CN104558171B

CN104558171B - 用于检测甲睾酮的单克隆抗体及酶联免疫方法与试剂盒

Info

Publication number: CN104558171B
Application number: CN201410830027.3A
Authority: CN
Inventors: 袁宗辉; 王惠; 彭大鹏; 潘源虎; 王玉莲; 陈冬梅; 冯亮; 朱永利; 刘振利
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2014-12-26
Filing date: 2014-12-26
Publication date: 2017-07-04
Anticipated expiration: 2034-12-26
Also published as: CN104558171A

Abstract

本发明公开了一种能识别甲睾酮的特异性单克隆抗体,它是由保藏号为CCTCCNO:C201493的杂交瘤细胞株MT9C10所分泌的。本发明还公开了一种检测甲睾酮的酶联免疫方法和试剂盒。与现有技术相比，本发明制备的单克隆抗体可以识别甲睾酮，识别灵敏度高，特异性好，本发明的ELISA方法和试剂盒检测灵敏度、准确度高，精密度好。

Description

用于检测甲睾酮的单克隆抗体及酶联免疫方法与试剂盒

技术领域

本发明属于兽药残留分析和免疫学技术领域，具体涉及一种能识别甲睾酮的单克隆抗体和一种用于检测甲睾酮的酶联免疫方法(ELISA)和试剂盒。

背景技术

甲睾酮是一种人工合成的甾体类雄激素，具有环戊烷多氢菲的基本结构，在兽医临床上，甲睾酮被大量应用在畜牧养殖业中，能够促进蛋白质的合成和骨骼肌的生长，通过抑制脂肪的增长，从而使肌肉变发达，并且能够刺激动物对食物的欲望，使动物的日增重提高，同时大大提高了饲料的利用效率。

甲睾酮通常比较稳定，在动物体内滞留时间长，并且在动物体内残留，人类长期食用含有此药物及其代谢物的动物性食品会产生头痛、胸闷、心悸、肌肉疼痛等中毒症状，还能导致内分泌失调、痤疮、毛发減少和秃顶等症状，也可引起低蛋白血症，对男性生殖系统造成损伤，除此之外还能造成肝脏、肾脏的病变，甚至能导致染色体畸变，诱发恶性肿瘤。我国于2002年发布的文件中规定在动物性食品中不得检出甲睾酮。目前关于甲睾酮的仪器检测方法很多，例如气象色谱法(GC)，高效液相色谱法(HPLC),气质联用法(GC-MS)，液质联用法(LC-MS)等。仪器分析方法虽然灵敏、准确、分离度高并且可进行多残留检测的定性、定量研究，但是需要昂贵的仪器、繁琐的前处理、熟练的专业操作员。如果采用仪器分析法进行大批量样品的检测，其成本将非常高；而且在目前的国家检测机构中大部分只有省市级才配备有精密的分析仪器。免疫化学分析法特别是酶联免疫吸附分析技术具有快速、灵敏度高、操作简单、适应性强等优点，适合高通量样品筛选，对于快速检测甲睾酮更具优势。

发明内容

本发明的目的是：

(1)提供一种能灵敏度高且能特异性识别甲睾酮的单克隆抗体；

(2)利用该单克隆抗体，制备一种用于甲睾酮检测的酶联免疫试剂盒；

(3)利用该试剂盒，建立一种能用于甲睾酮非诊断目的检测的ELISA方法；

上述目的是通过以下技术方案实现的：

一种能识别甲睾酮的单克隆抗体，它是由保藏号为CCTCC NO:C201493的杂交瘤细胞株MT9C10所分泌的。

所述的杂交瘤细胞株MT9C10，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO:C201493。

进一步，本发明提供了一种能检测肉类食物中甲睾酮药物残留的酶联免疫方法，包括以下步骤：

(1)将结构为式(1)所示的化合物(甲睾酮-3-对肼基苯甲酸，MT-CPD)与卵清白蛋白(OVA)偶联得到包被原(MT-CPD-OVA)；

(2)用保藏号为CCTCC NO:C201493的杂交瘤细胞株MT9C10制备单克隆抗体；

(3)用步骤(1)的包被原包被固相载体；

(4)将待测样品提取后进行酶联免疫检测。

优选地，所述待测样品的提取方法是：将待测样品用酸化乙腈进行提取，提取液氮气吹干后用PBS缓冲液复溶。

本发明以上述单克隆抗体和包被原作为核心试剂与常规的其它试剂组合，制成了能检测甲睾酮的酶联免疫检测试剂盒，结合上述ELISA方法，实现了对甲睾酮的酶联免疫检测。

本发明的有益效果是：

1、本发明在抗体制备时，采用甲睾酮与对肼基苯甲酸反应生成的化合物甲睾酮-3-对肼基苯甲酸作为半抗原，该半抗原体现了甲睾酮的母环环戊烷多氢菲的结构，由该半抗原制备的单克隆抗体可识别甲睾酮。

2、本发明制备的单克隆抗体对甲睾酮的识别灵敏度(IC₅₀)仅为0.28ug/L，对睾酮的交叉反应率仅为15.57％，对其他性激素药物没有交叉反应，具有很高的灵敏度和特异性，明显优于现有的甲睾酮单克隆抗体。

3、本发明建立的ELISA方法和试剂盒检测灵敏度、准确度高，精密度好。

附图说明

图1为本发明制备的半抗原(甲睾酮3-对肼基苯甲酸)、匙孔蓝蛋白(KLH)、免疫原(甲睾酮3-对肼基苯甲酸-KLH偶联物)的紫外扫描图谱。

图2为本发明制备的半抗原(甲睾酮3-对肼基苯甲酸)、卵清白蛋白(OVA)、免疫原(甲睾酮3-对肼基苯甲酸-OVA偶联物)的紫外扫描图谱。

图3为本发明的单克隆抗体与甲睾酮标准品的间接竞争ELISA反应曲线，X轴为甲睾酮(MT)标准溶液浓度对数值，Y轴为甲睾酮标准品溶液的光密度值除以“零”孔光密度值(B/B0)。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步说明，但不限制本发明。

实施例1半抗原的制备

甲睾酮3-对肼基苯甲酸(MT-CPD)的合成称取甲睾酮60mg溶于甲醇10ml中，加入对肼基苯甲酸30mg，加入适量的Na₂CO₃，室温下反应，TLC监测反应进程，约2h反应完全。氮气吹干，用稀盐酸将反应液调制酸性，加入乙酸乙酯萃取，收集有机层，氮气吹干得终产物MT-CPD。

实施例2免疫原和包被原的制备

DCC法合成完全抗原MT-CPD-KLH(OVA)取KLH 2ml/10mg或OVA 20mg溶于PBS15mL中，为A液。称取MT-CPD 25mg溶于N,N-二甲基甲酰胺200μL中，为B液。分别称取DCC 18mg和NHS 12mg溶于N,N-二甲基甲酰胺200μL中为C液。室温条件下，将B液与C液混合反应12h为D液。将D液缓慢滴入A液中，冰浴反应过夜。反应过程如下：

将上清液在4℃下用PBS透析7d，每天更换2次透析液，除去未反应的小分子物质。将MT-CPD-KLH或MT-CPD-OVA溶液冻干，于-20℃冰箱保存，分别为免疫原和包被原。

实施例3单克隆抗体的制备

3.1动物免疫

参照杨汉春《动物免疫学》，利用发明人制备的MT-CPD-KLH免疫原免疫Balb/C小鼠(购自湖北省疾病预防控制中心实验动物中心)，免疫程序为：基础免疫将免疫原与等体积的弗氏完全佐剂乳化后，于小鼠背部皮下多点注射，以后每间隔2周加强免疫一次，换用不完全佐剂乳化。最后于融合前三天(最好于免疫结束后休整1月)腹腔注射，强化免疫，抗原量加倍，不加佐剂。

3.2细胞融合和克隆化

融合时，取经最后强化免疫的Balb/C鼠一只，眼眶放血处死(收集血清，即为阳性血清)，在75％酒精中浸泡5min消毒。无菌取出小鼠脾脏，分离出脾细胞，与新鲜制备的SP2/0骨髓瘤细胞(SP2/0骨髓瘤细胞来自本实验室)按1～2×10⁷个SP2/0与10⁸个免疫脾细胞(1:10～1:15)的比例于50mL离心管，用15mLRPMI-1640基础液重悬细胞，1500r/min离心5min，洗细胞1次。离心的间隙将温浴的培养基，温浴的水，温浴的聚乙二醇(PEG)等放入超净台。然后取出灭菌的吸水纸，将装有骨髓瘤细胞和免疫脾细胞的离心管上清倒尽后，倒扣在吸水纸上控干水滴，轻敲管底使细胞松动。打开计时器，用1mL吸管吸取0.8mLPEG，手持装有混合细胞的离心管，将其放置在水浴中片刻，将PEG缓慢的滴加到混合细胞上，边加边轻轻搅拌，1min内加完，持续搅拌30s。用吸管取10mL基础液，沿管壁缓慢加到融合细胞上，边加边轻轻摇动(不能吹打)，5min内分别加1mL，2mL，3mL，4mL，最后补加基础液到40mL，加完后，盖上盖子，反复颠倒几次，使细胞混匀。800r/min 5min离心，弃上清。吸取含有饲养细胞的HAT培养基，用吸管将离心管中的融合细胞轻轻搅拌起来，液面附近逐滴滴入到含饲养细胞的血清瓶中，搅拌混匀，动作要轻将细胞轻轻搅拌起来，千万不要吹打。颠倒混匀。然后将细胞接种在细胞培养板上，每孔两滴，置于培养箱中培养。一次融合可接种4～6块96孔板。根据需要也可少种，一般按SP2/0的细胞数计算，每孔接种量约含10⁴左右个SP2/0细胞。于37℃，5％CO₂培养箱中培养。

融合的当天计为0d，前3d尽量不要动细胞板，保持培养箱内环境稳定。第3d每孔补加1滴HAT完全培养基；第5d每孔吸出l/2培养上清(100μL)，再加入1滴HT完全培养基；以后每隔2d同上法吸去l/2～3/4培养上清，在7d后换入HT完全培养基。

待融合细胞集落长至培养孔1/10～1/5，同时用建立的间接ELISA方法进行筛选。与零药物孔相比，药物孔OD值能被抑制的判为阳性。根据抑制率和细胞集落生长状况，选择2～6个强阳性的仅有1-2个单集落的细胞孔，采用有限稀释方法进行克隆化。

经过3～4次克隆，最终筛选出分泌抗甲睾酮抗体的单克隆杂交瘤细胞株，申请人将其命名为MT9C10，并于2014年5月20日送位于湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC NO:C201493。对该细胞系进行了染色体计数，结果显示，SP2/0的染色体的平均数为58，脾细胞染色体为40条，而杂交瘤细胞的染色体数目为102，说明融合细胞的确是SP2/0细胞与脾细胞的杂交产物。将该细胞株经腹腔注射Balb/C小鼠，生产单克隆抗体。采用购自ROCKLAND公司的鼠源单抗亚型鉴定试剂盒(MouseMab Isotyping Test Kit)对本发明所得到的单克隆抗体进行亚型鉴定，结果为小鼠IgG₁亚型。

实施例4甲睾酮间接竞争ELISA检测方法的建立

4.1试剂的配制(本实施例使用的试剂除另注明外均采用以下方法配制)

磷酸盐缓冲液：NaCl 8.0g，KH₂PO₄0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g，KCl 0.2g，加双蒸水至1000mL，调节pH至7.4；

包被液：取Na₂CO₃1.59g，NaHCO₃2.93g，加三蒸水至1000mL，调节pH值至9.6；

洗涤液：NaCl 8.0g，KH₂PO₄0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g，KCl 0.2g，Tween 200.5mL，加双蒸水至1000mL，调节pH至7.4；

封闭液：卵清蛋白1g溶于100mL磷酸盐缓冲液中；

底物液A：3,3',5',5-四甲基联苯二胺(TMB)200mg，无水乙醇100mL，加双蒸水至1000mL；

底物液B：Na₂HPO₄14.6g，柠檬酸9.3g，0.75％过氧化氢脲6.4mL，加双蒸水至1000mL；

底物混合液：将A液和B液按体积比1∶1混合即得，现配现用；

终止液：2mol/L硫酸溶液。

4.2包被原浓度和抗体工作浓度的初步确定

选择上述合成的MT-CPD-OVA作为包被原，用包被液稀释成8mg/L、4mg/L、2mg/L、1mg/L、0.5mg/L、0.25mg/L等6个浓度，在96孔酶标板，从第1至第6列依次加入，4℃过夜；洗涤3次，拍干，加入封闭液200μL，37℃封闭60min；洗涤3次，拍干，在酶标板的第1行至第6行依次加入100μL磷酸盐缓冲液稀释的稀释倍数为4000、8000、16000、32000、64000、128000的单克隆抗体，37℃孵育30min，洗涤3次，拍干；各孔加入1:5000倍磷酸盐缓冲液稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG抗体(简称二抗，以下所指二抗均为HRP标记的羊抗鼠IgG抗体，购自武汉飞弈生物技术有限公司)100μL，37℃孵育30min，洗涤5次，拍干；各孔加入100μL底物混合液，避光显色15min，加入50μL终止液，用自动酶标仪在450nm波长处测定光密度值(OD值)，结果见表1。

结果表明，初步确定包被原MT-CPD-OVA的包被浓度为2mg/L或1mg/L，抗体工作浓度为1:64000或1:32000。

表1包被原浓度和抗体工作浓度的初步确定

4.3最佳包被原浓度和抗体工作浓度的确定

以初步确定的包被原MT-CPD-OVA包被浓度，设置2mg/L、1mg/L 2个浓度包被酶标板。将甲睾酮用磷酸盐缓冲液稀释成0、0.12、0.18、0.27、0.4、0.6μg/L 6个浓度，将1:32000磷酸盐缓冲液稀释的单克隆抗体(因为作间接竞争ELISA时，单克隆抗体的加样体积减小了一半，相应地单克隆抗体稀释度减小一半)和上述甲睾酮溶液各加50μL进行间接竞争ELISA。以甲睾酮浓度对数值作为横坐标，以甲睾酮标准溶液的OD值与“零”孔OD值的比值(B/B0)作为纵坐标绘制抑制曲线，选择线性较佳、产生50％抑制时甲睾酮浓度(IC₅₀)较低者作为包被浓度。以最佳包被原浓度包被酶标板，将甲睾酮稀释成0、0.12、0.18、0.27、0.4、0.6μg/L 6个浓度，将抗体以中心浓度1:50000等差设置3个稀释度，单克隆抗体和系列浓度甲睾酮标准溶液各加50μL进行间接竞争ELISA，绘制抑制曲线，选择线性较佳、IC₅₀值较低者作为最佳抗体工作浓度。结果见表2和表3。

表2最佳包被原浓度

包被原浓度(mg/L)	抗体稀释倍数(1：X)	0孔OD值
				2	64000	1.863	0.27
1	32000	2.006	0.36

表3最佳抗体稀释度优化

抗体稀释倍数(1：X)	0孔OD值
			40000	2.12	0.35
50000	2.06	0.26
			60000	1.93	0.3

结果表明，随着包被原浓度降低，IC₅₀有所降低，考虑到包被原过低时，“零”孔OD值偏低，因此采用2mg/L作为最佳包被浓度。随着单克隆抗体稀释度的增加，IC₅₀逐渐降低并保持稳定，但考虑抗体稀释度过大时，“零”孔OD值偏低，因此采用1:50000作为最佳抗体工作浓度。

4.4标准曲线的建立

将甲睾酮用磷酸盐缓冲液配制成0、0.12、0.18、0.27、0.4、0.6μg/L 6个系列浓度，每个浓度重复5孔，按照间接竞争ELISA方法测定，重复测定5次。以甲睾酮溶液浓度的对数值为横坐标，B/B0为纵坐标绘制标准曲线，求出IC₅₀。本试剂盒的IC₅₀值为0.28±0.02μg/L。

4.5交叉反应试验

将蛋白同化雄激素药物用磷酸盐缓冲液配制成适当浓度，用建立的ELISA方法测定各药物的IC₅₀值，每个药物3个复孔，以单克隆抗体对甲睾酮的交叉反应率为100％，利用公式1计算单克隆抗体对各药物的交叉反应率，结果见表4。

公式1：

表4单克隆抗体对性激素药物的交叉反应率

药物		交叉反应率(％)	回归方程	相关系数
					甲睾酮	0.28	100	y＝-0.8785x+0.0160	0.9975
睾酮	4.36	15.57	y＝-0.4657x+0.7977	0.9963
					诺龙	＞28	＜1	-	-
群勃龙	＞28	＜1	-	-
					苯丙酸诺龙	＞28	＜1	-	-
丙酸睾酮	＞28	＜1	-	-

结果表明，抗体对甲睾酮有较高的识别灵敏度和特异性，可用于甲睾酮的ELISA检测。

实施例5本发明甲睾酮单残留检测ELISA试剂盒的组装

5.1本发明ELISA试剂盒由下述部分组成：

1)包被有包被原MT-CPD-OVA的固相载体(酶标板)；

2)甲睾酮标准溶液6瓶，浓度分别为0、0.12、0.18、0.27、0.4、0.6μg/L；

3)保藏号为CCTCC NO:C201493的杂交瘤细胞株MT9C10分泌的单克隆抗体；

4)辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG抗体工作液；

5)浓缩磷酸盐缓冲液：NaCl 80.0g，KH₂PO₄2.0g，Na₂HPO₄·12H₂O 29.0g，KCl 2.0g，加双蒸水至1000mL；

6)浓缩洗涤液：NaCl 80.0g，KH₂PO₄2.0g，Na₂HPO₄·12H₂O 29.0g，KCl 2.0g，Tween20 5mL，加双蒸水至1000mL；

7)底物液A：3,3',5',5-四甲基联苯二胺(TMB)200mg，无水乙醇100mL，加双蒸水至1000mL；

8)底物液B：Na₂HPO₄14.6g，柠檬酸9.3g，0.75％过氧化氢尿素6.4mL，加双蒸水至1000mL，调节pH至5.0～5.4；

9)终止液：2mol/L硫酸溶液。

5.2酶标板的制备

用包被液将MT-CPD-OVA稀释成2mg/L，每孔加入100μL，4℃过夜，倾去包被液，每孔加入250μL洗涤液洗涤3次，拍干，然后每孔加入封闭液250μL，37℃孵育60min，倾去孔内液体，洗涤液洗涤3次，拍干，用锡箔纸真空密封保存。

实施例6本发明的酶联免疫试剂盒的测定程序

6.1试剂的配制

1)样品稀释液：将试剂盒中提供的浓缩磷酸盐缓冲液用三蒸水稀释10倍后使用。

2)洗涤液：将试剂盒中提供的洗涤液用三蒸水稀释10倍后使用。

3)底物混合液：根据每次所需用量，将配制的底物液A和底物液B按体积1:1混匀，现配现用。

6.2样品前处理

1)称取猪肌肉、鸡肌肉、鱼肌肉样品均质物2.0g于50mL离心管中，加入酸化乙腈8mL，剧烈振荡5min后，室温4000rpm离心10min；

2)取上清液4mL，50℃氮气吹干，加入PBS 4mL(甲睾酮)，充分溶解后供试剂盒测定，本处理对组织样品的稀释系数为4。

6.3测定步骤

1)加样：向酶标板微孔中加入甲睾酮系列浓度标准溶液或样品溶液50μL，然后加入单克隆抗体工作液50μL，置于湿盒中，37℃恒温孵育30min；

2)洗涤：倒出孔中的液体，每孔中加入洗涤液250μL洗涤3次并拍干；

3)加辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG抗体工作液：每孔中加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG抗体工作液100μL，置于湿盒中，37℃恒温孵育30min；

4)洗涤：倒出孔中的液体，每孔中加入洗涤液250μL，洗涤3次并拍干；

5)加底物：每孔中加入底物混合液100μL，置于湿盒中，37℃恒温孵育15min；

6)加终止液：每孔中加入终止液50μL；

7)测定：用酶标仪在450nm处测定每孔的光密度值(OD值)。

6.4结果判断

标准曲线：以所测定的标准品OD值除以“零”孔OD值(B/B0)为纵坐标，甲睾酮浓度的对数值为横坐标作标准曲线，并进行线性回归，给出回归方程。

猪肌肉、鸡肌肉、鱼肌肉中甲睾酮浓度计算：计算样品的抑制率(所获得的样品的OD值除以“零”孔OD值)，代入标准曲线的回归方程中，并乘以稀释系数4，计算出猪肌肉、鸡肌肉、鱼肌肉中甲睾酮浓度(μg/kg)。

实施例7本发明试剂盒的灵敏度、精密度、准确度、重复性试验

7.1本发明试剂盒的灵敏度试验

以标准曲线的IC₅₀值和组织最低检测限(LOD)作为本发明检测试剂盒的灵敏度指标。将甲睾酮标准品稀释成为0、0.12、0.18、0.27、0.4、0.6μg/L 6个浓度，每个浓度5个复孔，按照间接竞争ELISA方法重复测定5次，取5次测定的IC₅₀的平均值。LOD通过以下步骤决定，测定20份空白猪肌肉、鸡肌肉、鱼肌肉样品的OD值，根据标准曲线的回归方程计算出相应的甲睾酮浓度，然后计算出甲睾酮浓度的平均值和标准差(SD)，根据公式计算出组织中的最低检测限。本发明的IC₅₀值为0.28±0.02μg/L，甲睾酮在猪肌肉、鸡肌肉、鱼肌肉中的最低检测线详见表5。

表5动物肌肉中的最低检测限

7.2本发明试剂盒的精密度试验

将甲睾酮标准品稀释成0、0.12、0.18、0.27、0.4、0.6μg/L 6个浓度，每浓度5个复孔，按照间接竞争ELISA方法重复测定5次，应用标准曲线的回归方程计算出各浓度甲睾酮标准溶液的测定值，计算板内和板间变异系数，结果见表6。

表6标准曲线的板内及板间误差

7.3本发明试剂盒的准确度、重复性试验

将三个浓度的甲睾酮药物分别添加到肌肉样品中，其添加回收率在56.7％～110％之间，批内与批间变异系数≤10.8％。具体测定结果见表7－9。

公式2：

表7猪肌肉中添加回收率

表8鸡肌肉中添加回收率

表9鱼肌肉中添加回收率

Claims

1.一种能识别甲睾酮的单克隆抗体，其特征在于：它是由保藏号为CCTCC NO:C201493杂交瘤细胞株MT9C10所分泌的。

2.一株杂交瘤细胞株MT9C10，其特征在于：保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:C201493，所述杂交瘤细胞株MT9C10分泌的单克隆抗体能识别甲睾酮。

3.权利要求1所述的单克隆抗体在制备检测甲睾酮的酶联免疫试剂盒中的应用。

4.包含权利要求1所述单克隆抗体的试剂盒。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，该试剂盒是检测甲睾酮的酶联免疫试剂盒。

6.权利要求4或5所述的试剂盒在甲睾酮非诊断目的检测中的应用。

7.一种检测肉类食物中甲睾酮残留的酶联免疫方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)将结构为式(1)所示的化合物与卵清白蛋白偶联得到包被原；

(3)用步骤(1)的包被原包被固相载体；

(4)将待测样品提取后进行酶联免疫检测，

8.根据权利要求7所述的检测肉类食物中甲睾酮残留的酶联免疫方法，其特征在于：所述待测样品的提取方法是：将待测样品用酸化乙腈进行提取，提取液氮气吹干后用PBS缓冲液复溶。