CN105505886B - 一株特异性抗头孢噻呋单克隆抗体杂交瘤细胞株2e5及其应用 - Google Patents

一株特异性抗头孢噻呋单克隆抗体杂交瘤细胞株2e5及其应用 Download PDF

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Abstract

一株特异性抗头孢噻呋单克隆抗体杂交瘤细胞株2E5及其应用，属于食品安全免疫检测技术领域。本发明单克隆细胞株2E5已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号为CGMCC No.10873。本发明采用活化酯法将原药头孢噻呋与BSA偶联制备免疫原，头孢噻呋与OVA偶联制备包被原。对小鼠进行免疫后得到一株特异性抗头孢噻呋杂交瘤细胞株。此细胞株分泌的单克隆抗体，仅特异性针对头孢噻呋，与其他头孢类抗生素头孢氨苄、头孢喹肟的交叉率分别为3.12%、5.3%，与其它头孢类抗菌素的交叉率均小于0.1%，因此具有很高的特异性。本发明获得的抗头孢噻呋单克隆抗体杂交瘤细胞株，不仅有较好的检测灵敏度和亲和力，且对其它头孢类抗菌素的交叉反应率低，可以达到特异性检测头孢噻呋的目的。本发明还提供了一种新的制备针对特定头孢菌素特异性抗体的思路，得到很好的特异性单克隆细胞株。

Description

一株特异性抗头孢噻呋单克隆抗体杂交瘤细胞株2E5及其 应用
技术领域
本发明涉及一株特异性抗头孢噻呋单克隆抗体杂交瘤细胞株2E5及其应用，属于食品安全免疫检测技术领域。
背景技术
头孢噻呋(EFT)，英文名称为ceftiofur，分子式为C19H17N5O7S3，分子量为523.56，化学名称为(6R,7R)-7-[2-(2-氨基噻唑-4-基)(甲氧基亚胺基)乙酰胺基]-3-[(2-呋喃基羰基)硫甲基]-8-氧代-5-硫杂-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2-烯-2-甲酸。CAS登录号为80370-57-6。头孢噻呋为抗微生物药，是头孢菌素类半合成的第三代动物专用头孢菌素。
头孢噻呋是第一个动物专用的头孢菌素类抗生素。其母核是由头孢菌素C裂解而获得的7-氨基头孢烷酸(7-ACA)。具广谱杀菌作用，对革兰氏阳性，革兰氏阴性包括产内酰胺酶菌株均有效。抗菌活性比氨苄西林强，对链球菌的活性也比喹诺酮类抗菌药强。由于其优良的抗菌活性和药动力学特点，陆续被美国、加拿大、日本及欧洲一些国家正式批准用于肉牛、奶牛、马、猪、羊的呼吸道疾病的治疗，显示了其在兽医临床应用的广阔前景。
一般来说，头孢噻呋对各种动物的毒副作用较为轻微，大多数动物多可耐受，无需停药。少数动物可能出现皮疹、瘙痒等不良症状，偶见极度过敏现象。另一方面，长期食用头孢噻呋残留的动物性食品还可引起细菌耐药性，造成人体微生物环境平衡紊乱和失调。由于头孢噻呋被广泛用于治疗牛乳腺炎和其它乳牛疾病，该药物在乳汁中的残留也会给乳制品的质量带来严重影响。此外，头孢噻呋主要排泄途径为肾脏，所以肾毒性较强。欧盟颁布头孢噻呋最大残留限量在牛奶中最低，限量不得超过100μg/kg。所以有必要建立头孢噻呋的快速检测方法。
目前头孢噻呋的检测方法主要是仪器检测方法和免疫分析检测方法，仪器检测方法仪器成本高，操作复杂，需要专职人员操作，而免疫分析方法具有低成本、高通量、高灵敏、对技术人员相对要求低等特点，因此适用于大量样品的快速筛查。
发明内容
本发明的目的提供一株特异性抗头孢噻呋单克隆抗体杂交瘤细胞株，由该细胞株制备的抗体对头孢噻呋具有较好的亲和力和检测灵敏度，可以用来建立头孢噻呋酶联免疫检测方法，或建立胶体金免疫层析技术快速检测方法。
本发明的技术方案，一株特异性抗头孢噻呋单克隆抗体杂交瘤细胞株2E5，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号为CGMCCNo.10873。
抗头孢噻呋单克隆抗体，它由所述保藏编号为CGMCC No. 10873的特异性抗头孢噻呋单克隆抗体杂交瘤细胞株2E5分泌产生。
所述抗头孢噻呋单克隆抗体的应用，其在食品安全中头孢噻呋残留检测中的应用。
本发明提供的杂交瘤细胞株2E5细胞株的制备基本步骤为：
（1）免疫原的制备与鉴定：头孢噻呋通过活化酯法与蛋白载体的氨基相连，反应结束后，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原，完全抗原通过SDS-PAGE凝胶电泳表征；
（2）小鼠的免疫：将抗原与福氏佐剂乳化完全后，通过皮下多点注射免疫BALB/c小鼠。首次免疫采用福氏完全佐剂，加强免疫使用福氏不完全佐剂，冲刺免疫时免疫剂量为前一次免疫剂量的一半，与生理盐水混合均匀后直接进行腹腔注射；各次免疫间隔为三周。第三次免疫后，间隔一周采血检测血清效价和抑制；
（3）细胞融合与细胞株建立：通过聚乙二醇（PEG 4000）法，使小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合，通过HAT培养基培养，利用间接ELISA检测阳性细胞孔，并进一步利用间接竞争ELISA法测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制的阳性细胞孔进行三次亚克隆，最终筛选获得杂交瘤细胞株2E5；
（4）杂交瘤细胞株性质的鉴定：采用小鼠单抗Ig类/亚类鉴定用酶标二抗套装测定；IC50值、交叉反应率和亲和力的测定通过ELISA法。
本发明的有益效果：本发明获得的抗头孢噻呋单克隆抗体杂交瘤细胞株，不仅有较好的检测灵敏度和亲和力，且对其它头孢类抗菌素的交叉反应率低，可以达到特异性检测头孢噻呋的目的。本发明一种新的制备针对特定头孢菌素特异性抗体的思路，得到很好的特异性单克隆抗体细胞株。
生物材料样品保藏：一株特异性抗头孢噻呋单克隆细胞株2E5，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期2015年5月 19日，保藏编号为CGMCC No.10873。
附图说明
图1是免疫原的SDS-PAGE凝胶电泳表征。1、BSA，2、EFT-EDC-BSA (EFT︰BSA摩尔比=120︰1)，3、EFT-EDC-BSA (EFT︰BSA摩尔比=100︰1)，4、EFT-EDC-BSA (EFT︰BSA摩尔比=80︰1)。
图2是2E5单克隆抗体对头孢噻呋EFT的标准曲线。
具体实施方式
本发明下面的实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不作为本发明的限定内容或范围。下面通过实施例对本发明作进一步说明。
本发明通过将EFT完全抗原免疫小鼠，通过细胞融合，HAT选择性培养基培养，通过间接ELISA和间接竞争ELISA筛选细胞上清，最终得到了对EFT有较好亲和力和灵敏度的单克隆抗体杂交瘤细胞株。
实施例 1 杂交瘤细胞株2E5的制备
（1）完全抗原的合成：取4.5mg EFT，再加入2.0mg EDC和1.0mg NHS，使用DMF溶解，室温搅拌，活化4h；另取5 mg BSA溶解于2mL、0.05 M、pH9.6的CB溶液中，将上述活化后的头孢噻呋溶液慢速逐滴加入BSA的CB溶液中，室温搅拌反应过夜后，4℃透析三天，得免疫原，-20℃分装保存。
（2）动物免疫：选择健康的6～8周龄的BALB/c小鼠进行免疫。取头孢噻呋完全抗原（1mg/mL）与等量福氏佐剂乳化均匀后，通过皮下多点注射免疫BALB/c小鼠，每只100μL。首次免疫采用福氏完全佐剂，加强免疫使用福氏不完全佐剂，冲刺免疫时免疫剂量为前一次免疫剂量的一半，与生理盐水混合均匀后直接进行腹腔注射；各次免疫间隔为三周。第三次免疫后，间隔一周采血检测血清效价和抑制；选择抑制最好的小鼠，在五免后21天冲刺免疫，准备融合。
（3）细胞融合：在冲刺免疫三天后，按照常规PEG（聚乙二醇，分子量为4000）方法进行细胞融合，具体步骤如下：
a、无菌取小鼠脾脏，研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，并进行细胞计数；
b、收集SP2/0细胞，悬浮于RPMI-1640基础培养液中，进行细胞计数；
c、将脾细胞和SP2/0细胞按照5~10:1的计数比例混合，离心后用PEG融合，时间1min，之后按照从慢到快，加入RPMI-1640基础培养液，离心后悬浮于含体积百分比为20%胎牛血清、2%的50×HAT的RPMI-1640筛选培养液中，加到96孔细胞培养板，置于37℃，体积浓度为5% CO2的培养箱中培养。
（4）细胞筛选与细胞株建立：在细胞融合的第三天对融合细胞进行RPMI-1640筛选培养液半换液，第5天进行用含体积百分比为20%胎牛血清、1%的100×HT的RPMI-1640过渡培养液进行全换液，在第7天取细胞上清进行筛选。筛选分两步：第一步先用间接ELISA筛选出阳性细胞孔，第二步选用EFT、头孢氨苄（CEX）、头孢喹肟（CEF）和其它结构类似头孢菌素为标准品，用间接竞争ELISA对阳性细胞进行抑制效果测定。选择对EFT有较好抑制且对其它结构类似头孢菌素抑制不好的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，用同样的方法进行检测。重复三次，获得细胞株2E5。
实施例2 单克隆抗体的制备与鉴定
取8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射石蜡油1mL；7天后每只小鼠腹腔注射1×106杂交瘤细胞2E5，从第七天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-饱和硫酸铵法纯化，获得的单抗置于-20℃保存。
使用小鼠单抗亚型鉴定试剂盒对腹水纯化获得的单克隆抗体进行免疫球蛋白亚型鉴定，如表1所示，其亚型为IgG2b型。
表1
使用间接竞争ELISA和间接ELISA，测定单克隆抗体对EFT、CEX和CEF的IC50分别为2.4ng/mL，76.9ng/mL和45.28ng/mL，交叉反应率均小于10%。可用于头孢噻呋的特异性快速检测。
实施例3 抗体应用
将杂交瘤细胞株2E5通过体内腹水制备的单克隆抗体应用于头孢噻呋ELISA添加回收试验，具体步骤如下：
a、用碳酸盐缓冲液（CBS）稀释好的0.5μg/mL EFT-EDC-OVA作为包被原包被96孔酶标板，每孔100μL，37℃包被2h后，用PBST洗液洗板三次，每次每孔250μL，每次3 min，拍干；
b、用含0.2%明胶的CBS进行封闭，每孔200μL，37℃封闭2 h，用PBST洗液洗板三次，每次每孔250μL，每次3 min，拍干；
c、用磷酸盐缓冲液（PBS）分别配置0，0.2，0.5，1，2，5，10，20ng/mL的头孢噻呋标准溶液。将标准溶液以及待检测样品提取液，分别加入到已经封闭好的酶标板中，每孔50μL，每个样品重复3个孔，再每孔加入50μL 1︰16000稀释的抗头孢噻呋单克隆抗体，37℃反应0.5h后，洗板拍干；
d、每孔加入100 μL 用含0.1% 明胶的PBS 1︰3000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG二抗，37℃反应0.5h后，洗板拍干；
e、每孔加入100μL TMB显色液，37℃显色15 min后，每孔加入50μL、2M H2SO4终止液，450 nm测吸光值；
f、添加回收及样品前处理：秤取1g奶粉样品至于15mL聚四氟乙烯离心管中，分别添加150ng、300ng及600ngEFT。加提取液（1000mL 0.2M磷酸氢二钠和625mL 0.1M柠檬酸混合）10mL。5000r/min离心10min，取上清3mL加1M NaOH 330μL调pH至7左右待测。用样品稀释液（0.01M PBS）稀释5倍后，作为ELISA样品提取液，采用间接竞争ELISA进行添加回收试验，其回收率分别为96.71%，86.74%，78%。
溶液的配置：
碳酸盐缓冲液（CBS）：称取Na2CO3 1.59g，NaHCO3 2.93g，分别溶于少量双蒸水后混合，加双蒸水至约800mL混匀，调pH至9.6，加双蒸水定容至1000mL，4℃贮存备用；
磷酸盐缓冲液（PBS）：8.00g NaCl，0.2g KCl，0.24g KH2PO4，3.62g Na2HPO4·12H2O，溶于800mL纯水中，用NaOH或HCl调pH到7.2～7.4，定容至1000mL；
PBST：含体积浓度为0.05%的Tween 20的PBS；
TMB显色液：A液：Na2HPO4·12H2O 18.43g，柠檬酸 9.33g，纯水定容至1000mL；B液：60 mg TMB 溶于100mL乙二醇中。A、B液按体积比1︰5混合即为TMB显色液，现用现混。
综上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用来限定本发明的实施范围。即凡依本发明申请范围的内容所作的等效变化与修饰，都应为本发明的技术范畴。

Claims (3)

1.一株特异性抗头孢噻呋单克隆抗体杂交瘤细胞株2E5，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号为CGMCC No.10873。
2.抗头孢噻呋单克隆抗体，其特征在于：它由权利要求1所述保藏编号为CGMCC No.10873的特异性抗头孢噻呋单克隆抗体杂交瘤细胞株2E5分泌产生。
3.权利要求2所述抗头孢噻呋单克隆抗体的应用，其特征在于：其在食品安全中头孢噻呋残留检测中的应用。
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