CN106520704B - 一株抗喹诺酮类抗生素的群选性单克隆抗体杂交瘤细胞株yh6及其应用 - Google Patents

一株抗喹诺酮类抗生素的群选性单克隆抗体杂交瘤细胞株yh6及其应用 Download PDF

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Abstract

一株抗喹诺酮类抗生素的群选性单克隆抗体杂交瘤细胞株YH6及其应用，属于免疫化学技术领域。本发明单克隆细胞株YH6，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.12024。YH6分泌的单克隆抗体采用间接竞争酶联免疫法测定，和诺氟沙星，氧氟沙星，恩诺沙星，环丙沙星，氟甲喹，那氟沙星，依诺沙星，洛美沙星，左氧氟沙星，培氟沙星，萘啶酸，达氟沙星，吡啶酸，西诺沙星，垩喹酸，马波沙星，帕珠沙星，司氟沙星，加替沙星，奥比沙星，氟罗沙星21种拟除虫菊酯存在交叉反应，其IC50为0.1‑50ng/mL；该群选性单克隆抗体，可用于胶体金免疫层析试纸条和免疫传感器的研制，为食品中喹诺酮类抗生素残留的免疫检测提供了原料，具有实际应用价值。

Description

一株抗喹诺酮类抗生素的群选性单克隆抗体杂交瘤细胞株 YH6及其应用
技术领域
本发明涉及一株鼠源的杂交瘤细胞株YH6号及其产生的能同时识别21种喹诺酮类抗生素的群选性单克隆抗体，可用于胶体金免疫层析试纸条和免疫传感器的研制，属于免疫化学技术领域。
背景技术
喹诺酮类是一类人工合成的以4-喹诺酮为基本结构的抗菌药，其通过作用于细菌的脱氧核糖核酸（DNA），阻碍DNA回旋酶，造成细菌DNA的不可逆破坏而达到抗菌效果。经过四十多年的发展，喹诺酮类药物分为四代。喹诺酮类抗生素因其抗菌谱广，生物利用率高，不良反应少等特点广泛用于临床和动物的抗感染。然而，许多喹诺酮类抗生素已经被证实对人类和动物有一定程度的毒性影响，特别是萘啶酸已经被证实有致癌和致突变作用，影响光敏性以及对繁殖系统有干扰作用。另外，因喹诺酮类抗生素的滥用而造成的抗生素残留问题也日益威胁着环境及人类健康。
目前，针对喹诺酮类抗生素的分析方法有仪器分析方法和免疫分析法。其中应用最广泛的包括高效液相色谱分析方法 (HPLC)、气质联用 (GC-MS)、液质联用 (LC-MS)等。然而这些方法需要昂贵的仪器、专业的操作人员和复杂的样品前处理，不适用于食品中喹诺酮类抗生素的日常快速检测。随着检测喹诺酮类抗生素免疫分析技术的发展，不仅可以解决上述问题，并且具有高通量和低成本的优势，适于现场的批量检测。建立喹诺酮类抗生素的免疫检测技术，首先要获得喹诺酮类抗生素的群选性单克隆抗体。
发明内容
本发明的目的是提供了杂交瘤细胞株YH6及其产生的抗喹诺酮类抗生素的群选性单克隆抗体。
本发明的技术方案 ：一株分泌抗喹诺酮类抗生素的群选性单克隆抗体的杂交瘤细胞株YH6，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为 CGMCCNo.12024。
抗喹诺酮类抗生素的群选性单克隆抗体，它由所述保藏编号为 CGMCC No.12024的杂交瘤细胞株YH6分泌产生。
所述抗喹诺酮类抗生素的群选性单克隆抗体的应用，用于胶体金免疫层析试纸条和免疫传感器的研制，在喹诺酮类抗生素总量检测中的应用，用于食品中喹诺酮类抗生素残留的免疫检测。
所述的杂交瘤细胞株YH6产生的单克隆抗体，能够广谱性地识别 21 种喹诺酮类抗生素，且灵敏度好，半数抑制浓度（IC50）在0.1-50ng/mL之间；21 种喹诺酮类抗生素为：诺氟沙星（CAS-65731-84-2）、氧氟沙星，恩诺沙星，环丙沙星，氟甲喹（CAS-42835-25-6）、，那氟沙星，依诺沙星，洛美沙星，左氧氟沙星，培氟沙星，萘啶酸，达氟沙星，吡啶酸，西诺沙星，垩喹酸，马波沙星，帕珠沙星，司氟沙星，加替沙星，奥比沙星，氟罗沙星。
本发明将半抗原 1（hapten 1）通过戊二醛法和血蓝蛋白偶联，用作免疫原；将半抗原 2（hapten 2）通过戊二醛法和鸡卵清蛋白偶联，用作包被原。通过小鼠免疫、抗血清测定、细胞融合、筛选和亚克隆技术得到稳定分泌抗喹诺酮类抗生素单克隆抗体的杂交瘤细胞株 YH6，通过体内诱生法制备腹水，辛酸-硫酸铵沉淀法纯化得到相应的单克隆抗体。
半抗原 1（hapten1）和半抗原 2（hapten2）的结构 ：
Hapten 1
Hapten 2
本发明的有益效果：在于该单克隆抗体可以同时识别21种喹诺酮类抗生素，包括诺氟沙星（CAS-65731-84-2）、氧氟沙星，恩诺沙星，环丙沙星，氟甲喹（CAS-42835-25-6）、，那氟沙星，依诺沙星，洛美沙星，左氧氟沙星，培氟沙星，萘啶酸，达氟沙星，吡啶酸，西诺沙星，垩喹酸，马波沙星，帕珠沙星，司氟沙星，加替沙星，奥比沙星，氟罗沙星。且灵敏度好，半数抑制浓度（IC 50 ）在 0.09-50ng/mL之间；为研制食品中喹诺酮类多残检测的免疫层析试纸条提供了原料。
生物材料样品保藏：本发明提供的杂交瘤细胞株 YH6，分类命名为单克隆细胞株，该细胞株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称 CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期 2016 年 1 月 20日，保藏编号为 CGMCC No.12024。
具体实施方式
本发明提供了杂交瘤细胞株 YH6及其分泌的抗喹诺酮类抗生素的群选性单克隆抗体。下面结合具体实施方式对本发明做进一步的说明，实施例中如无特殊说明均为常规方法。
实施例 1 杂交瘤细胞株YH6的制备
1、动物免疫和血清筛选
选择半抗原 1（H1）和血蓝蛋白（KLH）的偶联物（H1-KLH）为免疫原，首免采用完全佐剂和免疫原1︰1体积混合，以皮下免疫方式免疫BALB/c小鼠，免疫间隔时间4周，五免后7-10d，采用间接竞争酶联免疫法测定血清的效价和抑制，选择效价高并抑制好的小鼠进行融合。
2、细胞融合
融合前7至10天，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基在5% CO2 培养箱中培养瘤细胞。融合前3天，对选出的小鼠进行腹腔冲刺免疫，融合当天，摘眼球取血，采用颈椎脱臼法处死小鼠后，立即放入75%酒精中消毒，浸泡 5 min 左右，采用无菌操作取出 BALB/c小鼠的脾脏，用注射器的胶头适度用力地在筛网上研磨脾脏，脾细胞漏出筛网得到悬液，收集，离心（1200rpm，6 min），用 RPMI-1640培养基洗涤脾细胞三次，最后一次离心后，将脾细胞稀释到一定体积后，计数，备用。
第三步融合，将脾细胞和 SP2/0瘤细胞按照计数比 5-10︰1 比例进行混合，离心（1200 rpm，6 min），弃上清。融合过程约 7 min。第 1 min 内，将1 mL的 PEG 1500 由慢到快滴加到细胞中；第2 min，用手握住管底，静置。第3 min 和第 4 min，在 1 min 内滴加 1mL 的 RPMI-1640培养基；第5 min 和第 6 min，在 1 min 内滴加 2 mL 的 RPMI-1640培养基。第7 min，在 1 min 内滴加 3-4mL的RPMI-1640培养基。然后用 RPMI-1640培养基将体积增加到 15 mL。在 37℃、5% CO2培养箱中，静置5 min。离心（800 rpm，6 min），弃上清，在棉球上轻轻地弹散细胞，然后用 HAT 培养基重悬细胞，按照 200μL/孔注入到 96 孔细胞板。最后，置于 37℃、5% CO2 培养箱中培养。
3、筛选和亚克隆
融合按第1天计，第4天进行HAT培养基半换液，第6天进行HAT培养基全换液；并且每天观察 96 孔细胞板中杂交瘤细胞的生长情况。第 8 天进行融合后细胞上清的第一次检测。
在抗体筛选过程中，用五种代表性的标准品沙拉沙星，氟甲喹，环丙沙星，诺氟沙星，恩诺沙星筛选细胞上清。筛选细胞上清的方法仍然是间接竞争酶联免疫法，通常先将细胞上清稀释 3 倍，测定效价。然后再测每个阳性孔的抑制。因为空白值大小，对抗体灵敏度的影响很大，所以，在测定细胞上清抑制时，往往需要对细胞上清进行多个不同倍数的稀释。最后根据检测结果，选择阳性强，抑制好并且生长状态良好的细胞通过有限稀释法进行亚克隆。第一次亚克隆以后，第 6天就可以取细胞上清进行测定。按照和融合后细胞检测一样的方法和原理，筛选亚克隆后细胞上清的效价和抑制。通常经过第二、三次亚克隆以后，根据阳性率 98% 并且整块板的抑制效果相近，选出细胞扩培和冻存，即得杂交瘤细胞株YH6。
实施例2由杂交瘤细胞株YH6分泌的抗喹诺酮类抗生素单克隆抗体的制备、纯化
1、单克隆抗体的制备
选择健康的 BALB/c小鼠，按照0.6 mL/只小鼠的量注射无菌石蜡油。10 天后，每只小鼠腹腔注射1×106杂交瘤细胞。第6天后，每天观察小鼠的状态，如果小鼠的腹部明显增大，用手触摸有紧绷感，并且不愿活动时，可以收集腹水；然后离心（6000 rpm，12 min），除去红细胞等杂质，分装，-20℃冻存。
2、单克隆抗体纯化
采用辛酸 - 硫酸铵沉淀法纯化腹水。在偏酸条件下，正辛酸可以沉淀腹水中除IgG免疫球蛋白外的其他杂蛋白，然后离心，弃沉淀；再用一定饱和度的硫酸铵溶液沉淀IgG型的单克隆抗体，离心，弃上清，用 0.01M PBS 溶液（pH 7.0）溶解后，透析脱盐，最终得到纯化后的抗喹诺酮类抗生素单克隆抗体。
3、灵敏度的测定
抗体灵敏度通常采用半数抑制浓度（IC 50 ）来表示。纯化的腹水通过间接竞争酶联免疫法（ic-ELISA）来测定单克隆抗体对 21种喹诺酮类抗生素浓度在 0-200 ng/mL 之间的抑制效果，选择包被原 H2-OVA浓度为 0.1μg/mL，抗体的蛋白浓度为 0.08μg/mL，测定结果用 origin 8.5软件进行四参数回归拟合，根据拟合的回归方程，计算抗体对各种喹诺酮类抗生素的 IC 50，结果见表 1。
表1抗体对各种喹诺酮类抗生素的 IC 50

Claims (4)

1.一株分泌抗喹诺酮类抗生素的群选性单克隆抗体的杂交瘤细胞株YH6，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为 CGMCC No.12024。
2.抗喹诺酮类抗生素的群选性单克隆抗体，其特征在于：它由所述保藏编号为 CGMCCNo.12024的杂交瘤细胞株YH6分泌产生。
3.权利要求2所述抗喹诺酮类抗生素的群选性单克隆抗体的应用，其特征在于：用于胶体金免疫层析试纸条和免疫传感器的研制，在喹诺酮类抗生素总量检测中的应用，用于食品中喹诺酮类抗生素残留的免疫检测。
4.根据权利要求3所述抗喹诺酮类抗生素的群选性单克隆抗体的应用，其特征在于：杂交瘤细胞株YH6产生的单克隆抗体，能够广谱性地识别 21 种喹诺酮类抗生素，且灵敏度好，半数抑制浓度IC50为 0.1-50ng/mL；21 种喹诺酮类抗生素为：诺氟沙星、氧氟沙星，恩诺沙星，环丙沙星，氟甲喹，那氟沙星，依诺沙星，洛美沙星，左氧氟沙星，培氟沙星，萘啶酸，达氟沙星，吡啶酸，西诺沙星，垩喹酸，马波沙星，帕珠沙星，司氟沙星，加替沙星，奥比沙星，氟罗沙星。
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