CN102676459B - 一种抗副溶血弧菌耐热溶血毒素单克隆抗体及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种鼠来源杂交瘤细胞系和由该杂交瘤细胞系分泌的抗副溶血弧菌耐热溶血毒素的单克隆抗体及其制备方法。所说的鼠抗副溶血弧菌耐热溶血毒素的单克隆抗体是通过提取与纯化副溶血弧菌耐热溶血毒素TDH后免疫Ba1B/c小鼠，然后利用B淋巴细胞杂交瘤技术获得一株杂交瘤细胞系T6D4稳定分泌的，其用于致病性副溶血弧菌的快速检测。该抗体为一株稳定鼠源性杂交瘤细胞系所分泌的IgG_2a：能够对TDH发生特异性反应。

Description

一种抗副溶血弧菌耐热溶血毒素单克隆抗体及其制备方法

技术领域

本发明属于细菌监测和免疫学分析技术领域，具体涉及一种鼠来源杂交瘤细胞系和由该细胞系分泌的抗副溶血弧菌耐热溶血毒素单克隆抗体及其制备方法。

背景技术

耐热溶血毒素(thermostable direct hemolysin，TDH)是副溶血弧菌(vibro parahaemolyticus，VP)产生的一种溶血毒素。是VP分泌的通行二聚体蛋白，不含糖或者脂质。TDH分子质量约46000，TDH为孔形成型毒素，对多种培养细胞与细胞毒性作用，具有潜在的心脏毒性作用，研究最多的是其溶血作用。TDH能使人、小白鼠、兔等红细胞(redblood cell，RBC)溶血，但对马和羊的RBC不发生溶血。

副溶血弧菌是一种嗜盐性细菌，书弧菌科、弧菌属。存在于近海岸的海水和鱼类、贝类中，是一种重要的食源性致病菌，食用虾、蟹、贝类等水产品所致副溶血弧菌食物中毒，起病急骤，常有腹痛、腹泻、呕吐、失水、畏寒及发热。腹痛多呈陈发性绞痛，常位于上腹部脐周或者盲部。腹泻每日3～20余次不等，大便性状多样，多数为黄水样或黄糊便。越2％～16％呈典型的血水或者洗肉水样便，部分病人的粪便可以为脓血样或者粘液血样。由于吐泻，患者常与是谁现象，重度失水者可伴声哑和肌痉挛，个别病人血压下降面色苍白或者发绀以至意识不清。近年来副溶血弧菌引起食物中毒的发生规模以及人群暴露规模呈明显上升趋势，已成为我国首要的食源性致病菌。对该菌致病机制的初步研究发现其致病力主要有侵袭力溶血毒素和尿素酶。流行病学调查表明其致病性与其溶血能力呈平行关系。主要是耐热溶血毒素耐热溶血毒素相关溶血毒素(TDH-related hemolysin，TRH)、不耐热溶血毒素(thermolabilehemolysin，TLH)；临床上分离出的副溶血弧菌中95％都会产生直接耐热溶血毒素(TDH)，因而TDH被认为是该菌的一种主要的毒理因子。

目前应用在副溶血弧菌的检测方法有很多，其中也有针对副溶血弧菌的TDH检测方法，目前，副溶血弧菌的检测手段主要有分离培养技术、聚合链式反应技术(Polymerase ChainReaction，PCR)、免疫学方法等。常规的分离培养操作繁琐、周期较长，检测率较低；PCR方法虽然具有特异、敏感等特点，但其程序复杂，需要精密仪器与设备，不利于推广应用；在免疫学应用方面，应用在副溶血弧菌的方法主要有多克隆抗体检测、斑点ELISA等检测副溶血弧菌(窦勇，2006；臧红梅，2006)，都是以副溶血弧菌的菌体为抗原免疫动物得到抗血清，从而得到检测副溶血弧菌效果。这种方法也有它的局限性，具体体现在多克隆抗体受不同菌株、免疫剂量、实验动物、免疫时间、免疫血清储存时间等多种因素的影响，很难提供标准化的相关试剂，而单克隆抗体特异性强、均质性好、效果高、稳定廉价，比起多克隆抗体技术等免疫方法有明显的优越性。

发明内容

本发明所要解决的技术问题之一在于提供一种鼠来源杂交瘤细胞系，以制备抗副溶血弧菌耐热溶血毒素单克隆抗体。

本发明所要解决的技术问题之二在于利用上述鼠来源杂交瘤细胞系来制备的由该细胞系分泌的抗副溶血弧菌耐热溶血毒素单克隆抗体。

本发明所要解决的技术问题之三在于上述抗副溶血弧菌耐热溶血毒素单克隆抗体的制备方法。

作为本发明第一方面的一种杂交瘤细胞系，该杂交瘤细胞系已于2011年01月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC No.4542，该杂交瘤细胞系的名称为T6D4，分类命名：产抗溶血弧菌耐热直接溶血毒素TDH单克隆抗体细胞株，由源于被纯化的副溶血弧菌免疫过的BalB/c小鼠的B淋巴细胞和小鼠骨髓瘤细胞SP2/0的融合而成。

作为本发明第二方面的一种鼠抗副溶血弧菌耐热溶血毒素的单克隆抗体，由所述杂交瘤细胞系分泌而得，该单克隆抗体可与副溶血弧菌耐热溶血毒素TDH发生免疫反应，经鉴定，蛋白亚型为IgG2a。

作为本发明第三方面的一种鼠抗副溶血弧菌耐热溶血毒素的单克隆抗体的制备方法，是首先通过提取与纯化副溶血弧菌TDH，接着免疫BalB/c小鼠，而后利用B淋巴细胞杂交瘤技术获得一株能够稳定分泌TDH单克隆抗体的杂交瘤细胞系T6D4，其用于致病性副溶血弧菌的快速检测。该抗体为一株稳定鼠源性杂交瘤细胞系所分泌的IgG_2a：能够对TDH发生特异性反应。

所述一种鼠抗副溶血弧菌耐热溶血毒素的单克隆抗体的制备方法，具体步骤如下：

(1)免疫抗原TDH的制备

利用多次层析方法，对以葡萄糖、Na₂HPO₃及胰蛋白胨和NaCl为主要组分的细菌培养液中的TDH进行提取与纯化，作为本发明的免疫抗原；

(2)小鼠免疫和血清效价测定

选择6～8周龄雌性BalB/c小鼠，利用步骤(1)得到的抗原进行免疫，利用间接ELISA方法测定小鼠血清中的抗体效价；

(3)细胞融合与培养

培养小鼠骨髓瘤细胞SP2/0，与免疫小鼠的脾细胞进行混合，在聚乙二醇(PEG)介导下进行细胞融合，在含有HAT的15％FCS选择培养基中进行37℃，5％CO₂培养；

(4)杂交瘤细胞的筛选与克隆化

用间接ELISA方法对培养细胞上清液筛选阳性杂交瘤细胞，用有限稀释法进行克隆化，得到杂交瘤细胞系；

其中，有限稀释法的具体步骤为：对要克隆的细胞进行计数，用细胞培养液进行稀释，稀释到细胞密度为10个/mL，然后加入到96孔板中进行培养，每孔0.1mL。

(5)杂交瘤腹水的制备

将第(4)步克隆的阳性杂交瘤细胞注入灭菌石蜡处理过的小鼠腹腔，获得小鼠腹水；

(6)单克隆抗体特性的鉴定

①抗体亲和力的测定

非竞争性ELISA测定单克隆抗体(mAb)的亲和常数，测定细胞上清液中的抗体密度，利用杂交瘤细胞培养上清液测其亲和常数；

②单克隆抗体免疫球蛋白亚类的鉴定

按照鼠源单克隆抗体亚类鉴定试剂盒(Sigma Chemical Co.)说明书进行；

③单克隆抗体的特异性分析

用弧菌科其他属不同菌株及非致病性副溶血弧菌(无耐热溶菌毒素TDH，含不耐热溶血毒素TLH)菌液包被酶标板，其余步骤按间接ELISA测定有无交叉反应；

④杂交瘤细胞的稳定性测定

将单克隆抗体细胞按照常规法冻存与复苏(司徒镇强等，《细胞培养》)，稳定传代，取细胞上清间接ELISA方法进行效价测定。

本发明具有如下有益效果和实质性特点：

1、技术新颖，安全可靠；

2、本发明可获得副溶血弧菌耐热溶血毒素特异性单克隆抗体及分泌该抗体的杂交瘤细胞，相比以往的多克隆抗体技术，此单克隆抗体根据免疫学原理检测副溶血弧菌时，只会和分泌TDH的致病性副溶血弧菌进行抗体与抗原的反应，对环境中的大部分非致病性副溶血弧菌没有免疫反应，特意识别性更强，且可稳定培养扩增，用其可容易开发定量检测致病性副溶血弧菌耐热溶血毒素的ELISA试剂盒，从而让建立对副溶血弧菌的快速准确检测的免疫学方法成为可能。

3、本发明所制作的抗体对研究副溶血弧菌耐热弧菌溶血毒素的致病机理的研究提供帮助，为控制和治疗副溶血弧菌的感染提供科学依据。

生物材料样品保藏信息如下，

分类命名：产抗溶血弧菌耐热直接溶血毒素TDH单克隆抗体细胞株

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2011年1月13日

附图说明：

图1TDH溶血活性的测定结果示意图。

图2IgG浓度标准曲线示意图。

图3T6D4单抗的亲和力测定结果示意图。

图4T6D4单克隆抗体蛋白亚型鉴定结果示意图。

图5抗体亚类检测试剂盒结果比对图。

具体实施方式：

应理解本发明所述的实施例仅是对本发明的优选实施方式进行的描述，并非对本发明构思和范围进行限定，在不脱离本发明设计思想的前提下，本领域中工程技术人员对本发明的技术方案做出的各种变型和改进，均应落入本发明的保护范围，本发明请求保护的技术内容，已经全部记载在权利要求书中。

实施例1、鼠来源杂交瘤细胞系的建立

(1)免疫抗原TDH的制备

利用多次层析方法，对以葡萄糖、Na₂HPO₃及胰蛋白胨和NaCl为主要组分的细菌培养液中的TDH进行提取与纯化，作为本发明的免疫抗原；

(2)小鼠免疫和血清效价测定

选择6～8周龄雌性小鼠(BalB/c小鼠)，利用步骤(1)得到的抗原进行免疫，利用间接ELISA方法测定小鼠血清中的抗体效价；

(3)细胞融合与培养

培养小鼠骨髓瘤细胞SP2/0，与免疫小鼠的脾细胞进行混合，在聚乙二醇(PEG)介导下进行细胞融合，在含有HAT的15％FCS选择培养基中进行37℃，5％CO₂培养；

(4)杂交瘤细胞的筛选与克隆化

用间接ELISA方法对培养细胞上清液筛选阳性杂交瘤细胞，用有限稀释法行克隆化，得到杂交瘤细胞系；

(5)杂交瘤细胞的稳定性测定

将单克隆抗体细胞按照常规方法冻存与复苏(司徒镇强等，《细胞培养》)稳定传代，取细胞上清间接ELISA方法进行效价测定。

实施例2、抗副溶血弧菌耐热溶血毒素(TDH)单克隆抗体的制备

(1)免疫抗原TDH的制备

①TDH粗蛋白的制作

将致病性副溶血弧菌标准菌株ATCC33846(美国标准菌种收藏所保藏)接种于培养液中，每升培养液含5g葡萄糖、5gNa₂HPO₃，10g胰蛋白胨以及30gNaCl，pH6.5-6.8；在37℃，180转/分，摇床培养15h后，经过离心去除菌体，每升上清液加入351g硫酸铵，盐析，离心，把沉淀溶解于pH7.0的0.01mol/L的磷酸缓冲液中，透析过夜，最后即得TDH的粗蛋白；

②粗蛋白的纯化

A DEAE-纤维素层析

将先前已取得粗蛋白通过DEAE-纤维素层析住(2.6×60)进行纯化。

加样：要层析的样品首先用磷酸盐缓冲液(4℃)平衡过夜；而后将柱的上端打开，用吸管将纤维素柱上面的缓冲液吸出，不要吸净，留一薄层液面，以免空气进入，加入样品，注意不要打乱纤维素表层；拧开下端的螺旋夹，让样品进入交换剂中，当样品将完全进入交换剂中，加入0.2mol/L的NaCl溶液到到达层析柱上沿，拧紧盖子；

洗脱与收集：先用500ml 0.2mol/L NaCl的缓冲液进行洗脱，然后用1000ml的从0.2到1.0mol/LNaCl的同样缓冲液进行梯度洗脱；分管收集并对每管应用考马斯亮蓝法测定其蛋白质浓度，及溶血活性的测试，得到具有溶血活性的洗脱液，测量其体积并以每100ml加入40g硫酸铵的进行盐析；最后的沉淀物用少量的0.0lmol的磷酸盐缓冲液溶解并在同种缓冲液中透析；

B DEAE-葡萄糖A-50层析

小体积的粗蛋白用同样通过E-SephadexA-50层析膜(1.6×60)进行进一步纯化：

加样：方法与DEAE-纤维素层析法相同；

洗脱与收集：洗脱液依次为500ml的0.2mol/L NaCl的磷酸盐缓冲液，800ml的0.2mol/LNaCl到1.0mol/L NaCl的磷酸也缓冲液梯度洗脱；收集具有溶血活性的洗脱液，用PEG-20000把包含TDH的洗脱液浓缩到1.0-2.0ml之间。

C葡聚糖G-75层析

将通过两次层析所得的纯度较高的蛋白经过葡聚糖G-75层析柱(1.6×40)进行进一步纯化；

其平衡液与洗脱液都为0.0lmol/L的tris-HCl缓冲液(pH7.0)；收集洗脱液透析去盐最后冷冻干燥去掉水分至粉末状；即为纯化的TDH，准确称量其质量；

D溶血活性的测定

用兔红细胞悬液测定副溶血弧菌TDH的溶血活性。在96V行孔板中，当底部没有红色沉淀物时即产生了溶血效应，反之，当底部有红色沉淀即为无溶血反应或者溶血反应不强。如图1所示，1、2号孔为纯化后的TDH的溶血反应结果，表明纯化后的TDH具有较强的溶血活性，其余为空白对照。

(2)小鼠免疫和血清效价测定

将制备好的TDH溶解到pH7.40.0lmol\L的PBS中作为免疫原免疫6-8周龄的雌性BalB/c小鼠，具体免疫细节见表1；

表1动物免疫技术细节

首次TDH和等体积的弗氏完全佐剂(Sigma Chemical Co.，下同)乳化免疫，第2次到第5次免疫，用等体积的弗氏不完全佐剂(Sigma Chemical Co.，下同)充分乳化免疫；

从第三次免疫开始，每次免疫之后三天，对免疫小鼠尾静脉取血用间接非竞争性ELISA法检测免疫动物的血清效价。

间接ELISA法步骤：包被：用pH 7.4的0.01mol/L的PBS稀释TDH至10μg/mL，包被96孔酶标板(Corning Co.，下同)，37℃温箱中孵育1h。PBS洗涤4次，拍干；封闭：用封闭液(TBST+2.5％BSA)进行封闭，每孔150μL，37℃温箱中孵育2h.PBS洗涤4次，拍干；抗体检测：在每孔中加入不同稀释度的血清样品，每一稀释度做四个平行，每孔100μL，37℃温箱中孵育1h.同上洗涤拍干；然后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体(Sigma ChemicalCo.，下同)，1∶5000稀释，每孔100μL，37℃温箱孵育1h，同上洗涤拍干；显色：加入OPD(SigmaChemical Co.，下同)底物，每孔100μL，室温避光显色20min；终止：每孔50μL的2mol/L的硫酸终止反应，酶标仪490nm处读数。以OD490nm大于阴性对照2.1倍以上的为阳性。

五次免疫之后五只小鼠均有效价，其中2号和3号效价最高，达1∶40000，细胞融合前3天对这两只小鼠采取腹腔注射加强免疫，剂量为10μg，不加佐剂。

(3)细胞融合与培养

拉颈处死上面一步中效价最高的2号、3号小鼠，取脾脏，分离出脾细胞并与处于对数期状态的小鼠骨髓瘤细胞SP2/0充分混合，在PEG介导下进行细胞融合；

将混合后的细胞悬于含有HAT的15％FCS选择培养基中，加入到饲养细胞已铺好的96孔板中，置37℃，5％CO₂培养箱中培养。

(4)杂交瘤细胞的筛选及克隆

筛选：取96孔板中杂交瘤细胞上清液100μL，用间接ELISA方法检测杂交瘤细胞系。

克隆：取阳性孔中的杂交瘤细胞，用有限稀释法进行克隆化，共进行三次克隆化，最终得到一株杂交瘤细胞系。

(5)杂交瘤细胞腹水的制备

选取8～10周龄的BalB/c小鼠，腹腔注射灭菌液体石蜡，1周后腹腔注射阳性杂交瘤细胞1×10⁶/只，待小鼠行动不便时无菌抽取腹水，离心，去脂，除沉淀，取上清分装备用。

(6)单克隆抗体的纯化

对步骤(5)得到的上清液，用辛酸-饱和硫酸铵法进行纯化，得到抗副溶血弧菌耐热溶血毒素单克隆抗体。

实施例3、单克隆抗体特性的鉴定

①抗体亲和力的测定

ELISA夹心法确定杂交瘤细胞培养上清中的mAb的浓度：取1∶3000稀释的适宜浓度的化兔抗鼠IgG抗体(Sigma Chemical Co.下同)包被酶标板，0.1mL/孔，4℃过夜。洗涤后，封闭液封闭2h，37℃。加入被检杂交瘤细胞上清液和系列稀释的小鼠的IgG纯品(SigmaChemical Co.下同)，0.1mL/孔，37℃孵育1h。洗涤后，加入1∶3000稀释的辣根过氧化物酶HRP标记的兔抗鼠IgG抗体(Sigma Chemical Co.下同)，0.1mL/孔，37℃孵育1h，洗涤后，加入底物液(OPD，Sigma Chemical Co.)，0.1mL/孔，室温避光显色20min。2mol/L硫酸终止反应后，测定各孔495nm的OD值；最后以小鼠IgG纯品的不同浓度为横坐标，以其相应的OD值为纵坐标，绘出标准曲线，根据检测杂家瘤细胞的OD值，确定其中mAb的准确浓度，标准曲线如图2所示；

杂交瘤细胞培养上清液中的mAb的亲和常数测定(ELISA间接法)：取三种倍比稀释的抗原包被酶标板，0.1mL/孔，4℃过夜。洗涤后封闭液封闭2h，37℃。洗涤后，加入系列稀释的一致浓度的被检杂交瘤细胞培养上清液，0.1mL/孔，37℃孵育1h。下地后加入工作浓度的HRP标记兔抗鼠IgG抗体，0.1mL/孔，37℃孵育1h。洗涤后，加入底物液(OPD，Sigma ChemicalCo.)，1mL/孔，室温避光显色20min。2mol/L硫酸终止反应后，测定各孔495nm的OD值。已被检样品不同浓度为横坐标，以其相应OD值为纵坐标，绘制出测定曲线，以各曲线上部趋于平坦的OD值为100％，查出OD值为50％时点的mAb浓度，按照下列公式计算亲和常数K值。

Ka＝(n-1)/2(n[Ab’]t-[Ab]t)

其中n＝[Ag’]t/[Ag]t，[Ag’]t和[Ag]t为不同包被抗原的浓度，[Ab’]t、[Ab]t是对应不同包被抗原的浓度下，将抗体梯度稀释得到最大吸光度一半处的抗体浓度(mol/L)。

结果如图3所示，最后测定计算出T6D4的亲和性常数为0.579×109L/mol。

②单克隆抗体免疫球蛋白亚类的鉴定

利用小鼠单克隆抗体亚型快速鉴定试剂盒(Sigma Chemical Co.，货号：ISOQ5-1KT)测T6D4单克隆抗体蛋白亚型为IgG2a，结果参照图4、图5。

③单抗的特异性分析

用沙门氏菌、大肠杆菌、李氏杆菌、金黄色葡萄球菌、非致病性副溶血弧菌(无TDH，含TLH)的菌液包被酶标板，其余步骤按间接ELISA方法，同时用美国标准菌种收藏所保藏菌株(ATCC33846)细菌裂解液做阳性对照。结果表明T6D4与沙门氏菌及非致病性副溶血弧菌等均不发生交叉反应，说明这株单抗特异性较高。单克隆抗体的特异性试验结果见表2；

表2单克隆抗体的特异性试验结果

④杂交瘤细胞的稳定性

冻存2个月的杂交瘤细胞复苏后，传代稳定。杂交瘤细胞上清与相应抗原反应均呈阳性，且效价与未冻存前基本一致，说明获得的这株杂交瘤细胞能稳定地分泌单克隆抗体(McAb)，结果见表3。

表3单克隆抗体的特异性试验结果

Claims (1)

1.一种杂交瘤细胞系，其特征在于，该杂交瘤细胞系已于2011年01月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.4542，该杂交瘤细胞系的名称为T6D4，通过源于被纯化的副溶血弧菌耐热溶血毒素——TDH免疫过的Ba1B/c小鼠的B淋巴细胞和小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合而成。

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