CN104558187B - 用于检测头孢菌素类抗生素的单克隆抗体及酶联免疫方法与试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗头孢噻呋、头孢曲松等多种头孢菌素类抗生素的特异性单克隆抗体，本发明还公开了一种用于检测头孢噻呋、头孢曲松等多种头孢菌素类抗生素的酶联免疫方法及试剂盒。本发明的单克隆抗体是由保藏号为CCTCC NO:C201341的杂交瘤细胞4D5所分泌的。与现有技术相比，本发明制备的单克隆抗体可以同时识别头孢噻呋、头孢曲松等多种头孢菌素类抗生素，本发明的酶联免疫方法与试剂盒具有检测效率和灵敏度高，精密度和准确度好等优点。

Description

用于检测头孢菌素类抗生素的单克隆抗体及酶联免疫方法与 试剂盒

技术领域

本发明属于药物残留分析和免疫学技术领域，具体涉及一种抗头孢噻呋、头孢曲松等多种头孢菌素类抗生素的单克隆抗体，本发明还涉及用于检测头孢噻呋、头孢曲松等多种头孢菌素类抗生素的酶联免疫方法(ELISA)与试剂盒。

背景技术

头孢噻呋、头孢曲松等头孢菌素类抗生素，具有β-内酰胺的基本结构，抗菌谱较广，常用于预防和治疗细菌感染，在兽医临床和养殖业得到了广泛应用。人们为了追求经济利益而滥用药物，导致药物在动物食品中大量残留。人类食用含有药物的食品后，对机体产生一系列损伤作用，如产生过敏反应，严重时发生休克甚至死亡，药物进入胃肠道后打破菌群平衡，同时也会增加细菌的耐药性，导致临床用药的失败。

现已发展了多种用于检测该类药物的方法，如微生物方法、仪器方法及酶联免疫方法。微生物法被用于大量样品的初步筛选，仪器方法常用于对阳性样品的确证，ELISA方法既可以定性也可以半定量。在这些残留分析方法中，仪器方法由于其所需仪器昂贵、操作复杂、检测费用高，而不利于大批量样品的筛选及现场检测。微生物法虽在残留筛选高通量上表现出良好的性能，但方法缺乏特异性，不能确证残留物的种类，且所用细菌对不同种类的抗菌药物敏感性存在差异，易导致假阴性和假阳性结果的产生。而ELISA方法操作简便、高通量、高灵敏度、低费用，能很好的克服仪器方法和微生物方法的缺陷。现有的头孢菌素抗生素残留酶联免疫检测方法仅能检测1～3种头孢菌素抗生素，所以建立一种能同时检测更多常用头孢类药物残留的ELISA方法十分必要。

CN 101571539A公开了一种检测头孢类药物的酶联免疫试剂盒，它采用头孢噻呋和6-氨基正己酸反应得到的头孢噻呋正己酸酯为半抗原，制得的单克隆抗体能识别头孢噻呋、头孢曲松和头孢噻肟，但不能识别其它头孢菌素类抗生素，识别的药物种类仍不够。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种能同时识别头孢噻呋、头孢曲松、脱呋喃甲酰头孢噻呋、头孢噻肟和头孢喹肟五种头孢菌素类抗生素的单克隆抗体。

本发明的第二个目的是利用该单克隆抗体，制备一种用于检测以上五种头孢菌素类抗生素的酶联免疫试剂盒。

本发明的第三个目的是利用该试剂盒，建立一种用于以上五种头孢菌素类抗生素非诊断目的检测的酶联免疫方法。

上述目的是通过以下技术方案实现的：

一种能识别头孢菌素类抗生素的单克隆抗体，它是由保藏号为CCTCC NO:C201341的杂交瘤细胞4D5所分泌的。

所述的头孢菌素类抗生素，指的是头孢噻呋、头孢曲松、脱呋喃甲酰头孢噻呋、头孢噻肟和头孢喹肟。

上述杂交瘤细胞4D5，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:C201341。

制备所述单克隆抗体所用的免疫原是由半抗原头孢噻呋与人血清白蛋白偶联而成的。

进一步，本发明提供了一种同时检测食物中头孢菌素类抗生素残留的酶联免疫方法，该方法包括以下步骤：

(1)将头孢噻呋采用碳二亚胺法(EDC法)与卵清白蛋白(OVA)偶联得到包被原(头孢噻呋-OVA)；

(2)用保藏号为CCTCC NO:C201341的杂交瘤细胞4D5制备单克隆抗体；

(3)用步骤(1)的包被原包被固相载体；

(4)将待测样品提取后进行酶联免疫检测。

优选地，所述待测样品的提取方法是：

牛奶：量取牛奶1mL，室温4000rpm离心10min，取中间层，用体积比为PBS缓冲液∶甲醇＝9∶1的稀释液稀释40倍后直接上样检测；

肉类：称取肉类样品均质物2g，加入PBS缓冲液10mL，剧烈振荡5min后，室温4000rpm离心10min；取上清中间层，用PBS缓冲液稀释8倍后上样检测。

本发明以上述单克隆抗体和包被原作为核心试剂与常规的其它试剂组合，制成了能检测头孢噻呋、头孢曲松、脱呋喃甲酰头孢噻呋、头孢噻肟和头孢喹肟五种头孢菌素类抗生素的酶联免疫试剂盒，结合上述酶联免疫方法，实现了对以上五种头孢菌素类抗生素的酶联免疫检测。

本发明的主要优点是：

1.本发明在抗体制备时，采用头孢噻呋作为半抗原，该半抗原体现了几种常见头孢菌素类抗生素所共有的化学结构，由该半抗原制备的单克隆抗体可同时识别头孢噻呋、头孢曲松等多种头孢菌素类抗生素，而现有的单克隆抗体无法同时识别以上药物。

2.本发明制备的单克隆抗体对以上五种头孢菌素类抗生素有较高的识别灵敏度，头孢噻呋的IC₅₀仅为2.45μg/L，头孢曲松的IC₅₀仅为2.61μg/L，脱呋喃甲酰头孢噻呋为2.96μg/L，识别灵敏度优于现有的大多数头孢菌素类单克隆抗体。而且对以上三种头孢菌素类药物均有较高的交叉反应率，对其它药物的交叉反应率很低，说明具有较好的特异性。

3.本发明建立的ELISA方法和试剂盒能同时检测牛奶或肉类产品中头孢噻呋、头孢曲松等多种头孢菌素类抗生素的药物残留，方法准确度高，精密度好，一次测定即可完成，与现有的方法相比，在检测药物的种类和效率上具有明显的优势，可以节省大量的时间和成本，具有更好的市场价值。

4.方法中所涉及的样品处理方法简单，易操作，样品处理所用的有机试剂对操作者身体健康危害相对小。

附图说明

图1为本发明所使用的半抗原(头孢噻呋)、人血清白蛋白(HSA)和免疫原(头孢噻呋-HSA偶联物)的紫外扫描图谱。

图2为本发明所使用的半抗原(头孢噻呋)、卵清白蛋白(OVA)和包被原(头孢噻呋-OVA偶联物)的紫外扫描图谱。

图3为本发明的单克隆抗体与头孢噻呋标准品的间接竞争ELISA反应曲线，X轴为头孢噻呋标准溶液浓度对数值，Y轴为头孢噻呋标准品溶液的光密度值除以“零”孔光密度值(B/B0)。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步说明，但不限制本发明。

实施例1免疫原和包被原的制备

1.1免疫原的制备

取头孢噻呋50mg溶于二甲基甲酰胺(DMF)1mL中，为A液。称取HSA 66mg溶于PBS10mL中，为B液。分别N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)20mg和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)10mg加入A液，室温条件下反应24h，反应完成后离心除去沉淀，将上清缓慢滴入B液中，冰浴反应24h。反应完成后，将反应液转入透析袋中，4℃PBS中透析3d，每4-6h更换一次透析液，透析完后将样品冷冻干燥，即得偶联物头孢噻呋–HSA，置-20℃保存。

1.2包被原的制备

取OVA 120mg溶于8mL碳酸盐缓冲液(CBS)中，为A液。头孢噻呋50mg溶于2mL CBS中，为B液。另取EDC 120.0mg和NHS 60mg溶解在1mLCBS中为C液。冰浴，磁力搅拌下将C液逐滴加入到B液中，冰浴反应4h，然后将混合液逐滴加入A液中，冰浴反应12h。反应完成后，将反应液转入透析袋中，4℃PBS中透析3d，每4-6h更换一次透析液，透析完后将样品冷冻干燥，即得偶联物头孢噻呋–OVA，置-20℃保存。

实施例2单克隆抗体的制备

杂交瘤细胞的制备：参照杨汉春《动物免疫学》，以实施例1制备的免疫原头孢噻呋-HSA偶联物免疫Balb/C小鼠(购自湖北省医学科学院实验动物中心)。免疫程序为：基础免疫用与等体积的弗氏完全佐剂乳化的含100μg免疫原的蛋白乳液注射于小鼠的颈背部皮下；以后每隔15天用弗氏不完全佐剂乳化的含100μg免疫原的蛋白乳液进行加强免疫。从免疫三次起，每次免疫后第8天采尾血，分离血清，间接ELISA法检测血清抗体效价。免疫合格的小鼠(效价高、灵敏度好)停止免疫以备融合。融合时，取经最后强化免疫的Balb/C鼠一只，眼眶放血处死(收集血清，即为阳性血清)，在75％酒精中浸泡5min消毒。无菌取出小鼠脾脏，分离出脾细胞，与新鲜制备的SP2/0骨髓瘤细胞(SP2/0骨髓瘤细胞来自本实验室)按1-2×10⁷个SP2/0与10⁸个免疫脾细胞(1:10-1:15)的比例于50mL离心管，用15mLRPMI-1640基础液重悬细胞，1500r/min离心5min，洗细胞1次。离心的间隙将温浴的培养基，温浴的水，温浴的聚乙二醇(PEG)等放入超净台。然后取出灭菌的吸水纸，将装有骨髓瘤细胞和免疫脾细胞的离心管上清倒尽后，倒扣在吸水纸上控干水滴，轻敲管底使细胞松动。打开计时器，用1mL吸管吸取0.8mLPEG，手持装有混合细胞的离心管，将其放置在水浴中片刻，将PEG缓慢的滴加到混合细胞上，边加边轻轻搅拌，1min内加完，持续搅拌30s。用吸管取10mL基础液，沿管壁缓慢加到融合细胞上，边加边轻轻摇动(不能吹打)，5min内分别加1mL，2mL，3mL，4mL，最后补加基础液到40mL，加完后，盖上盖子，反复颠倒几次，使细胞混匀。800r/min5min离心，弃上清。吸取含有饲养细胞的HAT培养基，用吸管将离心管中的融合细胞轻轻搅拌起来，液面附近逐滴滴入到含饲养细胞的血清瓶中，搅拌混匀，动作要轻将细胞轻轻搅拌起来，千万不要吹打。颠倒混匀。然后将细胞接种在细胞培养板上，每孔两滴，置于培养箱中培养。一次融合可接种4-6块96孔板。根据需要也可少种，一般按SP2/0的细胞数计算，每孔接种量约含10⁴左右个SP2/0细胞。于37℃，5％CO₂培养箱中培养。

融合的当天计为0d，前3d尽量不要动细胞板，保持培养箱内环境稳定。第3d每孔补加1滴HAT完全培养基；第5d每孔吸出l/2培养上清(100μL)，再加入1滴HT完全培养基；以后每隔2d同上法吸去l/2-3/4培养上清，在7d后换入HT完全培养基。

待融合细胞集落长至培养孔1/10-1/5，同时用建立的间接ELISA方法进行筛选。与零药物孔相比，药物孔OD值能被抑制的判为阳性。根据抑制率和细胞集落生长状况，选择2-6个强阳性的仅有1-2个单集落的细胞孔，采用有限稀释方法进行克隆化。

经过3-4次克隆，最终筛选出分泌抗头孢噻呋、头孢曲松等多个头孢菌素类抗生素的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，经染色体计数，该杂交瘤细胞的染色体数目为99.6。申请人将其命名为杂交瘤细胞4D5，并于2013年03月28日送位于湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC NO:C201341。

腹水单抗制备与鉴定：将该细胞株4D5经腹腔注射Balb/C小鼠，生产单克隆抗体。ThermoScientific公司鼠单克隆抗体快速ELISA同型检测试剂盒的操作要求，对本发明所得到的单克隆抗体进行亚型鉴定，结果为小鼠IgG₁亚型。

实施例3间接竞争ELISA检测方法的建立

3.1试剂的配制(本实施例使用的试剂除另注明外均采用以下方法配制)

磷酸盐缓冲液：NaCl 8.0g，KH₂PO₄0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g，KCl 0.2g，加双蒸水至1000mL，调节pH至7.4；

包被液：取Na₂CO₃1.59g，NaHCO₃2.93g，加三蒸水至1000mL，调节pH值至9.6；

洗涤液：NaCl 8.0g，KH₂PO₄0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g，KCl 0.2g，Tween 200.5mL，加双蒸水至1000mL，调节pH至7.4；

封闭液：卵清蛋白1g溶于100mL磷酸盐缓冲液中；

底物液A：3,3',5',5-四甲基联苯二胺(TMB)200mg，无水乙醇100mL，加双蒸水至1000mL；

底物液B：Na₂HPO₄14.6g，柠檬酸9.3g，0.75％过氧化氢脲6.4mL，加双蒸水至1000mL；

底物混合液：将A液和B液按体积比1:1混合即得，现配现用；

终止液：2mol/L硫酸溶液。

3.2包被原浓度和抗体工作浓度的初步确定

选择上述合成的头孢噻呋-OVA作为包被原，用包被液稀释成16mg/L、8mg/L、4mg/L、2mg/L、1mg/L等5个浓度，在96孔酶标板，从第一至第五列依次加入，4℃过夜；洗涤3次，拍干，加入封闭液250μL，37℃封闭120min；洗涤3次，拍干，在酶标板的每个孔加入50μL磷酸盐缓冲液(PBS)，然后第一行至第七行再依次加入50μL磷酸盐缓冲液稀释的稀释倍数为750、1500、3000、6000、12000、24000、48000的单克隆抗体，37℃孵育30min，洗涤3次，拍干；各孔加入1:5000倍磷酸盐缓冲液稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG抗体(简称二抗，以下所指二抗均为HRP标记的羊抗鼠IgG抗体，购自武汉飞弈生物技术有限公司)100μL，37℃孵育30min，洗涤3次，拍干；各孔加入100μL底物混合液，避光显色15min，加入50μL终止液，用自动酶标仪在450nm波长处测定光密度值(OD值)，结果见表1。

结果表明，初步确定包被原头孢噻呋-OVA的包被浓度为4mg/L，抗体工作浓度为1:12000。

表1包被原浓度和抗体工作浓度的初步确定

3.3最佳包被原浓度和抗体工作浓度的确定

以初步确定的包被原头孢噻呋-OVA包被浓度，以4mg/L包被酶标板。将头孢噻呋用磷酸盐缓冲液稀释成12μg/L、6μg/L、3μg/L、1.5μg/L、0.75μg/L、0μg/L 6个浓度，抗体以1:12000为中间浓度，按等差设计一系列浓度梯度，其0孔与IC₅₀值见表2。选择OD值在2.0左右，IC₅₀值较低所对应的抗体稀释度为最佳一抗稀释度。结果表明，选择1:16000为最佳抗体稀释度。

表2最佳抗体稀释度优化

抗体稀释倍数(1:X)	0孔OD值	IC50(μg/L)
			8000	2.400	3.26
12000	2.293	4.07
			16000	1.925	2.57
20000	1.755	3.39
			24000	1.503	3.28

3.4标准曲线的建立

将头孢噻呋用磷酸盐缓冲液配制成12μg/L、6μg/L、3μg/L、1.5μg/L、0.75μg/L、0μg/L 6个系列浓度，每个浓度重复5孔，按照间接竞争ELISA方法测定，重复测定5次。以头孢噻呋溶液浓度的对数值为横坐标，B/B0为纵坐标绘制标准曲线，求出IC₅₀。本试剂盒的IC₅₀值为2.45±0.17μg/L。

3.5交叉反应试验

将头孢噻呋、头孢曲松等头孢类药物用磷酸盐缓冲液配制成适当浓度，用建立的ELISA方法测定各药物的IC₅₀值，每个药物3个复孔，以单克隆抗体对头孢噻呋的交叉反应率为100％，利用公式1计算单克隆抗体对各药物的交叉反应率。结果(表3)表明，本发明建立的间接ELISA及试剂盒对头孢噻呋、头孢曲松、脱呋喃甲酰头孢噻呋、头孢噻肟和头孢喹肟的交叉反应率分别为100％、94.37％、82.77％、8.67％和5.73％，而与其他药物均无交叉反应。

表3本发明试剂盒对各种头孢类药物的交叉反应率

药物名称	IC50(μg/L)	交叉反应率(％)	线性范围(μg/L)
				头孢噻呋	2.45	100.00	0.75～12
头孢曲松	2.61	94.37	0.75～12
				脱呋喃甲酰头孢噻呋	2.96	82.77	0.75～12
头孢噻肟	32.88	8.67	12.5～200
				头孢喹肟	49.71	5.73	14～150
青霉素类	>1000	<0.1	--
				其它头孢菌素类	>1000	<0.1	--

实施例4 ELISA试剂盒的组装

4.1本发明ELISA试剂盒由下述部分组成：

1)包被有包被原头孢噻呋-OVA的固相载体(酶标板)；

2)头孢噻呋标准溶液6瓶，浓度分别为12μg/L、6μg/L、3μg/L、1.5μg/L、0.75μg/L、0μg/L；

3)保藏号为CCTCC C201341的杂交瘤细胞株4D5分泌的单克隆抗体；

4)辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG抗体工作液；

5)浓缩磷酸盐缓冲液：NaCl 80.0g，KH₂PO₄2.0g，Na₂HPO₄·12H₂O 29.0g，KCl 2.0g，加双蒸水至1000mL；

6)浓缩洗涤液：NaCl 80.0g，KH₂PO₄2.0g，Na₂HPO₄·12H₂O 29.0g，KCl 2.0g，Tween205mL，加双蒸水至1000mL；

7)底物液A：3,3',5',5-四甲基联苯二胺(TMB)200mg，无水乙醇100mL，加双蒸水至1000mL；

8)底物液B：Na₂HPO₄14.6g，柠檬酸9.3g，0.75％过氧化氢尿素6.4mL，加双蒸水至1000mL，调节pH至5.0-5.4；

9)终止液：2mol/L硫酸溶液。

4.2酶标板的制备

用包被液将头孢噻呋-OVA稀释成4mg/L，每孔加入100μL，4℃过夜，倾去包被液，每孔加入250μL洗涤液洗涤3次，拍干，然后每孔加入封闭液250μL，37℃孵育120min，倾去孔内液体，洗涤液洗涤3次，拍干，用锡箔纸真空密封保存。

实施例5酶联免疫试剂盒的测定程序

5.1试剂的配制

1)样品稀释液：将试剂盒中提供的浓缩磷酸盐缓冲液用三蒸水稀释10倍后使用。

2)洗涤液：将试剂盒中提供的洗涤液用三蒸水稀释10倍后使用。

3)底物混合液：根据每次所需用量，将配制的底物液A和底物液B按体积1:1混匀，现配现用。

5.2样品前处理

1)牛奶：量取牛奶1mL，室温4000rpm离心10min；取中间层，用PBS/甲醇(体积比为9:1)稀释30倍后直接上样检测。

2)猪、鸡、牛肌肉样品的前处理：称取组织样品均质物2.0±0.02g于50mL离心管中，加入PBS 10mL，剧烈振荡5min后，室温4000rpm离心10min；取上清中间层，用PBS稀释25倍后直接上样检测；

5.3测定步骤

1)加样：向酶标板微孔中加入头孢噻呋系列浓度标准溶液或样品溶液50μL，然后加入单克隆抗体工作液50μL，置于湿盒中，37℃恒温孵育30min；

2)洗涤：倒出孔中的液体，每孔中加入洗涤液250μL洗涤3次并拍干；

3)加辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG抗体工作液：每孔中加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG抗体工作液100μL，置于湿盒中，37℃恒温孵育30min；

4)洗涤：倒出孔中的液体，每孔中加入洗涤液250μL，洗涤3次并拍干；

5)加底物：每孔中加入底物混合液100μL，置于湿盒中，37℃恒温孵育15min；

6)加终止液：每孔中加入终止液50μL；

7)测定：用酶标仪在450nm处测定每孔的光密度值(OD值)。

5.4结果判断

标准曲线：

以所测定的标准品OD值除以“零”孔OD值(B/B0)为纵坐标，头孢噻呋浓度的对数值为横坐标作标准曲线，并进行线性回归，给出回归方程。

牛奶或肌肉中头孢噻呋浓度计算：

计算样品的抑制率(所获得的样品的OD值除以“零”孔OD值)，代入标准曲线的回归方程中，并乘以稀释系数40，计算出牛奶或肌肉中头孢噻呋浓度(μg/kg)，按照公式2折算成头孢曲松浓度(μg/kg)。

实施例6试剂盒的灵敏度、精密度、准确度、重复性试验

6.1本发明试剂盒的灵敏度试验

以标准曲线的IC₅₀值和组织最低检测限(LOD)作为本发明检测试剂盒的灵敏度指标。将头孢噻呋标准品稀释成为12μg/L、6μg/L、3μg/L、1.5μg/L、0.75μg/L、0μg/L 6个浓度，每个浓度5个复孔，按照间接竞争ELISA方法重复测定5次，取5次测定的IC₅₀的平均值。LOD通过以下步骤决定，测定20份空白牛奶的OD值，根据标准曲线的回归方程计算出相应的头孢噻呋浓度，然后计算出头孢噻呋浓度的平均值和标准差(SD)，根据公式计算出牛奶的最低检测限，根据公式计算出牛奶的最低定量限。头孢噻呋在牛奶中的最低检测限和定量限见表4。

表4牛奶中五种药物的最低检测限

6.2本发明试剂盒的精密度试验

将头孢噻呋标准品稀释成12μg/L、6μg/L、3μg/L、1.5μg/L、0.75μg/L、0μg/L 6个浓度，每浓度5个复孔，按照间接竞争ELISA方法重复测定5次，应用标准曲线的回归方程计算出各浓度头孢噻呋标准溶液的测定值，计算板内和板间变异系数，结果见表5。

表5标准曲线的板内及板间误差

6.3本发明试剂盒的准确度、重复性试验

将三个浓度的两种头孢类药物(头孢噻呋、头孢曲松)分别添加到牛奶样品中，其添加回收率在79.3-125.9％之间，批内与批间变异系数≤6％；具体测定结果见表6。

表6牛奶中添加回收率

Claims (1)

1.一种检测食物中头孢噻呋、头孢曲松、脱呋喃甲酰头孢噻呋、头孢噻肟和头孢喹肟药物残留的酶联免疫方法，包括以下步骤：

(1)将头孢噻呋与卵清白蛋白偶联得到包被原；

(2)用保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:C201341的杂交瘤细胞4D5制备单克隆抗体；

(3)用步骤(1)的包被原包被固相载体；

(4)将待测样品提取后进行酶联免疫检测，

所述待测样品的提取方法是：

牛奶：量取牛奶1mL，室温4000rpm离心10min，取中间层，用体积比为PBS缓冲液∶甲醇＝9∶1的稀释液稀释40倍后直接上样检测；

肉类：称取肉类样品均质物2g，加入PBS缓冲液10mL，剧烈振荡5min后，室温4000rpm离心10min；取上清中间层，用PBS缓冲液稀释8倍后上样检测。