胞来大量制备小鼠腹水，腹水经过过滤、离心初步纯化后，采用辛酸法和亲和层析法纯化腹水，得玉米赤霉烯酮单克隆抗体的制备。

（2）伏马毒素B1单克隆抗体的制备

将FB1-KLH完全抗原冻干粉溶解于PBS中，测定完全抗原中载体蛋白的浓度。将抗原与等量的弗氏完全佐剂充分乳化，皮下注射免疫6周龄Balb/C小鼠，每只0.1ml；二免：两周后，改用弗氏不完全佐剂，用同样的方法和剂量，进行免疫；三免，操作同二免。免疫5天后眼底静脉采血测效价，效价达到1:10000以上时加强免疫：腹腔注射不加佐剂的抗原0.1ml，三天后处死小鼠，取其脾脏，与骨髓瘤细胞融合。用间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞。通过小鼠腹腔注射杂交瘤细胞来大量制备小鼠腹水，腹水经过过滤、离心初步纯化后，采用辛酸法和亲和层析法纯化腹水，得伏马毒素B1单克隆抗体的制备。

、胶体金的制备及单克隆抗体的标记

先将100ml的0.005% （W/V）HAuCl₄溶液加热至沸腾，迅速加入0.5～1ml的1%（W/V）柠檬酸三钠水溶液，煮沸7～10min出现透明的酒红色，最后加三蒸水至100ml，制备得到40nm的胶体金溶液。电镜镜检，确保制备的金颗粒尽量使其大小一致，均匀，颗粒直径在40nm左右，否则重新制备。

将步骤2得到的抗体蛋白用0.005mol/L的氯化钠溶液透析48小时除盐，然后用制备好的40nm的胶体金来分别标记玉米赤霉烯酮单克隆抗体和伏马毒素单克隆抗体。具体步骤如下，注意操作中应注意，一切溶液中不应含杂质微粒，可用高速离心或微孔滤膜预处理：

①向搅拌中的胶体金溶液里迅速加入抗体蛋白使其终浓度达到4μg/mL，25℃室温下孵育5min；

②用0.1mol/L K₂CO₃调节金溶液的pH为9.0，然后加入10%（W/V）BSA至终浓度0.1%来稳定胶体金溶液，反应5min；

③10000rpm离心20min，弃上清，再用0.01mM Tris（pH=9.0）的缓冲液恢复，重复1次，以除去未与金颗粒结合的抗体；

④最后一次离心后将沉淀重悬于原体积的1/10的0.01mM Tris（pH=9.0）缓冲液中，最后加入BSA至终浓度为0.1%（W/V，即质量体积百分数），NaN₃至终浓度0.02%（W/V），4℃储存备用。

4、将标记后的单克隆抗体喷涂到金标垫上

金标垫首先经过0.01M PBS浸泡处理，1L所述PBS组分如下：NaCl 137mmol、KCl 2.7mmol、Na₂HPO₄ 4.3mmol、KH₂PO₄ 1.4mmol，BSA 1%(w/v)、海藻糖5%(w/v)、吐温-20 1%(v/v)，余量为水；用盐酸调pH至7.4；真空干燥金标垫；将步骤3中已标记胶体金的针对玉米赤霉烯酮和伏马毒素的单克隆抗体按蛋白浓度1:1混合后喷涂到金标垫上，并真空干燥。

、硝酸纤维素膜点样

同一硝酸纤维素膜（NC）上进行点样，将ZEN-OVA利用0.05M PBS溶液稀释20倍后喷涂到T1线，FB1-OVA利用PBS溶液稀释20倍后喷涂到T2线，T1线和T2线相隔0.5cm；1L所述PBS组分如下：NaCl 685mmol、KCl 13.5mmol、Na₂HPO₄ 21.5mmol、KH₂PO₄ 7mmol，余量为水，用盐酸调pH至7.4。将兔抗鼠二抗喷涂到C线，室温放置30分钟以干燥。之后将硝酸纤维素膜放入BSA溶液中封闭，37℃放置30分钟。取出后放入烘箱中干燥2小时。

、将金标垫，点样后的硝酸纤维素膜，样品垫和吸收垫组装成试纸条

试纸条的组装顺序如图1，试纸条的组成由下到上依次包括塑料底衬1、硝酸纤维素膜2、金标垫3、样品垫4、吸水垫5；其中塑料底衬1的作用是提供组装平台，硝酸纤维素膜2上具有以兔抗鼠二抗喷涂的C线，以ZEN-OVA喷涂的T1线，以FB1-OVA喷涂的T2线，金标垫3上加有金标抗体，样品垫4提供了待测样品加入的位置, 所述样品垫使用前进行如下处理：经硼酸盐缓冲液浸泡30分钟，取出后，真空干燥，待用。所述硼酸盐缓冲液配置如下：将0.1L的0.05M Na₂B₄O₇-10H₂O和0.9L的0.05M H₂BO₃混合，之后加入BSA，海藻糖，吐温-20，使得BSA的最终含量为1%(w/v)，使得海藻糖的最终含量为5%(w/v)，使得吐温-20的最终含量为0.5%(v/v)，用盐酸调pH至7.4。

硝酸纤维素膜2的尺寸为3cm×0.5cm(长×宽），金标垫3的尺寸为0.5cm×0.5cm(长×宽），样品垫4和吸收垫5的尺寸均为2cm×0.5cm(长×宽）；在组装时，样品垫与金标垫重合0.2cm（长度方向上），金标垫与硝酸纤维素膜重合0.2cm（长度方向上），硝酸纤维素膜与吸水垫重合0.3cm（长度方向上），组装成试纸条。

、胶体金试纸条的使用及结果判定

（1）由于ZEN与FB1的萃取方式相似，均可用70%（v/v)甲醇作为萃取液。具体操作方法为：将1g研磨后的待测样品加入3ml 70%（v/v)甲醇，剧烈震荡15分钟，静置1小时，2500g离心15分钟，取上清液。

图2为试纸条的层析结果示意图；其中，a为阴性结果示意图，b为含有FB1、不含ZEN示意图，c为含有ZEN、不含FB1示意图，d为含有FB1和ZEN示意图。

把待检样品滴入试纸条的样本槽中，由于毛细效应，液体的层析方向向上，对于层析的结果见图2。

在C线上出现棕红色条带，T1线出现棕红色条带，T2线出现棕红色条带，待测样品中不含玉米赤霉烯酮毒素，不含伏马毒素B1，如图2中a所示。

在C线上出现棕红色条带，T1线出现棕红色条带，T2线不出现棕红色条带，待测样品中不含玉米赤霉烯酮毒素，含伏马毒素B1，如图2中b所示。

在C线上出现棕红色条带，T1线不出现棕红色条带，T2线出现棕红色条带，待测样品中含玉米赤霉烯酮毒素，不含伏马毒素B1，如图2中c所示。

在C线上出现棕红色条带，T1线不出现棕红色条带，T2线不出现棕红色条带，待测样品中含玉米赤霉烯酮毒素，含伏马毒素B1，如图2中d所示。

可以看出，本实施例的方法可直接检测样品中的ZEN和FB1，不需要专业培训，操作方便、快速，5～10分钟即可获得结果，能快速、简便、及时地检测ZEN和FB1的目的。

（2）加标样本的免疫胶体金检测针对已知阴性样本，研磨后，添加ZEN和FB1，使样品中的ZEN浓度为50μg/kg，FB1浓度为100μg/kg。取1g 加标样品加入3ml 70%（v/v)甲醇，剧烈震荡15分钟，静置1小时，2500g离心15分钟，取上清液。把待检样品滴入试纸条的样本槽中，5～10分钟后，在C线上出现棕红色条带，T1线不出现棕红色条带，T2线不出现棕红色条带，即样品为阳性，其中含有ZEN和FB1。

综上所述，本发明的方法检测对象针对性强，准确率高；检测速度快，所需时间短，只需5～10分钟，不需经培训的专业人员就可使用本发明方法来检测，满足粮食储存销售机构、出入境、海关等检验部门快速、正确地判断ZEN和FB1毒素含量的要求；本发明的方法只需一次操作即可以同时检测两种毒素，减少了使用两种检测方法检测两种毒素带来的人力、物力的损失，并且便于基层推广和运用。

Claims

1.一种同时检测玉米赤霉烯酮与伏马毒素的方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.如权利要求1所述的同时检测玉米赤霉烯酮与伏马毒素的方法，其特征在于，步骤三中，所述胶体金为40nm的胶体金。

3.如权利要求1所述的同时检测玉米赤霉烯酮与伏马毒素的方法，其特征在于，步骤三中，所述制备胶体金包括如下步骤：将100体积的0.005%HAuCl₄溶液加热至沸腾，之后加入0.5～1体积的1%柠檬酸三钠水溶液，煮沸7～10min，最后加三蒸水至100体积，制备得到40nm的胶体金溶液；所述百分数为质量体积百分数。

4.如权利要求1所述的同时检测玉米赤霉烯酮与伏马毒素的方法，其特征在于，步骤三中，所述抗ZEN的单克隆抗体和抗FB1的单克隆抗体在被标记之前经过透析除盐处理。

5.如权利要求1所述的同时检测玉米赤霉烯酮与伏马毒素的方法，其特征在于，步骤三中，所述标记包括如下步骤：在搅拌的条件下，向胶体金溶液中加入单克隆抗体，使其终浓度达到4ug/mL，25℃下孵育5min，用0.1mol/L K₂CO₃调节胶体金溶液的pH为9.0，然后加入10%BSA至BSA的终浓度为0.1%，10000rpm离心20min，弃上清，再用0.01mM pH为9.0的 Tris缓冲液恢复，重复1次，之后将沉淀重悬于原体积的1/10的0.01mM pH为9.0的Tris缓冲液中，最后加入10%BSA至BSA的终浓度为0.1%，即完成标记；所述百分数为质量体积百分数。

6.如权利要求1所述的同时检测玉米赤霉烯酮与伏马毒素的方法，其特征在于，步骤三中，所述喷涂为：将标记过的抗ZEN的单克隆抗体与标记过的抗FB1的单克隆抗体按浓度比为1:1进行混合，之后喷涂到金标垫上。

7.如权利要求1所述的同时检测玉米赤霉烯酮与伏马毒素的方法，其特征在于，步骤三中，所述金标垫使用前进行如下处理：经PBS缓冲液浸泡30分钟，取出后，真空干燥，待用。

8.如权利要求1所述的同时检测玉米赤霉烯酮与伏马毒素的方法，其特征在于，步骤四中，所述点样为：沿着硝酸纤维素膜层析的方向依次将稀释后的FB1-OVA、稀释后的ZEN-OVA、兔抗鼠二抗各喷涂为一线性条带，各条带之间保持间距。

9.如权利要求8所述的同时检测玉米赤霉烯酮与伏马毒素的方法，其特征在于，所述稀释为用含甲醇的PBS溶液进行稀释，所述PBS溶液浓度为0.05M，pH为7.4。

10.如权利要求1所述的同时检测玉米赤霉烯酮与伏马毒素的方法，其特征在于，

步骤五中，所述样品垫使用前进行如下处理：经硼酸盐缓冲液浸泡30分钟，取出后，真空干燥，待用。