CN107015010A

CN107015010A - 一种用于睾酮残留检测的试剂盒及其制备方法和检测方法

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Publication number: CN107015010A
Application number: CN201710433141.6A
Authority: CN
Inventors: 何庆华; 陈静纯; 任萍萍; 张悦彤; 黄思莹; 黄雪玲; 郑丹儿; 郑宗坤; 游新奎; 蒲涛; 蒲一涛; 孔祥峰; 伍力; 印遇龙
Original assignee: Shenzhen University
Current assignee: Shenzhen University
Priority date: 2017-06-09
Filing date: 2017-06-09
Publication date: 2017-08-04

Abstract

本发明公开一种用于睾酮残留检测的试剂盒及其制备方法和检测方法，试剂盒包括盒体，以及放置在盒体内的酶标板、试剂和说明书，其中，在酶标板的微孔内包被有肟化产物与牛血清白蛋白相偶联得到的完全抗原；所述试剂包括睾酮特异性单克隆抗体、辣根过氧化酶标记羊抗鼠抗体、浓缩洗涤液、睾酮系列标准溶液、显色液、终止液。采用间接竞争ELISA法，定性或定量检测动物源性食品中睾酮残留。其采用高特异性的睾酮单克隆抗体，具有高特异性，高灵敏度，高精确度，高准确度等特点，检测范围宽，假阳性率低，检测结果可靠准确，组织最低检测限为0.4μg/kg，适用于动物源性食品中睾酮残留检测。

Description

一种用于睾酮残留检测的试剂盒及其制备方法和检测方法

技术领域

本发明涉及免疫化学分析领域，主要涉及一种用于睾酮残留检测的试剂盒及其制备方法和检测方法。

背景技术

睾酮又称睾丸素、睾丸酮或睾甾酮，是一种天然存在的雄性激素，属于类固醇激素，不仅对人体第二性征的形成有重要的促进作用，还影响着蛋白质的合成以及人体机能等诸多方面。由于睾酮具有促进动物体内营养物质沉积和改善生产的作用，因此在畜牧业上被用作动物饲料添加剂，用以促进动物生长，提高产量。养殖场使用睾酮激素后，可以增产增收，提高经济效益。然而，养殖户的不合理使用导致长期摄入残留在动物体内的睾酮类激素的消费者出现内分泌紊乱、性早熟等问题，并大大增加了致癌、致畸、致突变的风险。自1986年来，欧盟委员会就已禁止以促进生长为目的在肉食性动物养殖中使用天然或人工合成的激素。我国农业部在2003年(265)号公告中明文规定，不得使用不符合《兽药标签和说明书管理办法》规定的兽药产品，不得使用《食品动物禁用的兽药及其他化合物清单》所列21类药物及未经农业部批准的兽药，不得使用进口国明令禁用的兽药，畜禽产品中不得检出禁用药物。但事实上，养殖户为了追求经济效益，将禁用药物当作添加剂使用的现象仍然相当普遍。

睾酮及睾酮类物质均有很强的毒副作用，因此不能因其能提高产量从而增加收益而将其应用于动物养殖，养殖户应严格遵守相关规定，严禁在肉食性动物养殖中加入睾酮及睾酮类物质。在畜牧业上常被用作动物饲料添加剂以促进动物生长，提高产量。睾酮的毒副作用很强，农业部2002年235号将其列为不得检出项目。目前检验睾酮的常用方法有常规仪器分析法和免疫学检测法。

常规仪器分析法虽然在检测睾酮及同类物质方面具有较宽的线性范围，但耗费高，对实验者和实验条件的要求苛刻，前处理费时费力，因此难以推广，不适于大量样品的检测。而免疫学检测法相比常规仪器分析法具有操作简便及快速灵敏的优点，因此应用更为广泛，而酶联免疫吸附法(ELISA)是其中应用最多的一种新型检测技术。但目前国内尚未见有关睾酮残留酶联免疫吸附分析技术的专利和文献报道。

现有王艳辉等用固相萃取－高效液相色谱法来测定睾酮含量的方法：样品用甲醇提取，乙腈萃取，正己烷脱脂，C18柱固相萃取净化后，经Hypersil ODSC18(4.6mm×250mm,5μm)柱进行分离，紫外检测器测定，流动相为甲醇：水＝55:45(V/V)。其缺点是样品处理复杂，耗时长，成本高，对实验者操作仪器的要求较高，最低检出限较大，检出范围较小。最关键的是，不能满足目前食品安全检测的快速筛查要求。

现有袁宗辉等发明的能用于检测甲睾酮的单克隆抗体及酶联免疫方法与试剂盒，其单克隆抗体是由保藏号为CCTCCNO:C201493的杂交瘤细胞株MT9C10所分泌的。其缺点是只能检测甲睾酮，不能检测睾酮。

现有袁宗辉等发明的能用于检测雄激素类药物的单克隆抗体及酶联免疫方法与试剂盒，其单克隆抗体是由保藏号为CCTCCNO:C201494的杂交瘤细胞株NT4D12所分泌的，可同时检测诺龙、甲睾酮、睾酮、群勃龙四种雄激素类药物。其缺点是会同时检测出诺龙、甲睾酮、睾酮、群勃龙四种雄激素类药物的总浓度，而不能对睾酮进行单独检测，从而无法确定睾酮的浓度。

因此，现有技术还有待于改进和发展。

发明内容

鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种用于睾酮残留检测的试剂盒及其制备方法和检测方法，采用间接竞争ELISA法，定性或定量检测动物源性食品中睾酮残留，旨在解决现有检测方法和试剂盒无法准确检测出睾酮的残留量的问题。

本发明的技术方案如下：

一种用于睾酮残留检测的试剂盒，其中，包括盒体，以及放置在盒体内的固相载体、试剂和说明书，其中，在固相载体上包被有肟化产物与牛血清白蛋白相偶联得到的完全抗原；所述试剂包括睾酮特异性单克隆抗体、辣根过氧化酶标记羊抗鼠抗体、浓缩洗涤液、睾酮系列标准溶液、显色液、终止液；

所述显色液为3,3',5,5'-四甲基联苯胺；所述终止液为硫酸溶液；所述浓缩洗涤液为含有吐温-20的磷酸盐缓冲液。

所述用于睾酮残留检测的试剂盒，其中，还包括甲醇-PBS溶液、叔丁基甲醚。

一种如上所述的用于睾酮残留检测的试剂盒的制备方法，其中，包括以下步骤：

(1)将睾酮肟化得到肟化产物；

(2)将肟化产物与牛血清白蛋白相偶联得到完全抗原；

(3)用步骤(2)的完全抗原免疫小鼠得到睾酮特异性单克隆抗体；

(4)用步骤(2)的完全抗原包被固相载体。

所述的用于睾酮残留检测的试剂盒的制备方法，其中，步骤(1)具体包括以下步骤：

将睾酮溶于无水吡啶，加入羧甲基羟胺半盐酸盐，置烘箱40-60℃下反应3～4h，期间震荡数次；反应结束后真空旋转蒸发去除吡啶，用乙酸乙酯溶解残余物，并加水洗数次；取上层油样物，加入少量无水硫酸钠干燥，真空旋转蒸发去除乙酸乙酯，残余物用乙醚重结晶；将肟化产物溶于甲醇中，经过薄层层析纯化，收集相应Rf条带，溶解于甲醇，进行抽滤，最后真空旋转蒸发得到纯化产物；

其中，睾酮与羧甲基羟胺半盐酸盐的摩尔比为1:1.5～2.5。

所述的用于睾酮残留检测的试剂盒的制备方法，其中，步骤(2)采用碳二亚胺法进行制备，具体包括以下步骤：

A液：取纯化后的T-CMA、EDC-HCl、NHS，加入DMF中，室温下避光震荡0.5～1.5h；

B液：取BSA溶于含20％DMF的PBS缓冲液中，4℃下预冷；

混合：一边搅拌一边将A液逐滴加入到B液中，4℃下反应3-6h；反应结束后，先用含20％DMF的PBS缓冲液透析反应液，并逐渐降低DMF的含量，用蒸馏水透析1d，冷冻干燥保存即可；

其中，A液中，T-CMA、EDC-HCl、NHS的质量比例为4:2:1。

B液中，BSA的浓度范围为1～2％。

所述的用于睾酮残留检测的试剂盒的制备方法，其中，步骤(4)具体包括以下步骤：

用包被稀释液稀释T-BSA抗原，包被固相载体，置4℃下过夜，次日取出固相载体，恢复至室温后倾去包被液，用PBST洗固相载体后拍干，每孔加入封闭液，37℃下封闭1h；取出固相载体，恢复至室温后倾去封闭液，洗固相载体后拍干；

其中，所述封闭液为牛血清白蛋白溶液，包被稀释液为碳酸盐缓冲液。

一种采用如上所述的用于睾酮残留检测的试剂盒的检测方法，其中，包括以下步骤：

(a1)将所述的样品经过有机溶剂提取，离心和旋转蒸发处理，再用混合溶剂溶解，得到待测产物；

(a2)将步骤(a1)的待测产物采用上述试剂盒进行酶联免疫检测。

所述的检测方法，其中，步骤(a1)具体包括以下步骤：

取肉源组织均匀物，加入6mL乙腈溶液，充分振荡2min；振荡完毕在4000r/min以上，15℃条件下离心10min，取上清液4mL，在56℃条件下氮气流吹至完全干燥；

若肉源组织为猪肉，则在干燥后的固体物中加入1ml甲醇-PBS溶液混合振荡30s，取50μL用于分析；

若肉源组织为猪肝，则先加入2mL正己烷充分振荡溶解，然后加入1mL去离子水混合振荡30s，振荡完毕在4000r/min以上，15℃条件下离心5min，去除上层液相；取50μL下层液相与50μL甲醇-PBS溶液混匀；取50μL用于分析。

所述的检测方法，其中，步骤(a2)具体可以包括以下步骤：

S1、工作液配制：

洗涤液：将浓缩洗涤液用去离子水稀释，配制洗涤液；

甲醇-PBS溶液：取甲醇与0.01M PBS混合可得20mL/L的甲醇-PBS溶液；

S2、测定步骤：

编号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置；

加标准品/样本50μL/孔到各自的微孔中，然后加酶标记物50μL/孔，再加入抗体工作液50μL/孔；用盖板膜封板，轻轻振荡混匀，25℃环境中反应30min；

揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤液250μL/孔充分洗涤4-5次，每次间隔15-30秒，用吸水纸拍干；

显色：每孔加入100μL TMB显色液，轻轻振荡混匀25℃环境避光显色15min；

测定：每孔加入终止液50μL，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处或双波长450/630nm处测定每孔OD值。

有益效果：本发明的用于睾酮残留检测的试剂盒及其制备方法和检测方法，采用间接竞争ELISA法，定性或定量检测动物源性食品中睾酮残留。其采用高特异性的睾酮单克隆抗体，具有高特异性，高灵敏度，高精确度，高准确度等特点，检测范围宽，假阳性率低，检测结果可靠准确，组织最低检测限为0.4μg/kg，适用于动物源性食品中睾酮残留检测；可以在较短时间内检测大量样品，排除大量阴性样品。由于样品处理简便易行，检测又无需昂贵的仪器设备，因此比较适合在基层检验检疫单位推广使用。可用于动物源性食品中睾酮残留量的酶联免疫检测，与现有方法相比，本发明的方法和试剂盒具有灵敏度高，特异性强，检测快速，使用简便和检测成本低廉等突出优点。

附图说明

图1是本发明完全抗原紫外图谱。

图2是本发明完全抗原SDS-PAGE电泳图。

图3是本发明睾酮抗体与睾酮标准品的间接竞争反应曲线。

图4是本发明建立的酶联免疫方法的重复度结果。

图5是本发明建立的酶联免疫方法的精密度结果。

具体实施方式

本发明提供一种用于睾酮残留检测的试剂盒及其制备方法和检测方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明所提供一种用于睾酮残留检测的试剂盒，包括盒体，以及放置在盒体内的酶标板、试剂和说明书，其中，在酶标板的微孔内包被有肟化产物与牛血清白蛋白相偶联得到的完全抗原；所述试剂包括睾酮特异性单克隆抗体、辣根过氧化酶标记羊抗鼠抗体、浓缩洗涤液、睾酮系列标准溶液、显色液、终止液。

其中，所述显色液为3,3',5,5'-四甲基联苯胺，其配置过程可以包括以下步骤:①底物A液：Na₂HPO₄·12H₂O 9g，柠檬酸4g，EDTA 0.2g，过氧化氢脲1.5g，五水硫代硫酸钠5g，加蒸馏水至1000mL；②底物B液：柠檬酸4g，甘露醇5g，五水硫代硫酸钠5g，TMB 0.6g(10mlDMF溶解)，加蒸馏水至1000mL；③使用时将底物A液和底物B液按1:1混合即可。

所述终止液为硫酸溶液，其配置过程可以为：18mol/L浓硫酸100mL，缓慢滴加到蒸馏水至900mL。

所述浓缩洗涤液为含有0.05％吐温-20的磷酸盐缓冲液，其配置过程可以为：NaCl80g，KH₂PO₄ 2g，Na₂HPO₄·12H₂O 29g，KCl 2g，Tween-20 5mL，加蒸馏水至1000mL，调至pH7.4。

所述用于睾酮残留检测的试剂盒，还可以包括甲醇-PBS溶液、叔丁基甲醚；所述甲醇-PBS溶液、叔丁基甲醚用于处理待检测物质。

本发明所提供的试剂盒以及酶联免疫方法是采用间接竞争ELISA法，定性或定量检测动物源性食品中睾酮残留。其采用高特异性的睾酮单克隆抗体，具有高特异性，高灵敏度，高精确度，高准确度等特点，检测范围宽，假阳性率低，检测结果可靠准确，组织最低检测限为0.4μg/kg，适用于动物源性食品中睾酮残留检测；可以在较短时间内检测大量样品，排除大量阴性样品。由于样品处理简便易行，检测又无需昂贵的仪器设备，因此比较适合在基层检验检疫单位推广使用。

本发明中还提供所述试剂盒的制备方法，包括完全抗原和单克隆抗体的制备，包括以下步骤：

(1)将睾酮肟化得到肟化产物；

(2)将肟化产物与牛血清白蛋白相偶联得到完全抗原；

(3)用步骤(2)的完全抗原免疫小鼠得到特异性单克隆抗体；

(4)用步骤(2)的完全抗原包被固相载体。

所述固相载体是酶标板，如可采用48或96孔酶标板作固相载体。

步骤(1)具体包括以下步骤：

将睾酮溶于无水吡啶，加入羧甲基羟胺半盐酸盐，置烘箱40～60℃下反应3～4h，期间需震荡数次。反应结束后真空旋转蒸发去除吡啶，用50～100mL乙酸乙酯溶解残余物，并加适量水洗3～4次。取上层油样物，加入少量无水硫酸钠干燥，真空旋转蒸发去除乙酸乙酯，残余物用乙醚重结晶。将肟化产物(T-CMA)溶于甲醇中，经过薄层层析纯化，收集Rf约为0.1的条带，溶解于甲醇，进行抽滤，最后真空旋转蒸发得到纯化产物。

其中，睾酮与羧甲基羟胺半盐酸盐的摩尔比为1:1.5～2.5。

步骤(2)采用碳二亚胺法进行制备，具体包括以下步骤：

A液：取纯化后的T-CMA、EDC-HCl(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐)、NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)，加入DMF(二甲基甲酰胺)中，室温下避光震荡0.5～1.5h。

B液：取BSA溶于含20％DMF的PBS缓冲液中，4℃下预冷。

混合：一边搅拌一边将A液逐滴加入到B液中，4℃下反应3～6h。反应结束后，先用含20％DMF的PBS缓冲液透析反应液，并逐渐降低DMF的含量，最后用蒸馏水透析1d，冷冻干燥保存即可。

其中，A液中，在本实施例方案中采用T-CMA、EDC-HCl和NHS的质量比为4:2:1。

B液中，BSA的浓度范围为1～2％。

步骤(3)具体包括以下步骤：

a、动物的免疫：

选用健康的6～8周龄的BALB/c小鼠，以T-BSA为免疫抗原，第1次基础免疫使用弗氏完全佐剂充分乳化，加强免疫以后改用不完全佐剂乳化。注射方式采用皮下多点注射，每只小鼠每次的免疫剂量为100μg。免疫前1周于尾静脉采血留作阴性对照。第4次免疫后7d于尾静脉采血用于制备血清，用采集的阳性血清来建立直接ELISA法，并进行血清效价测定。第4次免疫后15d加强免疫，不再用免疫佐剂，剂量仍为100μg，于腹腔注射。

b、杂交瘤细胞的制备:

采用PEG法将小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0细胞和免疫后小鼠的脾细胞进行细胞融合，通过间接ELISA法筛选融合后的杂交瘤细胞上清。阳性微孔中的细胞通过有限稀释法进行3次亚克隆，以建立细胞株，通过传代判定其稳定性。

c、单克隆抗体的制备纯化

选用健康的6～8周龄的BALB/c小鼠，于腹腔处注射灭菌石蜡，10d后再于腹腔注射正处于对数生长期的制备的能稳定分泌睾酮单克隆抗体的杂交瘤细胞。7d后采集腹水，离心机12000r/min离心15min，弃去沉淀，采集上清液A。

采用辛酸-硫酸铵法从采集的小鼠腹水中提纯单克隆抗体，具体步骤：取适量上清液A，加入0.06mol/L pH4.8的醋酸缓冲液，稀释至2倍；按33μL/mL原始腹水的比例，30min内一边搅拌一边逐滴加入正辛酸，4℃下静置2h，再12000r/min离心20min，取上清液B并用滤纸过滤；加入1/10上清液B体积的0.1mol/L pH7.4的PBS缓冲液，并用1mol/L NaOH调pH至7.4得上清液C；上清液C在4℃冰浴条件下，30min内一边搅拌一边按277g/L的比例加入硫酸铵粉末，4℃下静置至少2h；静置后在4℃条件下12000r/min离心30min，弃去上清液，采集沉淀，溶于一定体积的PBS缓冲液，并于4℃条件下置于50～100倍的PBS缓冲液中进行透析除盐，时间为2～3d，期间每天都需更换3次透析袋。透析完毕后分装，冻存于-20℃下备用。

步骤(4)具体包括以下步骤：

用包被稀释液(0.05M碳酸盐缓冲液，pH 9.6)稀释至最佳包被浓度115ng/mL的T-BSA抗原包被96孔可拆卸酶标板，置4℃下过夜，次日取出酶标板，恢复至室温后倾去包被液，用PBST洗板3次(每次3min，后续洗涤程序相同)后在吸水纸上拍干，每孔加入200μL封闭液，37℃下封闭1h；取出酶标板，恢复至室温后倾去封闭液，洗板5次后拍干，组装成试剂盒。

其中，所述封闭液为牛血清白蛋白溶液，其配置过程可以为：10g BSA溶于1000mLPBST即可。

本发明中还提供采用上述试剂盒检测睾酮残留的检测方法，包括以下方法：

其中，所述有机溶剂是叔丁基甲醚；所述混合溶剂是甲醇－PBS溶液。

步骤(a1)的处理方法具体可以包括以下步骤：

取2±0.05g组织(猪肉、猪肝)均匀物，加入6mL乙腈溶液，充分振荡2min。振荡完毕在4000r/min以上，15℃条件下离心10min，取上清液4mL，在56℃条件下氮气流吹至完全干燥。

干燥后的固体物根据组织不同有以下不同处理方法：

猪肉样本：加入1ml甲醇-PBS溶液混合振荡30s，取50μL用于分析。

猪肝样本：先加入2mL正己烷充分振荡溶解，然后加入1mL去离子水混合振荡30s，振荡完毕在4000r/min以上，15℃条件下离心5min，去除上层液相；取50μL下层液相与50μL甲醇-PBS溶液混匀；取50μL用于分析。

步骤(a1)的处理方法还可以采用其他方法处理，具体可以包括以下步骤：

称取均匀后的组织样本5g(精确至0.01g)置于50mL离心管中，加入5mL去离子水，20mL叔丁基甲醚，涡旋混匀器混匀1min，超声波发生器中超声波提取10min，之后8000r/min离心5min，取上层有机相于另一只50mL离心管；下层用20mL叔丁基甲醚分2次提取，合并有机相；将有机相40℃旋转蒸发，加甲醇-PBS溶液定容至10mL。取50μL用于分析。

步骤(a2)具体可以包括以下步骤：

S1、工作液配制：

洗涤液：将浓缩洗涤液(20倍浓缩)用去离子水按照1:19稀释(1份浓缩洗涤液+19份去离子水)，或按所需用量配制洗涤液。

甲醇-PBS溶液：取甲醇与0.01M PBS混合可得20mL/L的甲醇-PBS溶液。

S2、测定步骤：

将所需试剂从4℃冷藏环境中取出，置于室温(20-25℃)平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀；

取出需要数量的微孔板及框架，将不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃不要冷冻；

加睾酮系列标准溶液/样本50μL/孔到各自的微孔中，然后加辣根过氧化酶标记羊抗鼠抗体50μL/孔，再加入睾酮特异性单克隆抗体50μL/孔；用盖板膜封板，轻轻振荡混匀，25℃环境中反应30min；

小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤液250μL/孔充分洗涤4-5次，每次间隔15-30秒，用吸水纸拍干(拍干后未被消除的气泡可用干净的枪头刺破)；

测定：每孔加入终止液50μL，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处(建议用双波长450/630nm，检测在5min内读完数据)测定每孔OD值。

以下通过具体实施例对本发明作进一步说明。

1.完全抗原的制备

1.1标准品与试剂

睾酮等标准品和生化试剂，均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2实验设备

分析天平(Sartorius BS110S)，德国Sartorius公司；微量加样器，美国Thermo公司；酸度计(HANNA pH 211型)，意大利HANNA公司；漩涡振荡器(GL-8813型)，江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司；低温冷冻大容量离心机(Anke DL-4000B型)，上海安亭科学仪器厂；超低温冰箱(SANYO Ultra low freezer)，日本SANYO公司；酶标仪(Thermo ScientificMultiskan FC)，美国Thermo公司。

1.3睾酮的肟化

称取289mg(约1mmol)睾酮溶于10mL无水吡啶，然后再加入219mg(约2mmol)羧甲基羟胺半盐酸盐，置烘箱50℃下反应3～4h，期间需震荡数次。反应结束后真空旋转蒸发去除吡啶，用50～100mL乙酸乙酯溶解残余物，并加适量水洗3～4次。取上层油样物，加入少量无水硫酸钠干燥，真空旋转蒸发去除乙酸乙酯，残余物用乙醚重结晶。将肟化产物(T-CMA)溶于甲醇中，经过薄层层析纯化，收集Rf约为0.1的条带，溶解于甲醇，进行抽滤，最后真空旋转蒸发得到纯化产物。

1.4T-BSA完全抗原的制备

采用碳二亚胺法进行制备。A液：取纯化后的T-CMA 7mg、EDC-HCl(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐)3.5mg、NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)4.4mg，加入500μL DMF(二甲基甲酰胺)中，室温下避光震荡1h。B液：取BSA(牛血清白蛋白)20mg溶于4.5mL含20％DMF的PBS缓冲液中，4℃下预冷。一边搅拌一边将A液逐滴加入到B液中，4℃下反应4h。反应结束后，先用含20％DMF的PBS缓冲液透析反应液，并逐渐降低DMF的含量，最后用蒸馏水透析1d，冷冻干燥保存即可。所得完全抗原的紫外图谱如图1所示，通过图1可得T的最大吸收波长是317nm，BSA的最大吸收波长是278nm，T-BSA的最大吸收波长是249nm。相比可知免疫原在经过偶联后，其最大吸收波长发生蓝移现象，可初步证明T与BSA偶联成功，结合比为1:11。SDS-PAGE电泳图如图2所示，由图可得BSA的条带相比T-BSA的条带较深且宽，向下移动的距离稍远，表明T-BSA的迁移速率比BSA的迁移速率小，偶联后免疫原的分子质量比载体BSA的分子质量大，证明偶联抗原制备成功。

2.单克隆抗体的制备

2.1动物的免疫

2.2杂交瘤细胞的制备

2.3单克隆抗体的制备纯化

2.4抗体质量评价

抗体的效价：采用直接ELISA法进行测定，以OD值为1.0左右的抗体稀释倍数为阳性。结果抗体效价为1:6.4×10⁵。

抗体的灵敏度：采用间接竞争ELISA法进行测定，以抗体的IC50(抑制率为50％所对应的药物浓度)来判定抗体的灵敏度。T-BSA完全抗原的竞争药物是睾酮标准品，将T稀释成0ng/mL、0.1024ng/mL、0.256ng/mL、0.64ng/mL、1.6ng/mL、4ng/mL、10ng/mL、25ng/mL系列浓度，测定其吸光度，将所得的标准品吸光度的平均值除以0ng/mL标准品的吸光度，再乘以100，绘制成一个以T浓度(ng/mL)为半对数坐标系的曲线图，并计算IC₅₀值。结果IC₅₀为0.21ng/mL，表明灵敏度高。

抗体的特异性：采用间接竞争ELISA法进行测定，以抗体的交叉反应率来判定抗体的特异性。将睾酮及与等药物配制成不同浓度，测定各药物的IC50值，每种药物3个复孔，计算交叉反应率。结果见表1。

表1本发明抗体的特异性

竞争药物	IC₅₀(ng/mL)	交叉反应率(％)
			睾酮	5.2	100
表睾酮	＞2000	＜0.3
			19-去甲基睾酮	＞2000	＜0.3
甲睾酮	＞2000	＜0.3
			勃地酮	＞2000	＜0.3
5α-二氢睾酮	＞2000	＜0.3
			群勃龙	＞2000	＜0.3
绿司替勃	＞2000	＜0.3
			克伦特罗	＞10000	＜0.06
乙烯雌酚	＞10000	＜0.06
			莱克多巴胺	＞10000	＜0.06
雌二醇	＞10000	＜0.06

3.样品的制备

(1)处理方法一

取2±0.05g组织(猪肉、猪肝)均匀物，加入6mL乙腈溶液，充分振荡2min。振荡完毕在4000r/min以上，15℃条件下离心10min，取上清液4mL，在56℃条件下氮气流吹至完全干燥。干燥后的固体物根据组织不同有以下不同处理方法。

(2)处理方法二

称取均匀后的组织样本5g(精确至0.01g)置于50mL离心管中，加入5mL去离子水，20mL叔丁基甲醚，涡旋混匀器混匀1min，超声波发生器中超声波提取10min，之后8000r/min离心5min，取上层有机相于另一支50mL离心管；下层用20mL叔丁基甲醚分2次提取，合并有机相；将有机相40℃旋转蒸发，加甲醇-PBS溶液定容至10mL。取50μL用于分析。

4.酶联免疫检测(ELISA)方法的建立

4.1标准曲线

按照间接竞争ELISA法，以睾酮标准品浓度为0ng/mL、0.1024ng/mL、0.256ng/mL、0.64ng/mL、1.6ng/mL、4ng/mL、10ng/mL、25ng/mL系列浓度进行吸光度的测定。以睾酮标准溶液浓度的对数为横坐标，以抑制率为纵坐标，绘制标准曲线。标准曲线如图2所示，曲线在0.1024～25ng/mL范围内线性关系良好，相关系数R＝0.9683。

4.2重复度和精密度

按照4.1方法，5组平行实验，每组每个浓度5个复孔，以变异系数为指标判定重复性和精密度。标准曲线的重复度结果如图3所示，5条曲线近乎重叠，表明重复性高。精密度结果如图4所示，各浓度的变异系数均＜8％，表明精密度高。

5.酶联免疫检测试剂盒的制备

5.1酶标板的制备

用稀释至最佳包被浓度的T-BSA抗原包被96孔可拆卸酶标板，置4℃下过夜，次日取出酶标板，恢复至室温后倾去包被液，用PBST洗板3次(每次3min，后续洗涤程序相同)后在吸水纸上拍干，每孔加入200μL封闭液，37℃下封闭1h；取出酶标板，恢复至室温后倾去封闭液，洗板5次后拍干，组装成试剂盒。

5.2试剂盒的配套试剂

每个试剂盒中应配备有：96孔可拆卸微量测试孔(12条×8孔)1个；睾酮标准溶液(1mL/瓶)8瓶，浓度分别为0ng/mL、0.1024ng/mL、0.256ng/mL、0.64ng/mL、1.6ng/mL、4ng/mL、10ng/mL、25ng/mL；酶标记物(7mL/瓶)1瓶；抗体工作液(7mL/瓶)1瓶；TMB显色液(7mL/瓶)1瓶；终止液(7mL/瓶)1瓶；20×浓缩洗涤液(40mL/瓶)1瓶；说明书1份。

5.3所用试剂的配制

(1)封闭液：10g BSA溶于1000mL PBST即可；

(2)终止液：18mol/L浓硫酸100mL，缓慢滴加到蒸馏水至900mL；

(3)显色液：①底物A液：Na₂HPO₄·12H₂O 9g，柠檬酸4g，EDTA 0.2g，过氧化氢脲1.5g，五水硫代硫酸钠5g，加蒸馏水至1000mL；②底物B液：柠檬酸4g，甘露醇5g，五水硫代硫酸钠5g，TMB 0.6g(10mlDMF溶解)，加蒸馏水至1000mL；③使用时将底物A液和底物B液按1:1混合即可。

(4)洗涤缓冲液PBST：NaCl 80g，KH₂PO₄2g，Na₂HPO₄·12H₂O 29g，KCl2g，Tween-205mL，加蒸馏水至1000mL，调至pH 7.4。

6.酶联免疫检测试剂盒的测定程序

6.1工作液配制

洗涤液：将40mL浓缩洗涤液(20倍浓缩)用去离子水按照1:19稀释(1份浓缩洗涤液+19份去离子水)，或按所需用量配制洗涤液。

甲醇-PBS溶液：取20μL甲醇与980μL 0.01M PBS混合可得20mL/L的甲醇-PBS溶液。

6.2测定步骤：

(1)将所需试剂从4℃冷藏环境中取出，置于室温(20-25℃)平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。

(2)取出需要数量的微孔板及框架，将不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃不要冷冻。

(3)编号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。

(4)加标准品/样本50μL/孔到各自的微孔中，然后加酶标记物50μL/孔，再加入抗体工作液50μL/孔。用盖板膜封板，轻轻振荡混匀，25℃环境中反应30min。

(5)小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤液250μL/孔充分洗涤4-5次，每次间隔15-30秒，用吸水纸拍干(拍干后未被消除的气泡可用干净的枪头刺破)。

(6)显色：每孔加入100μL TMB显色液，轻轻振荡混匀25℃环境避光显色15min。

(7)测定：每孔加入终止液50μL，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处(建议用双波长450/630nm，检测在5min内读完数据)测定每孔OD值。

7.本发明试剂盒的考核

7.1灵敏度

在同等条件下测定标准溶液，本实验自制试剂盒测定6次，同类试剂盒测定5次，绘制标准曲线，计算IC₅₀值。比较最低检出限量。对比结果见表2，结果表明本实验自制的试剂盒灵敏度相比较高。

表2灵敏度比较

7.2精密度

在同等条件下测定标准溶液，本实验自制试剂盒每个标准溶液8个复孔，同类试剂盒5个复孔，比较两种试剂盒的板内变异系数。对比结果见表3，结果表明两种试剂盒的变异系数均＜10％，本实验自制试剂盒的精密度与本汇宝试剂盒相比两者水平相当。

表3精密度比较

7.3准确度

在猪肉、猪肝空白样品中添加0.4μg/kg、1μg/kg、5μg/kg的睾酮，每个浓度重复5次，分别用本实验自制试剂盒和同类试剂盒测定回收率。对比结果见表4，结果表明本实验自制试剂盒的回收率为92％～116.75％，本汇宝试剂盒的回收率为91.6％～127.5％，对比结果可得本实验自制试剂盒的回收率较高。另外自制试剂盒在测定空白组织时，测定结果分别为0.01μg/kg和0.06μg/kg，而本汇宝试剂盒的测定结果分别为0.01μg/kg和0.08μg/kg，对比可得自制试剂盒的准确度更高。

表4准确度比较

综上所述，本发明所提供的用于睾酮残留检测的试剂盒及其制备方法和检测方法，通过间接竞争ELISA法建立标准曲线，并验证了重复度和精密度。组装的试剂盒与市面上其他同类试剂盒进行了对比考核，结果显示试剂盒成功有效，且灵敏度，精密度和准确度都很高。因此，此方法与试剂盒具备操作简便，高效灵敏，性能稳定，成本低廉，应用广泛等优点，适用于测定动物源性食品中睾酮残留物的残留量。

应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims

1.一种用于睾酮残留检测的试剂盒，其特征在于，包括盒体，以及放置在盒体内的固相载体、试剂和说明书，其中，在固相载体上包被有肟化产物与牛血清白蛋白相偶联得到的完全抗原；所述试剂包括睾酮特异性单克隆抗体、辣根过氧化酶标记羊抗鼠抗体、浓缩洗涤液、睾酮系列标准溶液、显色液、终止液；

2.根据权利要求1所述的用于睾酮残留检测的试剂盒，其特征在于，还包括甲醇-PBS溶液、叔丁基甲醚。

3.一种如权利要求1所述的用于睾酮残留检测的试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将睾酮肟化得到肟化产物；

(2)将肟化产物与牛血清白蛋白相偶联得到完全抗原；

(4)用步骤(2)的完全抗原包被固相载体。

4.根据权利要求3所述的用于睾酮残留检测的试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤(1)具体包括以下步骤：

其中，睾酮与羧甲基羟胺半盐酸盐的摩尔比为1:1.5～2.5。

5.根据权利要求3所述的用于睾酮残留检测的试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤(2)采用碳二亚胺法进行制备，具体包括以下步骤：

B液：取BSA溶于含20％DMF的PBS缓冲液中，4℃下预冷；

其中，A液中，T-CMA、EDC-HCl、NHS的质量比例为4:2:1；

B液中，BSA的浓度范围为1～2％。

6.根据权利要求3所述的用于睾酮残留检测的试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤(4)具体包括以下步骤：

7.一种采用如权利要求1所述的用于睾酮残留检测的试剂盒的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，步骤(a1)具体包括以下步骤：

9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，步骤(a2)具体可以包括以下步骤：

S1、工作液配制：

洗涤液：将浓缩洗涤液用去离子水稀释，配制洗涤液；

S2、测定步骤：