CN103288872A

CN103288872A - 甲基对硫磷半抗原及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN103288872A
Application number: CN2012100544567A
Authority: CN
Inventors: 万宇平; 冯才伟; 吴鹏; 孙震; 冯静; 杨秀贤; 胡德专; 崔廷婷; 齐向武
Original assignee: Beijing Kwinbon Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Beijing Kwinbon Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2012-03-03
Filing date: 2012-03-03
Publication date: 2013-09-11
Anticipated expiration: 2032-03-03
Also published as: CN103288872B

Abstract

本发明公开了一种半抗原及其制备方法和应用，具体涉及一种甲基对硫磷半抗原。本发明还公开了所述半抗原的制备方法及其应用。基于甲基对硫磷半抗原建立的试剂盒快速检测产品，使用方便、检测成本低、检测方法高效、准确、快速、可同时检测大批量的样本，适用于玉米、苹果样本中甲基对硫磷残留的现场监控和大量样本的筛查。

Description

甲基对硫磷半抗原及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种半抗原及其制备方法和应用，具体涉及甲基对硫磷半抗原及其制备方法和应用。

技术背景

甲基对硫磷(Parathion methyl，O，O-二甲基-O-对硝基苯基硫代磷酸酯)，是一种广谱有机磷杀虫剂、杀螨剂，在世界范围内广泛应用于水稻、棉花、果树、茶叶、蔬菜等经济作物的害虫防治。其作用机制及杀虫谱与对硫磷相似，但该药的药效比对硫磷低，且残效短，对人、畜的毒性也较低，但它仍属高毒农药，且有内吸性，因而限制了它的使用。尽管如此，近年来，因甲基对硫磷中毒的报道仍然屡见不鲜，尤其是在作物和蔬菜上的大量使用，对人体健康造成极大的危害。因此，开发一种简单快速、适用于农药残留现场监控的分析方法具有重要的现实意义。

目前，甲基对硫磷残留的检测方法主要为仪器法，如气相色谱(GC)、高效液相色谱(HPLC)等，这些方法灵敏、准确，特异性强、分离度好，可以同时测定多种药物，但需要昂贵的仪器、样品的前处理复杂、繁琐费时、检测的成本较高，不能现场操作，而且需专业人员操作，所以限制了其应用；与之相比，酶联免疫方法具有特异性好、灵敏度高、操作简便、检测成本低、适合于批量样品的筛选检测等优点而且所需设备少，操作简单易学，成本低廉，能够更好地满足我国经济作物种植户、食品企业、政府职能监管部门等开展检测工作。

发明内容

本发明的目的是提供一种甲基对硫磷半抗原及其制备方法。

本发明提供的甲基对硫磷半抗原，分子结构式为：

本发明提供的甲基对硫磷半抗原的制备方法，包括如下步骤：

a)把三氯硫磷放入单口瓶中搅拌，缓慢滴加无水甲醇，保持温度10℃，滴毕继续反应，用大量冷水洗涤，静止分层，下层为目标物，无水硫酸镁干燥；

b)将对硝基苯酚与氢氧化钠溶于(水/二氯甲烷，1/3，v/v)中，加入苯硫脲(PTC)，搅拌，将其缓慢滴入含有O-甲基硫代磷酰二氯(与对硝基苯酚摩尔比1/2)的单口瓶中，保持温度10℃，反应，将反应液蒸干，柱层析纯化，得无色液体；

c)将3-巯基丙酸与氢氧化钠溶于无水甲醇中，搅拌，将其滴入含有一氯(与巯基丙酸摩尔比1/1)的单口瓶中，保持10℃，滴毕继续反应，加入冷水，石油醚萃取出极性小杂质，将水相调pH至5左右，二氯甲烷萃取，无水硫酸镁干燥，柱层析纯化，得白色固体，即为甲基对硫磷半抗原。

本发明的另一个目的是上述甲基对硫磷半抗原在免疫检测中的应用，具体包括由所述甲基对硫磷半抗原与载体蛋白偶联得到的甲基对硫磷抗原，及由所得甲基对硫磷抗原免疫动物制备得到的甲基对硫磷抗体。

其中所述载体蛋白可为鼠血清蛋白、甲状腺蛋白、牛血清白蛋白、兔血清蛋白、人血清蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白或纤维蛋白原，

所述抗体为甲基对硫磷单克隆抗体。

本发明还提供由上述甲基对硫磷抗体制备的酶联免疫试剂盒，及其在检测玉米、苹果样本中甲基对硫磷残留的应用。

本发明提供的甲基对硫磷半抗原既最大程度地保留了甲基对硫磷的化学结构，又通过化学合成改造引入了可以与蛋白质偶联的-COOH，合成方法简单，纯度、产率较高；用该半抗原作为原料，制备适于动物免疫的抗原体系免疫动物，所得抗体的效价、特异性、亲和力都比较好；所得的抗体用于酶联免疫试剂盒，使用方便、检测成本低、检测方法高效、准确、快速、可同时检测大批量的样本，适于玉米、苹果样本中甲基对硫磷残留的现场监控和大量样本的筛查。本发明的甲基对硫磷半抗原在甲基对硫磷的检测中发挥重要作用。

附图说明

图1：甲基对硫磷半抗原合成路线图

图2：甲基对硫磷半抗原核磁共振氢谱图

图3：甲基对硫磷物酶联免疫试剂盒标准曲线

具体实施方式

下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用来限制本发明的范围。

实施例1甲基对硫磷半抗原的合成和鉴定

一、甲基对硫磷半抗原的合成(合成路线如图1)

a)把三氯硫磷放入单口瓶中搅拌，缓慢滴加无水甲醇(与三氯硫磷摩尔比为1∶4)，保持温度10℃，滴毕继续反应1h，用大量冷水洗涤，静止分层，下层为目标物，无水硫酸镁干燥；

b)将对硝基苯酚与氢氧化钠(摩尔比1/3)溶于(水/二氯甲烷，1/3，v/v)，加入PTC，搅拌约20min，将其缓慢滴入含有O-甲基硫代磷酰二氯(与对硝基苯酚摩尔比1/2)的单口瓶中，保持温度10℃，反应5h，将反应液蒸干，柱层析纯化(乙酸乙酯/石油醚，1/20，v/v)，得无色液体；

c)将3-巯基丙酸与氢氧化钠(摩尔比1/2)溶于无水甲醇中，搅拌30min，将其滴入含有一氯(与巯基丙酸摩尔比1/1)的单口瓶中，保持10℃，滴毕继续反应5h，加入冷水，石油醚萃取出极性小杂质，将水相调pH至5左右，二氯甲烷萃取，无水硫酸镁干燥，柱层析纯化(二氯甲烷/石油醚/乙酸，50/45/5，v/v/v)，得白色固体，即为甲基对硫磷半抗原。

二、甲基对硫磷半抗原的鉴定

取合成的甲基对硫磷半抗原经核磁共振氢谱测定，如图2所示，图谱中12.0ppm左右的羧基信号峰，7～8ppm之间的芳环峰以及2～3ppm之间的亚甲基信号峰，说明半抗原合成成功。

实施例2甲基对硫磷抗原

将甲基对硫磷半抗原与载体蛋白进行偶联得到甲基对硫磷抗原。

一、免疫原的制备——甲基对硫磷半抗原-牛血清白蛋白偶联物合成

将30mg甲基对硫磷半抗原充分溶解于1ml N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，得到溶液I；称取牛血清白蛋白(BSA)50mg，使之充分溶解在2ml PBS(pH 7.2)中，将溶液I逐滴缓慢滴加到该BSA溶液中，得到溶液II；称取12.5mg碳化二亚胺(EDC)用1ml水溶解后缓慢于室温下加入溶液II中，搅拌24h；用0.01mol/L PBS透析3d，每天换2次透析液，以除去未反应的小分子物质；以12000r/min离心30min，收集上清，即得甲基对硫磷免疫原，分装，于-20℃保存备用。

二、包被原的制备——甲基对硫磷半抗原-卵清蛋白偶联物合成

将20mg甲基对硫磷半抗原用1.0ml DMF溶解，冷却至10℃，加入氯甲酸异丁酯15μl，10℃搅拌反应30min，得到反应液A；称取卵清蛋白(OVA)36mg，使之充分溶解在2.6ml50mmol/L碳酸钠溶液中，将反应液A逐滴缓慢滴加到该溶液中；10℃反应4h，然后4℃过夜；用0.01mol/L PBS透析3d，每天换2次透析液，以除去未反应的小分子物质；以12000r/min离心30min，收集上清，即得甲基对硫磷包被原，分装，于-20℃保存备用。

三、甲基对硫磷抗原的鉴定

将载体蛋白、甲基对硫磷半抗原、甲基对硫磷半抗原-载体蛋白偶联物用pH7.4的PBS配成0.5mg/ml的溶液，以0.01mol/L pH7.4PBS调零，用紫外分光光度计在波长200～800nm范围内扫描，得到载体蛋白、甲基对硫磷半抗原、甲基对硫磷半抗原-载体蛋白偶联物的吸收曲线，并计算其结合比。结果发现，三者出现不同的吸收曲线，表明甲基对硫磷半抗原与载体蛋白偶联成功，半抗原与牛血清白蛋白的结合比为(18～22)∶1，与卵清蛋白的结合比为(16～21)∶1。

实施例3甲基对硫磷单克隆抗体

一、甲基对硫磷单克隆抗体的制备

动物免疫：将免疫原注入到Balb/c小鼠体内，免疫剂量为150μg/只，使其产生多克隆抗体血清。

细胞融合和克隆化：小鼠血清测定结果较高后，取其脾细胞，按8∶1比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

细胞冻存和复苏：将甲基对硫磷的单克隆杂交瘤细胞株用冻存液制成1×10⁹个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。

单克隆抗体的生产与纯化：将Balb/c小鼠腹腔注入灭菌石蜡油0.5ml/只，7天后腹腔注射甲基对硫磷的单克隆杂交瘤细胞株6×10⁵个/只，7天后采集腹水。用辛酸-饱和硫酸铵法进行腹水纯化，-20℃保存。

二、单克隆抗体效价的测定

用间接竞争ELISA法测定抗体的效价为1∶(50000～100000)。

间接竞争ELISA方法：用甲基对硫磷半抗原-卵清蛋白偶联物包被酶标板，加入甲基对硫磷标准品溶液和单克隆抗体工作液，4℃反应30min，倒出孔内液体，用PBST洗涤液洗涤3～5次，用吸水纸拍干；加入酶标二抗，25℃反应30min，取出重复洗板步骤；加入底物显色液，25℃反应15min后，加入终止液终止反应；设定酶标仪于波长450nm处测定每孔吸光度值。

实施例4由甲基对硫磷单克隆抗体制备的酶联免疫试剂盒

一、酶联免疫试剂盒的组成

(1)包被甲基对硫磷半抗原-载体蛋白偶联物的酶标板；

(2)用辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗抗体；

(3)甲基对硫磷单克隆抗体工作液；

(4)甲基对硫磷标准品溶液6瓶，浓度分别为0μg/L、0.5μg/L、1.5μg/L、4.5μg/L、13.5μg/L、40.5μg/L；

(5)底物显色液由A液和B液组成，A液为过氧化脲，B液为四甲基联苯胺；

(6)终止液为2mol/L硫酸；

(7)浓缩洗涤液为pH7.2，含0.8％～1.2％吐温-20、0.01‰～0.03‰硫柳汞防腐剂、0.1～0.3mol/L的碳酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比；

(8)浓缩复溶液为pH7.6，含8％～12％酪蛋白、0.1～0.3mol/L的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比。

本试剂盒的主要试剂以工作液的形式提供，检验方法方便易行，具有特异性高、灵敏度高、精确度高、准确度高等特点。

二、酶联免疫试剂盒检测实际样本的应用

1.样品前处理

(1)苹果样本

用均质器均质样本；称取2.0g±0.05g均质后的苹果样本到10ml聚苯乙烯离心管中，分别加入4ml复溶液，2ml甲醇，用涡旋仪涡动5min；4000r/min室温(20～25℃/68～77°F)离心5min；取上清液200μl，加入到800μl复溶液中，充分混匀，取50μl用于分析。

(2)玉米样本

用均质器均质样本；称取2.0g±0.05g均质后的玉米样本到10ml聚苯乙烯离心管中，分别加入4ml 10％氯化钠溶液，2ml甲醇，用涡旋仪涡动5min；4000r/min室温(20～25℃/68～77°F)离心5min；取上清液100μl，加入到900μl复溶液中，充分混匀，取50μl用于分析。

2.用试剂盒检测

向包被有甲基对硫磷包被抗原的酶标板微孔中加入甲基对硫磷标准品溶液或样品溶液50μl，然后加入甲基对硫磷单克隆抗体工作液50μl/孔，用盖板膜盖板后，置4℃恒温箱中避光反应30min，倒出孔内液体，每孔加入250μl洗涤液，30s后倒出孔内液体，如此重复操作洗板5次，用吸水纸拍干；加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗抗体100μl/孔，用盖板膜盖板后，置25℃恒温箱中避光反应30min，取出重复洗板步骤；每孔加入底物显色液A液过氧化脲50μl，底物显色液B液四甲基联苯胺(TMB)50μl，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃恒温箱中避光显色15min，每孔加入终止液2mol/L硫酸50μl，轻轻振荡混匀，用酶标仪波长设定在450nm处，测定每孔吸光度值(OD值)。

3.检测结果分析

用所获得的每个浓度的标准品溶液的吸光度平均值(B)除以第一个标准品溶液(0标准)的吸光度值(B₀)再乘以100％，得到百分吸光度值。以甲基对硫磷标准品浓度(μg/L)的对数值为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线图，如图3所示。用同样的办法计算样品溶液的百分吸光度值，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中甲基对硫磷的实际浓度。

三、酶联免疫试剂盒技术参数的确定

最低检测限：对20份空白样本进行检测，从标准曲线上查出对应于各百分吸光度值的浓度，以20份样本甲基对硫磷浓度的平均值加上3倍标准差表示检测限，结果得该方法对玉米样本的最低检测限为20μg/kg，对苹果样本的最低检测限为10μg/kg。

准确度和精密度：ELISA测定的准确度以回收率表示，精密度以变异系数表示。取空白玉米样本，以20、40、80μg/kg三个浓度的甲基对硫磷对其进行添加回收试验；取空白苹果样本，以10、20、40μg/kg三个浓度的甲基对硫磷对其进行添加回收试验，结果得该方法对玉米样本的回收率为90％±20％，对苹果样本的回收率为90％±20％，批内变异系数＜15％，批间变异系数＜25％。

经测定本发明试剂盒在2～8℃至少可以保存12个月。

Claims

1.一种甲基对硫磷半抗原，其特征在于分子结构式为：

。

2.一种制备权利要求1所述甲基对硫磷半抗原的方法，其特征在于包括如下步骤：

3.一种甲基对硫磷抗原，其是由权利要求1所述的甲基对硫磷半抗原与载体蛋白偶联得到，其特征在于分子结构式为：

。

4.如权利要求3所述的甲基对硫磷抗原，其制备方法包括如下步骤：

取甲基对硫磷半抗原充分溶解于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，得到溶液I；称取载体蛋白，使之充分溶解在磷酸盐缓冲液(pH 7.2)中，将溶液I逐滴缓慢滴加到该载体蛋白溶液中，得到溶液II；称取碳化二亚胺(EDC)用水溶解后缓慢于室温下加入溶液II中，搅拌；用0.01mol/L PBS透析3d，每天换2次透析液，以除去未反应的小分子物质；以12000r/min离心30min，收集上清，即得甲基对硫磷免疫原，分装，于-20℃保存备用。

取甲基对硫磷半抗原用DMF溶解，冷却至10℃，加入氯甲酸异丁酯，10℃搅拌反应，得到反应液A；称取载体蛋白，使之充分溶解在50mmol/L碳酸钠溶液中，将反应液A逐滴缓慢滴加到该溶液中，10℃反应，然后4℃过夜；用0.01mol/L PBS透析3d，每天换2次透析液，以除去未反应的小分子物质；以12000r/min离心30min，收集上清，即得甲基对硫磷包被原，分装，于-20℃保存备用。

5.一种甲基对硫磷抗体，其是由甲基对硫磷免疫原免疫动物制备得到。

6.如权利要求5所述的抗体，其特征在于所述抗体为甲基对硫磷单克隆抗体。

7.一种由权利要求5-6任一项所述的抗体制备的甲基对硫磷酶联免疫试剂盒。

8.一种甲基对硫磷酶联免疫试剂盒检测玉米、苹果样本中甲基对硫磷残留的应用。