CN105200013B

CN105200013B - 一株抗万古霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用

Info

Publication number: CN105200013B
Application number: CN201510667232.7A
Authority: CN
Inventors: 匡华; 宋月鸿; 胥传来; 徐丽广; 马伟; 刘丽强; 宋珊珊; 吴晓玲
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2015-10-16
Filing date: 2015-10-16
Publication date: 2018-03-30
Anticipated expiration: 2035-10-16
Also published as: CN105200013A

Abstract

一株抗万古霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫检测领域。本发明的抗万古霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株2A1，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.10869。抗万古霉素单克隆抗体，由所述保藏编号为CGMCC No.10869的杂交瘤细胞株2A1所分泌产生。此细胞株分泌的单克隆抗体，对万古霉素的IC₅₀值为1.45 ng/mL，对去甲万古霉素的IC₅₀值为3.98 ng/mL，可以用于食品中万古霉素和去甲万古霉素的同时检测。

Description

一株抗万古霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用

技术领域

一株抗万古霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，涉及杂交瘤细胞株2A1及其分泌产生的抗万古霉素单克隆抗体，属于食品安全免疫检测领域。

背景技术

万古霉素(VAN)，英文名称为Vancomycin，是由McCormick等于 1956 年从一株东方拟无枝酸菌 (Amycolatopsis orientalis) 的发酵液中分离得到的一种糖肽类抗生素，1958年11月份获美国FDA 批准，由Eli Lilly公司开发上市，商品名为“稳可信(Vancocin)”。盐酸万古霉素分子式为C₆₆H₇₆Cl₃N₉O₂₄，CAS号为1404-90-6，分子量为1485.71。国内由放线菌东方23号所产生的主要为去甲基万古霉素(NVAN)，英文名称为Norvancomycin，于1967年投入临床使用。两者都是用于治疗由革兰氏阳性菌所引发的感染性疾病。其作用机制是通过同时抑制细菌细胞壁生物合成中的两步酶促反应，即转糖基作用（肽聚糖的延伸）和转肽作用（肽链的交联）或其中的任何一步，达到阻止细胞壁合成的目的，从而导致细胞死亡。

肾毒性和耳毒性是早前生产的不纯的万古霉素产生的副反应，这些副反应在50年代中期进行的万古霉素临床试验中显得尤其严重。且万古霉素口服无法吸收，必须在溶剂稀释的条件下缓慢给药，以避免局部疼痛和血栓静脉炎的发生，以及一些输液反应如红人综合症。因此万古霉素仅作为保留药物治疗由少数金黄色葡萄球菌引起的严重感染性疾病。但由于β-内酰胺类抗生素的大量使用，导致了甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)的产生，MRSA成为了地方性流行性疾病，以及万古霉素纯化工艺的改善，使得万古霉素成为了治疗MRSA的特效药物。但在1989年，美国首次报道了万古霉素耐药菌(Vancomycin-resistant enterococci ,VRE)。预防和控制万古霉素耐药菌的扩散需要各方面的协调努力。包括临床医生谨慎使用万古霉素，及早的检测出具有耐药性的肠球菌及其他一些革兰氏阳性菌等。我国的兽药地方标准废止目录中在禁用兽药一项中规定抗生素类药物万古霉素及其盐、酯及制剂不得检出。

农业部1862号规定中利用液相色谱-串联质谱法测定饲料中的万古霉素。其他检测方法还有固相萃取-高效液相色谱法(SPE-HPLC)与荧光偏振免疫法(FPIA)相结合的方法；反相高效液相色谱(RP-HPLC)测定法；高效液相色谱法(HPLC)，但这些方法由于前处理过程繁琐、耗时较长，要专门的仪器及耗材，费用较贵，并不适合临床应用。微生物分析方法测定抗生素含量是一种经典的方法，样品无需作繁琐处理，且对仪器设备要求不高。但微生物法测定易受合并应用其他抗生素的影响。而免疫分析方法具有低成本、高通量、高灵敏、对技术人员相对要求低等特点，因此适用于大量样品的快速筛查。本发明在于提供一种能产生对万古霉素具有较高亲和力和检测灵敏度的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，为间接竞争ELISA 试剂盒以及胶体金试纸条的研发推广奠定基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种抗万古霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株，由该细胞株制备的抗体对万古霉素和去甲万古霉素具有较好的亲和力和检测灵敏度，可以用来建立万古霉素和去甲万古霉素酶联免疫检测方法，或建立胶体金免疫层析技术快速检测方法。

本发明的技术方案：一株抗万古霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株，其命名为2A1，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.10869。

抗万古霉素单克隆抗体，它由所述保藏编号为CGMCC No.10869的杂交瘤细胞株2A1所分泌产生。所述的抗万古霉素单克隆抗体的应用，其在食品中万古霉素和去甲万古霉素残留量的分析检测中的应用。

本发明提供的杂交瘤细胞株2A1细胞株的制备基本步骤为：

（1）免疫原的制备与鉴定：利用活泼酯法，使万古霉素盐酸盐的羧基与载体蛋白BSA的氨基相连制备免疫原；利用高碘酸钠法，使万古霉素的葡萄糖基的邻二醇结构在高碘酸钠的作用下氧化生成醛基，再与载体蛋白OVA的氨基反应生成Schiff氏碱以制备包被原，反应结束后，通过透析分离完全抗原与未偶联的小分子半抗原，完全抗原通过紫外吸收扫描方法鉴定；

（2）小鼠的免疫：将抗原与福氏佐剂乳化完全后，通过皮下多点注射免疫BALB/c小鼠。首次免疫采用福氏完全佐剂，加强免疫使用福氏不完全佐剂，冲刺免疫时免疫剂量为前一次免疫剂量的一半，与生理盐水混合均匀后直接进行腹腔注射；各次免疫间隔为三周。第三次免疫后，间隔一周采血检测血清效价和抑制，根据小鼠血清的检测结果，确定加强免疫的次数；

（3）细胞融合与细胞株建立：通过聚乙二醇（PEG4000）法，使小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合，融合后细胞用HAT培养基培养，第三天进行HAT半换液，第五天HAT全换液，第七天取出细胞上清液利用间接ELISA检测阳性细胞孔，并进一步利用间接竞争ELISA法测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制的阳性细胞孔进行三次亚克隆，最终筛选获得稳定的杂交瘤细胞株2A1；

（4）杂交瘤细胞株性质的鉴定：采用小鼠单抗Ig类/亚类鉴定用酶标二抗套装测定；IC₅₀值、交叉反应率及亲和力的测定通过ELISA法。

本发明的有益效果在于：（1）本发明获得的抗万古霉素单克隆抗体细胞株，可以达到同时检测万古霉素和去甲万古霉素的目的。（2）选择两种偶联方法合成了免疫原和包被原，利用了万古霉素不同的连接位点，以达到更高的检测灵敏度。

生物材料样品保藏：一株抗万古霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株2A1，分类命名为单克隆细胞株，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.10869，保藏日期2015年05月 19日。

附图说明

图1免疫原的紫外吸收光谱表征。

图2包被原的紫外吸收光谱表征。

图3杂交瘤细胞株2A1单克隆抗体对万古霉素和去甲万古霉素的标准曲线。

具体实施方式

本发明下面的实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不作为本发明的限定内容或范围。下面通过实施例对本发明作进一步说明。

本发明通过将制备的万古霉素免疫原免疫小鼠，选择效价和抑制效果最好的小鼠进行细胞融合，利用HAT选择性培养基筛选杂交瘤细胞，通过间接ELISA和间接竞争ELISA筛选细胞上清，得到对万古霉素抑制效果最好的杂交瘤细胞孔，通过对该孔的细胞三次亚克隆，最终得到了能分泌对万古霉素有较好亲和力和灵敏度的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

实施例 1 ：杂交瘤细胞株2A1的制备

1、完全抗原的合成

取7.0mg万古霉素盐酸盐，再加入2.0mg EDC和1.0mg NHS，使用400μL DMF，200μLMES缓冲液溶解，室温搅拌，活化4 h；另取5 mg BSA溶解于2mL、0.05 M、pH9.6的CB溶液中，将上述活化后的万古霉素溶液慢速逐滴加入BSA溶液中，室温搅拌反应过夜后，4℃透析三天，-20℃分装保存得到免疫原。取5mg万古霉素盐酸盐溶于水中，加入新鲜配置的2.5mgNaIO₄水溶液，冰浴活化30min，将上述活化后的万古霉素溶液慢速逐滴加入溶解于2mL、0.05 M、pH9.6的CB溶液中的5 mg OVA溶液中，4℃反应2h，再加入0.5mg NaBH₄，4℃还原2h，4℃透析三天，-20℃分装保存得到包被原。

2、动物免疫

选择健康的6～8周龄的Balb/C小鼠进行免疫。取万古霉素完全抗原(1 mg/mL)与等量福氏佐剂乳化均匀后，通过皮下多点注射免疫BALB/c小鼠，每只100μL。首次免疫采用福氏完全佐剂，加强免疫使用福氏不完全佐剂，冲刺免疫时免疫剂量为前一次免疫剂量的一半，与生理盐水混合均匀后直接进行腹腔注射；各次免疫间隔为三周。第三次免疫后，间隔一周采血检测血清效价和抑制；由五免检测结果挑选出抑制效果最好的小鼠，进行腹部注射冲刺免疫，间隔上一次免疫时间为三周，并准备融合。

3、细胞融合在冲刺免疫三天后，按照常规PEG（聚乙二醇，分子量为4000）方法进行细胞融合，具体步骤如下：（1）无菌取出小鼠脾脏，研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，三次离心后，用RPMI-1640基础培养液重悬并进行细胞计数；（2）收集SP2/0细胞，离心后再用RPMI-1640基础培养液重悬，并进行细胞计数；（3）将脾细胞和SP2/0细胞按照5~10︰1的计数比例混合，离心后用PEG融合，时间1 min，之后按照从慢到快，加入RPMI-1640基础培养液，离心后悬浮于含20% 胎牛血清、2%的50×HAT的RPMI-1640筛选培养液中，加到96孔细胞培养板，置于37℃、5% CO₂的培养箱中培养。

4、细胞筛选与细胞株建立

在细胞融合的第三天对融合细胞用含20%胎牛血清、2%的50×HAT的RPMI-164筛选培养液进行半换液，第5天进行用含20%胎牛血清、1%的100×HT的RPMI-1640过渡培养液进行全换液，在第7天取细胞上清进行筛选。筛选分两步：第一步先用间接ELISA筛选出阳性细胞孔，第二步选用万古霉素为标准品，用间接竞争ELISA对阳性细胞进行抑制效果测定。选择对万古霉素有较好抑制的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，用同样的方法进行检测。重复三次，获得细胞株2A1。

5、单克隆抗体的制备与鉴定

取8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射石蜡油1 mL；7天后每只小鼠腹腔注射1×10⁶杂交瘤细胞2A1，从第七天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-饱和硫酸铵法纯化，获得的单抗置于 -20℃保存。

使用小鼠单抗亚型鉴定试剂盒对腹水纯化获得的单克隆抗体进行免疫球蛋白亚型鉴定，其亚型为 IgG2b型。

使用间接竞争ELISA和间接ELISA，测定单克隆抗体对万古霉素，去甲万古霉素的IC₅₀分别为1.45ng/mL，3.98ng/mL，交叉反应率为36.43%。可用于食品中万古霉素和去甲万古霉素的快速检测。

实施例2 抗万古霉素单克隆抗体的应用

将杂交瘤细胞株2A1通过体内腹水制备的单克隆抗体应用于万古霉素的ELISA添加回收试验，具体步骤如下：

（1）用碳酸盐缓冲液（CBS）稀释好的0.5μg/mL的包被原包被96孔酶标板，每孔100μL，37℃包被2 h后，用PBST洗液洗板三次，每次每孔250μL，每次3 min，拍干；

（2）用含0.2%明胶的CBS进行封闭，每孔200μL，37℃封闭2 h，用PBST洗液洗板三次，每次每孔250μL，每次3 min，拍干；

（3）用磷酸盐缓冲液（PBS）分别配置0，0.2，0.5，1，2，5，10，20ng/mL的万古霉素；0，0.5，1，2，5，10，20，50ng/mL的去甲万古霉素标准溶液。将标准溶液以及待检测样品提取液，分别加入到已经封闭好的酶标板中，每孔50μL，每个样品重复3个孔，再每孔加入50μL、0.25μg/mL的抗万古霉素单克隆抗体，37℃反应0.5h后，洗板拍干；

（4）每孔加入100 μL 用含0.1% 明胶的PBS 1︰3000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG二抗，37℃反应0.5h后，洗板拍干；

（5）每孔加入100μL TMB显色液，37℃显色15 min后，每孔加入50μL 2M H₂SO₄终止液，450 nm测吸光值；

（6）添加回收及样品前处理：称取2g饲料样品，利用粉碎机粉碎，置入50mL离心管中，分别添加10 ng、20ng及30ng 万古霉素。向样品加入17mL PBS和3mL乙腈的混合溶液，超声10min，漩涡混合10min，8000rpm离心10min，取上清过0.22μm滤膜进行ELISA检测，其回收率分别为92.11%，107.24%，113.24%。添加回收实验的稀释倍数为10倍。

溶液的配置：

碳酸盐缓冲液（CBS）：称取Na₂CO₃ 1.59g，NaHCO₃ 2.93g，分别溶于少量双蒸水后混合，加双蒸水至约800mL混匀，调pH至9.6，加双蒸水定容至1000mL，4℃贮存备用；

磷酸盐缓冲液（PBS）：8.00 g NaCl，0.2 g KCl，0.24 g KH₂PO₄，3.62 g Na₂HPO₄·12 H₂O，溶于800 mL纯水中，用NaOH或HCl调pH到7.2～7.4，定容至1000 mL；

PBST：含0.05% Tween 20的PBS；

TMB显色液：A液：Na₂HPO₄·12H₂O 18.43g，柠檬酸 9.33g，纯水定容至1000 mL；B液：60 mg TMB 溶于100 mL乙二醇中。A、B液按1︰5体积混合即为TMB显色液，现用现混。

实施例3 杂交瘤细胞株2A1单克隆抗体的亚型鉴定。

使用小鼠单抗Ig类/亚类鉴定用酶标二抗套装测定单克隆抗体的亚型。

表1 2A1单克隆抗体的亚型鉴定

由试剂盒测定结果得知，抗体亚型为IgG2b。

实施例4

杂交瘤细胞株2A1单克隆抗体对万古霉素，去甲万古霉素的IC₅₀及交叉反应率。如表2所示。

表2 2A1对VAN，NVAN的IC50及交叉反应率

	IC₅₀(ng/mL)	交叉反应率
			VAN	1.45	100.00%
NVAN	3.98	36.43%

综上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用来限定本发明的实施范围。即凡依本发明申请范围的内容所作的等效变化与修饰，都应为本发明的技术范畴。

Claims

1.一株抗万古霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株，其命名为2A1，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.10869。

2.抗万古霉素单克隆抗体，其特征在于：它由权利要求1所述保藏编号为CGMCCNo.10869的杂交瘤细胞株2A1所分泌产生。

3.权利要求2所述的抗万古霉素单克隆抗体的应用，其特征在于：其在食品中万古霉素和去甲万古霉素残留量的分析检测中的应用。