CN103880952B

CN103880952B - 一种抗zen卵黄抗体及其制备方法

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Publication number: CN103880952B
Application number: CN201410124272.2A
Authority: CN
Inventors: 刘英杰; 陈娟; 黄永伟; 刘云
Original assignee: Henan University
Current assignee: Henan University
Priority date: 2014-03-31
Filing date: 2014-03-31
Publication date: 2016-02-10
Anticipated expiration: 2034-03-31
Also published as: CN103880952A

Abstract

本发明属于免疫学技术领域，具体涉及一种抗ZEN（玉米赤霉烯酮）的卵黄抗体及其制备方法。抗ZEN的卵黄抗体通过将人工合成ZEN-BSA抗原对蛋鸡免疫接种，收集鸡蛋，从蛋黄中分离纯化获得ZEN卵黄抗体。本发明所提供的抗ZEN卵黄抗体针对ZEN抗原，特异性高、效价比高，可替代现有的鼠源性的单克隆抗体；所提供的抗ZEN卵黄抗体的制备方法相对于现有的鼠源性的单克隆抗体，其成本低、产量大，利于ZEN快速反应检测体系的建立，因而在农产品及食品安全检测中具有积极的应用意义。

Description

一种抗ZEN卵黄抗体及其制备方法

技术领域

本发明属于免疫学技术领域，具体涉及一种抗ZEN（玉米赤霉烯酮）的卵黄抗体及其制备方法。

背景技术

ZEN（zearalenone，玉米赤霉烯酮）又称F-2毒素，为2，4-二羟基苯甲酸内酯类化合物，具有很高的雌激素活性，主要是由侵染玉米、小麦、大麦、燕麦和高粱等作物的禾谷镰刀菌和黄色镰刀菌等产生的一种非甾类雌激素型真菌毒素，对人类和动物可产生多种毒副作用，例如，具有较强生殖毒性和致畸作用，可引起动物发生雌激素亢进症，导致动物不孕或流产，对猪、家禽和反刍动物影响较大，给畜牧业带来很大经济损失；此外，ZEN还具有细胞毒性、免疫毒性、肝毒性和潜在致癌性等，严重威胁人类健康。由于ZEN在谷物中污染的普遍性和对人畜的高度危害，截止2004年，已有27个国家和地区对玉米赤霉烯酮在食品和饲料中的含量进行了限制，欧盟于2007年制定了统一的限量标准，规定谷物和玉米中ZEN的含量分别不能超过0.1mg/kg和0.35mg/kg，我国规定人食用的小麦、面粉、玉米和玉米（渣）中ZEN含量不能超过60μg/kg。因此，建立对ZEN快速、准确、简便的检测方法非常重要。

目前测定谷物、饲料等中ZEN的方法主要有薄层层析法(thin-layerchromatography，TLC)、气相色谱法(gaschromatography，GC)、液相色谱法(liquidchromatography，LC)、高效液相色谱法（HPLC）等，这些检测方法有许多弊端，比如需要昂贵的仪器设备、大量的样品前处理、复杂的操作程序以及专业的操作人员。

近年来基于抗原、抗体反应技术建立的使用胶体金免疫层析技术（colloidalgoldimmunochromatographicassay，GICA）和酶联免疫吸附技术使得对ZEN的检测具有简便、快速、特异、灵敏、不需特殊设备和人员培训、结果判断直观等优点，因而特别适合于广大基层大批量检测及大面积普查。然而无论是GICA法还是酶联免疫吸附技术，其检测试剂盒的技术关键都需要人工制备针对ZEN的单克隆抗体，目前针对ZEN的单克隆抗体多为鼠源性，其制备复杂，产量低，生产分离成本高，因而很大程度限制了ZEN快速检测体系的建立。

卵黄免疫球蛋白(Immunoglobulinofeggyolk，IgY)，又称卵黄抗体，是母鸡血液中的免疫球蛋白传递至鸡卵黄并在子鸡孵育过程中和孵育后对子鸡起保护作用的免疫球蛋白，IgY的结构与IgG相似，具有典型的IgG空间构象，可与特异性抗原结合，很多方面优于哺乳动物的IgG，如IgY具有不与人类补体以及类风湿因子结合等免疫学特性。IgY的功能性试验、体外模拟试验以及临床应用证实，通过抗原免疫产蛋母鸡获得的特异性抗体IgY可用于制备生物诊断试剂和治疗制剂等，并且鸡卵黄抗体(IgY)具有以下优点：母鸡易于饲养，收集鸡蛋方便；无需抽动物血、无损伤，符合现代动物保护原则；而且具有产率高、成本低、稳定性好、特异性强等特点，因此在免疫诊断、疾病预防等方面具有广泛的应用前景。然而现有技术中，尚未见到有关抗ZEN卵黄抗体及其制备的有关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗ZEN卵黄抗体及其制备方法，从而可以加快ZEN快速检测反应体系的建立。

本发明采取的技术方案如下：

一种抗ZEN卵黄抗体，采用以下方法步骤制备：

（1）利用Thouvenot法和碳二亚胺法，人工合成ZEN-BSA（玉米赤霉烯酮-牛血清蛋白）抗原；

（2）将人工合成ZEN-BSA抗原对蛋鸡免疫接种，免疫3~5次后收集鸡蛋；具体包括以下步骤：

（2-1）将步骤（1）制备的ZEN-BSA抗原粉末溶于PBS（磷酸盐缓冲液，pH7.4）中，然后将溶解有ZEN-BSA的PBS与佐剂乳化制得免疫用ZEN-BSA抗原；

所述PBS的浓度为0.1mol/L；所述佐剂为弗氏佐剂；

所述ZEN-BSA抗原粉末溶于PBS时按1mgZEN-BSA溶于1mLPBS的比例制备；

所述溶解有ZEN-BSA的PBS与佐剂按1：1的体积比例制备；

（2-2）将步骤（2-1）制得的免疫用ZEN-BSA抗原免疫接种蛋鸡3~5次；

所述蛋鸡为21~23周龄健康产蛋母鸡；

所述免疫接种方法为皮下和肌肉多位点接种；

所述免疫接种4次，第一次免疫接种一至两周后免疫接种第2次，以后每隔7~12天免疫接种一次；

所述免疫接种，第一次免疫接种所用佐剂为弗氏完全佐剂，第二次、第三次、第四次免疫接种所用佐剂为弗氏不完全佐剂；

（2-3）免疫接种蛋鸡完成后2~3周收集鸡蛋，持续收集1~2个月，收集的鸡蛋4℃保存；

（3）从步骤（2）获得鸡蛋中分离纯化ZEN卵黄抗体，具体包括以下步骤：

（3-1）将步骤（2）中获得的的鸡蛋外壳消毒，打蛋收集蛋黄；

所述消毒采用75%酒精擦拭或用0.5%新洁尔灭浸泡10~20min；

（3-2）将步骤（3-1）中的蛋黄加入无菌双蒸水稀释，充分混匀，调节pH值，4℃条件下12~24小时；

所述蛋黄与无菌双蒸水的体积比为1︰7~10；

所述pH值为5.0~6.0；

（3-3）将步骤（3-2）混合液过夜后离心，收集得到N升上清液；

所述离心为4℃条件下，8000~12000rpm离心10~25min；

（3-4）将步骤（3-3）收集的上清液缓慢加入硫酸铵，混匀溶解；4℃放置12~24h，离心弃上清，收集沉淀；

所述硫酸铵加入量根据所获上清的体积决定，加入硫酸铵后使硫酸铵按质量分数计终浓度为50%；

所述离心为4℃10000rpm离心10~20min；

（3-5）将步骤（3-4）收集的沉淀用去离子水稀释溶解恢复到N升后，加入硫酸钠，混匀溶解，置室温（18~25℃）过夜，离心弃上清，用去离子水溶解沉淀恢复至N升后，亲和层析柱纯化，滤膜除菌，即得无菌抗ZEN卵黄抗体提取液；

所述硫酸钠加入量，加入硫酸钠后使硫酸钠按质量分数计终浓度为14%；

所述离心为25℃10000rpm离心10~20min；

所述亲和层析柱为HiTrapTMIgYPurificationHP；

所述滤膜孔径为0.22μm；

（3-6）将步骤（3-5）所得无菌抗ZEN卵黄抗体提取液真空冷冻干燥可得抗ZEN卵黄抗体干粉成品，干粉成品保存于-70℃。

本发明所提供的抗ZEN卵黄抗体针对ZEN抗原，特异性高、效价比高，可替代现有的鼠源性的单克隆抗体；所提供的抗ZEN卵黄抗体的制备方法相对于现有的鼠源性的单克隆抗体，其成本低、产量大，利于ZEN快速反应检测体系的建立，因而在农产品及食品安全检测中具有积极的应用意义。

附图说明

图1为本发明所制备的IgY提取液与ZEN特异性结合实验检测图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的解释说明。

实施例1

抗ZEN卵黄抗体，采用以下方法步骤制备：

1、利用Thouvenot法和碳二亚胺法，人工合成ZEN-BSA（玉米赤霉烯酮-牛血清蛋白）抗原；具体包括以下步骤：

A．参考Thouvenot法合成ZEN半抗原

将12mgZEN（以色列fermantek公司）溶于2ml吡啶中，加入20mgCMO（carboxymathyloxime，羧甲基羟胺半盐酸盐），室温搅拌反应24h，45℃条件下真空干燥，干燥后残留物溶于6mL超纯水，用1mol/LNaOH调pH至8.0，然后用苯萃取3次，每次用量6mL，除去水相中未反应的ZEN，将除去未反应ZEN的溶液再用1mol/LHCL调节pH至3.0，用乙酸乙酯萃取4次，每次用量10mL，收集萃取液，将萃取液真空干燥，得ZEN-CMO（玉米赤霉烯酮-6-羧甲基肟）半抗原；此次制备得到ZEN-CMO23.65mg。

．利用碳二亚胺法将ZEN-CMO与BSA（牛血清蛋白，美国Sigma公司）偶联制备ZEN-BSA

将3.0mgZEN-CMO溶于1mLDMF（dimethylformamide，二甲基甲酰胺）中，再加入1.8mgNHS（N-hydroxysuccinimide，N-羧基丁二酰亚胺）、1.8mgEDC（1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐），室温搅拌反应过夜，将反应液5000r/min离心10min，取上清液备用。

将8.6mgBSA用1.2mLPBS（磷酸盐缓冲液，pH7.4）溶解，然后将上清液缓慢加入，室温搅拌过夜得偶联物。

C．将步骤B所得偶联物，用0.015mol/L、pH7.4的PBS透析3d，每天换3次透析液，最终所得透析物5000r/min离心10min，取上清，真空干燥，即得到ZEN-BSA粉末，本次制备得到ZEN-BSA9.02mg，分装保存于-20℃备用。

2、将步骤1中人工合成ZEN-BSA抗原对蛋鸡免疫接种，免疫4次后后收集鸡蛋；具体包括以下步骤：

（1）将步骤1中制备的ZEN-BSA抗原粉末溶于PBS（磷酸盐缓冲液，pH7.4）中，然后将溶解有ZEN-BSA的PBS与佐剂乳化制得免疫用ZEN-BSA抗原；

所述PBS的浓度为0.1mol/L；

所述佐剂为弗氏佐剂，弗氏佐剂购自美国Sigma公司；

所述溶解有ZEN-BSA的PBS与佐剂按1：1的体积比比例制备；

（2）将步骤（1）制得的免疫用ZEN-BSA抗原免疫接种蛋鸡4次；

所述蛋鸡为22周龄健康产蛋母鸡；产蛋母鸡品种为来杭产蛋母鸡，购自吉林农业大学养鸡场；

所述免疫接种为皮下和肌肉多位点接种；

所述免疫接种4次，第一次免疫接种后两周免疫接种第2次，以后每隔9天免疫接种一次；

所述免疫接种，第一次免疫接种所用佐剂为弗氏完全佐剂；第二次、第三次、第四次免疫接种所用佐剂为弗氏不完全佐剂；

（3）免疫接种蛋鸡完成后2周收集鸡蛋，本次免疫10只来杭鸡，持续收集鸡蛋50天，共收集鸡蛋319枚，4℃保存。

人工合成ZEN-BSA抗原对蛋鸡免疫接种同时，采用相同程序对相同数量的鸡接种生理盐水，按照相同程序收集鸡蛋，保存作为阴性对照。

3、分离纯化ZEN卵黄抗体，具体包括以下步骤：

（4）将步骤（3）的鸡蛋外壳消毒，打蛋收集蛋黄；本次使用10枚鸡蛋；

所述消毒采用75%酒精消毒；

（5）将步骤（4）的蛋黄加入无菌双蒸水稀释，充分混匀，调节pH值，4℃条件下过夜；

所述蛋黄与双蒸水的质量比为1：9；

所述pH值为5.2；

（6）将步骤（5）过夜后混合液离心，收集得到上清液1500mL；

所述离心为4℃条件下，9000rpm离心15min；

（7）将步骤（6）收集的上清液缓慢加入硫酸铵，混匀溶解，至硫酸铵饱和度为50%；4℃过夜，4℃10000rpm离心15min，弃上清，收集沉淀；

根据所获上清的体积加入硫酸铵，使终浓度为50%，本次加入硫酸铵750g；

（8）将步骤（7）收集的沉淀用去离子水稀释溶解到1500mL，加入硫酸钠，使硫酸钠终浓度为14%，混匀，置室温（18-25℃）过夜，25℃10000rpm离心15min，弃上清，用去离子水溶解沉淀至1500mL，亲和层析柱纯化，滤膜除菌，即得无菌抗ZEN卵黄抗体提取液；

所述硫酸钠复溶所用硫酸钠为质量分数，本次加入硫酸钠210g；

所述亲和层析柱为HiTrapTMIgYPurificationHP；亲和层析柱购自美国通用电气公司；

所述滤膜孔径为0.22μm；

（9）为便于长期保存，将步骤（8）所得无菌抗ZEN卵黄抗体提取液真空冷冻干燥可得抗ZEN卵黄抗体干粉成品，干粉成品保存于-70℃。

实施例2

为检测实施例1制备的ZEN卵黄抗体的抗体效果，发明人做了进一步的检测实验。实验过程如下：

1、对实施例1步骤（8）中制备的无菌抗ZEN卵黄抗体提取液的浓度进行测定

对实施例1步骤（8）中亲和层析柱后的ZEN卵黄抗体提取液进行浓度测定，采用双波长紫外分光光度法测定亲和层析柱纯化后IgY在260nm和280nm的吸收值，按下式计算IgY浓度：

IgY浓度（mg/ml）=1.45×A₂₈₀－0.74×A₂₆₀。

紫外分光光度法测定结果显示，经亲和层析纯化后，IgY含量为5.17mg/ml。

2、对实施例1步骤（8）中制备的无菌抗ZEN卵黄抗体提取液效价测定

步骤（8）中制备的无菌抗ZEN卵黄抗体提取液效价测定采用间接ELISA法，具体过程如下：

取实施例1中制备的0.25mgZEN-BSA加入100ml0.1mol/LpH7.4的PBS溶液，溶解混匀，在96孔深孔板（美国Sigma公司）中，每孔加入100μl，经方阵滴定法确定ZEN-BSA抗原包被浓度为2.5μg/ml，4℃过夜，取出甩干，然后用PBST(PBS0.01mol/l，0.5%Tween-20，pH7.4)洗涤3次，拍干。然后每孔加入200μl含有3%脱脂奶粉的PBS封闭，37℃恒温孵育1h取出，甩干后用PBST洗涤3次，拍干。

把步骤（8）中制备的IgY含量为5.17mg/ml无菌抗ZEN卵黄抗体提取液，用PBS分别做1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000、1:64000、1:128000、1:256000稀释，分别取100μl加入第1孔、第2孔、第3孔、第4孔、第5孔、第6孔、第7孔、第8孔。重复做5排。

以实施例1步骤2中给鸡接种生理盐水组所收集鸡蛋提取的IgY作为阴性对照，相同程序处理。

加入IgY提取液后的深孔板37℃孵育1h，然后用PBST洗涤3次，每次间隔1min。然后每孔加入100μl兔抗鸡HRP标记的二抗（1:12000），37℃恒温孵育1h，取出甩干后用PBST洗涤3次，拍干。然后每孔加入100μlTMB显色液，37℃避光显色15min；用酶标仪(普朗酶标仪9602)测定A₄₅₀值，测定结果如下表：

对上表中P／N值（阳性孔OD值／阴性孔OD值）计算可以得出，IgY的稀释倍数为1:64000时，其OD₄₅₀值0.371与阴性对照OD₄₅₀值0.175的比值为2.12，因此该孔（IgY的最高稀释倍数为1:64000时孔）为阳性，即效价为1:64000，表明纯化提取液中的IgY活性较高。

3、ELISA竞争抑制实验

ELISA竞争抑制实验证明所制备的IgY为抗ZEN特异性抗体，具体过程如下：

取实施例1制备的0.25mgZEN-BSA冻干粉，加入100ml0.1mol/LpH7.4的PBS溶液中，溶解混匀，每孔100μl，分别加入96孔深孔板中，经方阵滴定法确定ZEN-BSA抗原包被浓度为2.5μg/ml，4℃过夜，取出甩干，然后用PBST(PBS0.01mol/l，0.5%Tween-20，pH7.4)洗涤3次，拍干。每孔加入200μl含有3%脱脂奶粉的PBS封闭，37℃恒温孵育1h取出，甩干后用PBST洗涤3次，拍干。

取1.29mg抗ZEN特异性lgY干粉，加入10mlPBS中，制得129μg/ml抗ZEN特异性lgY溶液；把制得的ZEN-BSA干粉用PBS分别稀释成40，80，160，320，640，1280ng/ml，取5支EP管，每管分别加入300μl129μg/ml的抗ZEN特异性lgY溶液，再分别在这5支EP管中加入PBS和40，80，160，320，640，1280ng/ml的ZEN-BSA300μl，在EP管中混匀后，37℃恒温孵育1h，从孵育后的混合物每孔取100μl加入已封闭好的酶标板孔中，重复做五排，37℃恒温孵育1h，取出甩干后用PBST洗涤3次，拍干，然后每孔加入100μl兔抗鸡HRP标记的二抗（1:12000），37℃恒温孵育1h，取出甩干后用PBST洗涤3次，拍干，每孔加入100μlTMB显色液，37℃避光显色15min；然后每孔加入50μl2mol/LH₂SO₄终止反应，酶标仪测定OD₄₅₀值，实验结果如下：

竞争抑制ELISA实验结果

结果提示，实施例1所制备的IgY为抗玉米ZEN特异性抗体，具有和抗原ZEN特异性结合的性质。

实验结果证明，实施例1所制备的IgY为抗玉米赤霉烯酮特异性抗体，可应用于农产品、食品中玉米赤霉烯酮污染检测，也可做为进一步研究开发胶体金试纸或其他试剂盒。

4、双向琼脂扩散试验

发明人通过双向琼脂扩散试验证明实施例1所制备的IgY为抗ZEN特异性抗体，具体过程如下：

取洁净玻片于水平台上，将1%琼脂糖（用生理盐水配制）在水浴中加热融化，用吸管在玻片上铺厚度约为4mm的琼脂，打孔器打孔径约3mm的孔，在孔内（A孔）加入50μl用PBS1:8000稀释的实施例1所制备IgY提取液，即实施例1步骤8所获得的ZEN卵黄抗体提取液，距该孔1.5cm远分别打4个孔，分别加入50μl用PBS稀释的10μg/ml的玉米赤霉烯酮（B孔）、α-玉米赤霉醇（C孔）、β-玉米赤霉醇（D孔）、玉米赤霉酮（购自Sigma公司）（E孔），37℃温箱湿盒孵育24h。

结果如图1所示，只有在IgY提取液孔和ZEN孔（即A孔和B孔）之间存在白色沉淀线，说明所制备的IgY为抗ZEN特异性抗体，而且有较好的特异性。

尽管现有技术中已有针对ZEN的抗体制备，但是所制备的抗体多为鼠源性，成本高、产量低，而本发明提供了一种抗ZEN的卵黄抗体的制备方法，所制备的抗ZEN卵黄抗体特异性强、效价高，且成本低廉、产量大，对于建立多样化的免疫学ZEN检测方法，降低检测ZEN检测成本具有十分积极的意义。

Claims

1.一种抗ZEN卵黄抗体，其特征在于，该抗体采用以下步骤制备：

（1）利用Thouvenot法和碳二亚胺法，人工合成ZEN-BSA抗原；

（2-1）将步骤（1）制备的ZEN-BSA抗原粉末溶于PBS中，然后将溶解有ZEN-BSA的PBS与佐剂乳化制得免疫用ZEN-BSA抗原；

（3）从步骤（2）获得鸡蛋中分离纯化ZEN卵黄抗体；具体包括以下步骤：

（3-1）将步骤（2）获得的鸡蛋外壳消毒，打蛋收集蛋黄；

（3-2）将步骤（3-1）收集的蛋黄加入无菌双蒸水稀释，充分混匀，调节pH值，4℃条件下静置12~24小时；

（3-3）将步骤（3-2）的混合液离心，收集得到N升上清液；

（3-5）将步骤（3-4）收集的沉淀用去离子水稀释溶解恢复到N升后，加入硫酸钠，混匀溶解，置室温过夜，离心弃上清，用去离子水溶解沉淀恢复至N升后，亲和层析柱纯化，滤膜除菌，即得无菌抗ZEN卵黄抗体提取液；

（3-6）将步骤（3-5）所得无菌抗ZEN卵黄抗体提取液真空冷冻干燥得抗ZEN卵黄抗体干粉成品。

2.如权利要求1所述抗ZEN卵黄抗体，其特征在于，步骤（2）中所述蛋鸡为21~23周龄健康产蛋母鸡。

3.如权利要求1所述抗ZEN卵黄抗体，其特征在于，步骤（2）中所述免疫为皮下和肌肉多位点接种免疫，免疫4次，第一次免疫接种一至两周后免疫接种第2次，以后每隔7~12天免疫接种一次。

4.如权利要求1所述抗ZEN卵黄抗体，其特征在于，步骤（3-5）中所述亲和层析柱为HiTrapTMIgYPurificationHP；所述滤膜孔径为0.22μm。

5.权利要求1所述抗ZEN卵黄抗体的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

（1）利用Thouvenot法和碳二亚胺法，人工合成ZEN-BSA抗原；

（2）将人工合成ZEN-BSA抗原对蛋鸡免疫接种，免疫3~5次后后收集鸡蛋；具体包括以下步骤：

（3-1）将步骤（2）获得的鸡蛋外壳消毒，打蛋收集蛋黄；

（3-3）将步骤（3-2）的混合液离心，收集得到N升上清液；

6.如权利5所述抗ZEN卵黄抗体的制备方法，其特征在于，步骤（3-2）中所述蛋黄与双蒸水的体积比为1︰7~10；所述pH值为5.0~6.0。

7.如权利5所述抗ZEN卵黄抗体的制备方法，其特征在于，步骤（3-4）中硫酸铵按质量分数计，根据所获上清的体积加入硫酸铵时，硫酸铵最终质量分数为50%。

8.如权利5所述抗ZEN卵黄抗体的制备方法，其特征在于，步骤（3-5）中硫酸钠按质量分数计，根据所获上清的体积加入硫酸钠时，硫酸钠最终质量分数为14%。

9.如权利5所述抗ZEN卵黄抗体的制备方法，其特征在于，步骤（3-5）中所述亲和层析柱为HiTrapTMIgYPurificationHP；所述滤膜孔径为0.22μm。