CN105572348B

CN105572348B - 检测三唑醇的酶联免疫试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN105572348B
Application number: CN201510973025.4A
Authority: CN
Inventors: 陈黎; 范子彦; 曹东山; 鲁亚辉; 潘立宁; 胡斌; 唐纲岭; 刘惠民; 朱亮
Original assignee: Beijing Kwinbon Biotechnology Co Ltd; Zhengzhou Tobacco Research Institute of CNTC; National Tobacco Quality Supervision and Inspection Center
Current assignee: Beijing Kwinbon Biotechnology Co Ltd; Zhengzhou Tobacco Research Institute of CNTC; National Tobacco Quality Supervision and Inspection Center
Priority date: 2015-12-23
Filing date: 2015-12-23
Publication date: 2017-10-27
Anticipated expiration: 2035-12-23
Also published as: CN105572348A

Abstract

本发明提供了一种检测三唑醇的酶联免疫试剂盒，它包括：包被有三唑醇偶联抗原的酶标板、三唑醇单克隆抗体、酶标记抗抗体、三唑醇标准品溶液、底物显色液、终止液、洗涤液、复溶液。本发明还公开了一种应用上述酶联免疫试剂盒检测三唑醇残留量的方法，它包括：首先进行样品前处理，然后用试剂盒进行检测，最后分析检测结果。本发明提供的酶联免疫试剂盒可用于检测烟叶中三唑醇的残留量，其操作简便、费用低廉、灵敏度高、能够现场监控且适合大量样本的筛查。

Description

检测三唑醇的酶联免疫试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及酶联免疫检测技术，具体涉及一种用于检测三唑醇的酶联免疫试剂盒，其特别适于烟叶中三唑醇残留量的检测。

背景技术

三唑醇（triadimenol，C₁₄H₁₈CN₃O₂）又名百担，化学名称为1-(4-氯苯氧基)-3,3-二甲基-1-(1H-1,2,4-三唑-1-基)-2-丁醇，是一种低毒、广谱、高效的内吸性杀菌剂，其主要作用机理是抑制赤霉素和麦角固醇的生物合成进而影响细胞分裂速率，对烟草根黑腐病、白粉病、蛙眼病等真菌病害都有很好的防治效果。因此，在我国农业生产中的应用非常广泛，适用于麦类、玉米、高粱、果蔬、烟草等农作物。

烟草中三唑醇残留是国际烟草科学研究合作中心（CORESTA）密切关注的，且近年来在我国某些产地烟草中的检出率也较高。随着三唑醇的广泛使用和人们对食品和农作物安全的重视，三唑醇在食品及农作物中的残留也受到了高度关注。2007年1月欧盟公布了进口的中国产蜂蜜中检测出三唑醇残留量超标的预警通报。同年5月，日本厚生劳动省查出我国1批输日胡萝卜中三唑醇残留量超标，由此日方要求对我国出口日本的胡萝卜中三唑醇项目实施50%监控检查。目前，很多国家已明确限定该农药在食品中的最高残留限量，如日本规定三唑醇在食品中的残留限量（MRL）为0.2~0.5mg/kg；欧盟规定三唑醇在豆类中的MRL为0.1mg/kg；国际食品法典委员会（CAC）规定西红柿中三唑醇的MRL为0.5mg/kg。为避免三唑醇残留对人体造成危害以及突破国外贸易壁垒，建立简单、快速、准确、可靠的烟草中三唑醇类残留量的检测方法很有必要。

目前常用的三唑醇检测方法主要有气相色谱法（GC）、液相色谱法（LC）、气-质联用法（GC-MS）和液-质联用法（LC-MS）。采用这些分析方法需要昂贵的仪器和专门的技术人员，样品前处理过程复杂且花费高、费时长，难以满足大量样品和现场样品快速检测的需要。酶联免疫吸附分析法（ELISA）具有简便快速、特异灵敏、样品容量大、分析成本低的特点，可以简化甚至省去样品净化步骤，在大量样本和现场样本快速筛选检测中显示出独特优势，能够更好地满足我国企业、政府职能监管部门等开展检测工作，极具发展潜力。

发明内容

本发明的目的正是基于上述现有技术状况而提供一种结构简单、使用方便、价格便宜、便于携带的用于三唑醇残留量检测的酶联免疫试剂盒，并提供一种高效、准确、简便、适于大批量样本筛选的定性、定量检测方法。

本发明试剂盒，它包括：包被有三唑醇偶联抗原的酶标板、三唑醇单克隆抗体、酶标记抗抗体、三唑醇标准品溶液、底物显色液、终止液、洗涤液、复溶液；所述三唑醇偶联抗原是由三唑醇半抗原与载体蛋白偶联得到，所述载体蛋白可为甲状腺蛋白、牛血清白蛋白、兔血清蛋白、人血清蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白，所述三唑醇半抗原是由三唑酮与氨基己酸在有机碱1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯的催化下进行酮胺的缩合反应得到，分子结构式为：

。

所述三唑醇单克隆抗体是以三唑醇偶联抗原作为免疫原制备获得。

所述酶标记抗抗体中的抗抗体为羊抗鼠抗抗体。

所述酶标记抗抗体的标记酶为辣根过氧化物酶或细菌提取碱性磷酸酯酶，其中优选辣根过氧化物酶；酶标记的抗抗体是采用戊二醛法或过碘酸钠法将标记酶与抗抗体进行偶联得到的。

为了更方便现场监控和大量样本筛查，所述试剂盒还包括三唑醇标准品溶液、底物显色液、终止液、洗涤液、复溶液。

所述三唑醇标准品溶液6瓶，浓度分别为0 µg/L、1 µg/L、3 µg/L、9 µg/L、27 µg/L、81 µg/L。

当标记酶为辣根过氧化物酶时，所述底物显色液由底物液A液和底物液B液组成，A液为过氧化氢或过氧化脲，B液为邻苯二胺或四甲基联苯胺，所述终止液为1~2 mol/L的硫酸或盐酸缓冲液；当标记酶为细菌提取碱性磷酸酯酶时，所述底物显色液为对硝基磷酸盐缓冲液，所述终止液为1~2 mol/L氢氧化钠溶液。

所述洗涤液优选为pH值为7.4，含有0.05%吐温-20、0.01‰硫柳汞防腐剂的0.02mol/L磷酸盐缓冲液，其中的百分比为质量体积百分比，单位g/mL。

所述复溶液优选为pH值为7.0、0.1 mol/L的磷酸盐缓冲液。

本发明中酶标板的制备过程为：用包被缓冲液将包被原稀释成20 μg/mL，每孔加入100 μL，37℃避光孵育2 h或4℃过夜，倾去孔中液体，用洗涤液洗涤2次，每次30 s，拍干，然后在每孔中加入150~200 μL封闭液，37℃避光孵育1~2 h，倾去孔内液体拍干，干燥后用铝膜真空密封保存。

其中，在酶标板制备过程中所用到的包被缓冲液为pH值为9.6的0.05 mol/L碳酸盐缓冲液，封闭液为pH值为7.4，含有1%~3% (g/mL)酪蛋白、0.1~0.3 mol/L的磷酸盐缓冲液，所述百分比为质量体积百分比。

本发明的检测原理为：

在微孔条上预包被三唑醇偶联抗原，加入样本溶液或标准品溶液后，再加入三唑醇单克隆抗体溶液，样本中的三唑醇与酶标板上包被的三唑醇偶联抗原竞争三唑醇单克隆抗体，加入酶标记抗抗体进行放大作用，用显色液显色，样本吸光度值与三唑醇的残留量呈负相关，与标准曲线比较即可得到样本中三唑醇的残留量；同时根据酶标板上颜色的深浅，与系列浓度的标准品溶液颜色的比较可粗略判断样本中三唑醇残留量的浓度范围。

本发明还提供了一种应用上述酶联免疫试剂盒检测三唑醇残留量的方法，它包括步骤：

（1）样本前处理；

（2）用试剂盒进行检测；

（3）分析检测结果。

本发明检测三唑醇的酶联免疫试剂盒主要采用间接竞争ELISA方法定性或定量检测样本中三唑醇的残留量；对样本的前处理要求低，样本前处理过程简单，能同时快速检测大批量样本；主要试剂以工作液的形式提供，检验方法方便易行，具有特异性高、灵敏度高、精确度高、准确度高等特点。本发明的酶联免疫试剂盒，结构简单、使用方便、价格便宜、携带便利、检测方法高效、准确、简便、适于大批量样本筛选的定性、定量检测。

附图说明

图1：三唑醇半抗原合成路线图

图2：试剂盒标准曲线图。

具体实施方式

下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用来限制本发明的范围。

实施例1 试剂盒组分的制备

1、三唑醇半抗原的合成（合成路线见附图1）及鉴定

取1.0 g三唑酮加乙醇溶解，加入0.35 g 1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯（DBU），搅拌，再加入0.87 g氨基己酸水溶液，加热回流反应12 h；停止反应，旋蒸，除去乙醇，加水和1.3 g氢氧化钾，震荡，加乙酸乙酯萃取，分去有机相，水相调节pH值到4，加乙酸乙酯萃取，有机相水洗，无水硫酸钠干燥蒸干，得到浅黄色油状物，二氯甲烷/石油醚（1:10，V/V）重结晶，得到半抗原产物0.76 g，收率69%。

取上述半抗原经核磁共振氢谱鉴定，¹H-NMR（CDCl₃, 300MHz）δ：11.00（1H, s），7.51（1H, ddd, J=8.132, J=5.483, J=1.670），7.46（1H, ddd, J=8.132, J=5.485, J=1.670），6.94（1H, dd, J=8.132, J=5.485），6.94（1H, dd, J=8.132, J=5.483），6.52（1H），8.270（1H, d, J=1.903），8.1（1H, d, J=1.903）， 3.87（2H, t, J=7.434），1.25（3H,s），1.25（3H, s），1.25（3H, s），1.84（2H, tt, J=7.434, J=7.022），1.41（2H, tt, J=7.434, J=7.022），1.55（2H, tt, J=7.434, J=7.367），2.30（2H, t, J=7.367）。图谱中化学位移δ=11.0的为间隔臂上羧基氢共振吸收峰，δ=1.85、1.41、2.30的为间隔臂上亚甲基氢的共振吸收峰，这些峰的存在，证明间隔臂偶联成功，三唑醇半抗原结构正确。

2、三唑醇偶联抗原的合成及鉴定

免疫抗原制备——三唑醇半抗原与牛血清白蛋白（BSA）偶联得到免疫抗原。

取14 mg半抗原，溶解于1mL N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中；称取BSA 50 mg，使之充分溶解在3.8 mL 2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液（MES）（pH 5.0）中，将半抗原缓慢滴加到蛋白溶液中；取30 mg碳化二亚胺（EDC）用 0.2 mL MES（pH5.0）充分溶解后加入半抗原蛋白混合液中，室温下搅拌24 h；用0.01 mol/L 磷酸盐缓冲液（PBS）4℃透析3 d，每天换3次透析液；分装，于-20℃保存备用。

三唑醇半抗原与血蓝蛋白偶联得到免疫原。

称取血蓝蛋白50 mg，使之充分溶解在3.8 mL 0.1M的磷酸盐缓冲液PBS（PH 7.2）中，得到溶液A；取30 mg碳化二亚胺（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）用0.2 mL水充分溶解后于加入溶液A中，室温下搅拌30 min。取6 mg半抗原，溶解于1 mL N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，然后缓慢加入到蛋白溶解中，室温搅拌反应24 h。用0.01 mol/L PBS 4℃透析3 d每天换3次透析液。分装，于-20℃保存备用。

三唑醇半抗原与甲状腺蛋白偶联得到免疫原。

称取甲状腺蛋白50 mg，使之充分溶解在3.8 mL 0.1M的磷酸盐缓冲液PBS（PH7.2）中，得到溶液A；取30 mg碳化二亚胺（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）用0.2 mL水充分溶解后于加入溶液A中，室温下搅拌30 min。取8mg半抗原，溶解于1 mL N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，然后缓慢加入到蛋白溶解中，室温搅拌反应24 h。用0.01 mol/L PBS 4℃透析3 d每天换3次透析液。分装，于-20℃保存备用。

包被抗原制备——三唑醇半抗原与卵清蛋白（OVA）偶联得到包被抗原。

取14 mg半抗原，溶解于1 mL DMF中；称取OVA 50 mg，使之充分溶解在3.8 mL MES（pH 5.0）中，将半抗原缓慢滴加到蛋白溶液中；取30 mg EDC用 0.2 mL MES（pH5.0）充分溶解后加入半抗原蛋白混合液中，室温下搅拌24 h；用0.01 mol/L PBS 4℃透析3 d，每天换3次透析液；分装，于-20℃保存备用。

三唑醇半抗原与人血清白蛋白偶联得到包被原。

称取人血清白蛋白50 mg，使之充分溶解在3.8 mL 0.1M PBS（PH 7.2）中，得到溶液B；取30mg EDC和NHS用0.2 mL水充分溶解后于加入溶液B中，室温下搅拌30 min。取14mg半抗原，溶解于1mL DMF中,然后缓慢加入到蛋白溶解中，室温搅拌反应24 h。用0.01 mol/LPBS 4℃透析3 d每天换3次透析液。分装，于-20℃保存备用。

三唑醇半抗原与兔血清白蛋白偶联得到包被原。

称取兔血清白蛋白50 mg，使之充分溶解在3.8 mL 0.1M PBS（PH 7.2）中，得到溶液B；取30mg EDC和NHS用0.2 mL水充分溶解后于加入溶液B中，室温下搅拌30 min。取14mg半抗原，溶解于1mL DMF中,然后缓慢加入到蛋白溶解中，室温搅拌反应24 h。用0.01 mol/LPBS 4℃透析3 d每天换3次透析液。分装，于-20℃保存备用。

按合成三唑醇偶联抗原反应所用半抗原、载体蛋白与偶联产物的比例，进行紫外（200 ~ 400 nm）扫描测定，通过比较三者分别在260 nm和280 nm的吸光值计算其结合比。偶联物三唑醇半抗原-载体蛋白的最大吸收峰与三唑醇半抗原、载体蛋白的最大吸收峰相比发生了明显的变化，表明三唑醇半抗原-载体蛋白的合成是成功的。经计算，半抗原与BSA的结合比为13:1，与OVA的结合比为8:1。

3、三唑醇单克隆抗体的制备

（1）杂交瘤细胞的获得

1）首次免疫：将三唑醇半抗原-BSA偶联物（免疫抗原）与等量的弗氏完全佐剂充分乳化，皮下注射6周龄的Balb/c小鼠，每只0.2 mL；

2）加强免疫两次：从首次免疫开始，每两周加强免疫一次，用弗式不完全佐剂代替弗氏完全佐剂，方法和剂量同首次免疫；

3）最后一次加强免疫一周后眼底静脉采血测效价和抑制，有抑制且效价达到1:10000以上时进行如下末次免疫：腹腔注射不加任何佐剂的免疫原溶液0.1 mL，三天后处死小鼠，取其脾脏与骨髓瘤细胞融合；

4）采用间接竞争酶联免疫分析方法测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，得到并建立稳定分泌三唑醇单克隆抗体的杂交瘤细胞株，取处于对数生长期的杂交瘤细胞用冻存液制成细胞悬液，分装于冻存管，在液氮中长期保存。

（2）单克隆抗体的制备

1）细胞复苏：取出三唑醇单克隆抗体杂交瘤细胞株冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养；

2）制备腹水与抗体纯化：采用体内诱生法，将Balb/c小鼠（8周龄）腹腔注入灭菌石蜡油0.5 mL/只，7天后腹腔注射杂交瘤细胞5×10⁵个/只，7天后采集腹水。用辛酸-饱和硫酸铵法进行纯化，得到三唑醇单克隆抗体溶液（-20℃保存）。

（3）单克隆抗体效价的测定

用间接竞争ELISA法测定抗体的效价为1:(200000~500000)。

间接竞争ELISA方法：用三唑醇半抗原-OVA偶联物包被酶标板，加入三唑醇标准品溶液、三唑醇单克隆抗体溶液和辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗抗体溶液，25℃反应30min，倒出孔内液体，用洗涤液洗涤3~5次，用吸水纸拍干；加入底物显色液，25℃反应15 min后，加入终止液终止反应；设定酶标仪于波长450 nm处测定每孔吸光度值。

（4）单克隆抗体特异性的测定

抗体特异性是指它同特异性抗原结合的能力与同该类抗原类似物结合能力的比较，常用交叉反应率作为评价标准。交叉反应越小，抗体的特异性则越高。

本实验将三唑醇类杀菌剂（三唑醇、环唑醇、粉唑醇、戊唑醇、己唑醇、烯唑醇、联苯三唑醇）做系列稀释，分别与单克隆抗体进行间接竞争ELISA，制作标准曲线，分析得到IC₅₀，然后按下式计算交叉反应率：

结果显示各类似物的交叉反应率为：三唑醇100%、环唑醇＜1%、粉唑醇＜1%、戊唑醇＜1%、己唑醇＜1%、烯唑醇＜1%、联苯三唑醇＜1%。本发明抗体对环唑醇、粉唑醇、戊唑醇、己唑醇、烯唑醇、联苯三唑醇等其他三唑醇类杀虫剂无交叉反应，只针对三唑醇有特异性结合。

4、羊抗鼠抗抗体的制备

以羊为免疫动物，以鼠源抗体为免疫原免疫无病原体羊，得到羊抗鼠抗抗体。

5、酶标记抗抗体的制备

将羊抗鼠抗抗体与辣根过氧化物酶（HRP）采用改良后的过碘酸钠法进行偶联。传统的过碘酸钠法要求反应体系中酶与抗体的摩尔浓度比为4:1，由于辣根过氧化物酶在强氧化作用下产生许多与抗体结合的位点，这样活化的辣根过氧化物酶分子充当了连接各分子的桥梁，降低了酶标记物的酶活性，使制备的偶联物中混有许多聚合体。为了解决这个问题，我们将传统的方法进行了改良，即：

（1）省去了氨基的封闭过程，因为能产生自身氨基连接的氨基实际很少；

（2）降低辣根过氧化物酶与抗体的摩尔浓度比率至2:1，改良后的方法比传统的方法简便，对酶活性的损失减少。

6、酶标板的制备

用包被缓冲液将包被抗原（三唑醇半抗原-OVA偶联物）稀释成20 μg/mL，每孔加入100 μL，37℃避光孵育2 h，倾去孔中液体，用洗涤液洗涤2次，每次30 s，拍干，然后在每孔中加入200 μL封闭液，37℃避光孵育2 h，倾去孔内液体拍干，干燥后用铝膜真空密封保存。

实施例2 检测三唑醇的酶联免疫试剂盒的组建

组建检测三唑醇的酶联免疫试剂盒，使其包含下述组分：

（1）包被三唑醇偶联抗原的酶标板；

（2）三唑醇标准品溶液，浓度分别为0 µg/L、1 µg/L、3 µg/L、9 µg/L、27 µg/L、81µg/L；

（3）三唑醇单克隆抗体工作液；

（4）用辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗抗体；

（5）底物显色液由A液和B液组成，底物显色液A液为过氧化脲，底物显色液B液为四甲基联苯胺；

（6）终止液为2 mol/L的硫酸缓冲液；

（7）洗涤液为pH值为7.4，含有0.05%吐温-20、0.01‰硫柳汞防腐剂的0.02 mol/L磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比；

（8）复溶液为pH值为7.0、0.1 mol/L的磷酸盐缓冲液。

实施例3 烟叶样本中三唑醇残留量的检测

1、样本前处理

称取1.0±0.05 g烟叶样本至50 mL聚苯乙烯离心管中，加入10 mL烟叶提取液（量取100 mL甲醇，加入100 mL去离子水，充分混匀），用匀浆机将其充分打碎；将打碎的样本用滤膜进行过滤；移取滤液100 μL加入400 μL去离子水，充分混匀；再移取以上液体50 μL加入950 μL复溶液，充分混匀；取50 μL用于分析。

2、用试剂盒检测

向包被有三唑醇偶联抗原的酶标板微孔中加入三唑醇标准品溶液或经前处理的样本溶液50 μL/孔，然后加入三唑醇单克隆抗体工作液50 μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应30 min；倒出孔内液体，每孔加入250 μL洗涤液充分洗涤4~5次，每次间隔10 s，用吸水纸拍干；再加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗抗体100 μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应30 min，取出重复洗板步骤；每孔加入底物显色液A液过氧化脲50 μL，底物显色液B液四甲基联苯胺50 μL，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中显色15 min，每孔加入终止液2 mol/L硫酸50 μL，轻轻振荡混匀，用酶标仪波长设定在450 nm处，参比波长620 nm，测定每孔吸光度值（OD值）。

3、检测结果分析

用所获得的每个浓度的标准品溶液的吸光度平均值（B）除以第一个标准品溶液（0标准）的吸光度值（B₀）再乘以100%，得到百分吸光度值。以三唑醇标准品浓度（μg/L）的对数值为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线，如图2所示。用同样的办法计算样本溶液的百分吸光度值，相对应每一个样本的三唑醇残留量则可从标准曲线上读出。

实施例4 三唑醇酶联免疫试剂盒技术参数的确定试验

1、试剂盒灵敏度和检测限

按照常规方法测定试剂盒灵敏度，试剂盒标准曲线最低点为1 μg/L，标准曲线的范围为1~81 μg/L，IC₅₀（50%抑制浓度）浮动范围为2.5~4.0 μg/L；对空白烟叶样本20份进行检测，从标准曲线上查出对应于各百分吸光度值的浓度，以20份样本浓度的平均值加上3倍标准差表示检测限，结果得该方法对烟叶样本的检测限为1000 μg/kg。

2、样本精密度和准确度试验

以回收率作为准确度评价指标，以重复测定某一浓度样本的检测结果相对标准偏差（RSD%）作为精密度评价指标。计算公式为：回收率（%）＝实际测定值/理论值×100%，其中理论值为样本的添加浓度；相对标准偏差RSD% ＝ SD/X×100%，其中SD为标准偏差，X为测定数据的平均值。

按1000 μg/kg、2000 μg/kg、4000 μg/kg三个浓度三唑醇对空白烟叶样本进行添加回收测定，每个样本做4个平行，用三批不同试剂盒进行测定，计算样本的平均回收率及精密度，结果见下表。

表1 精密度及准确度试验

以500、1000、2000µg/kg三个浓度的三唑醇对空白烟叶样本进行添加，平均回收率在70%~110%之间；批内、批间相对标准偏差均小于15%。

3、试剂盒稳定性试验

试剂盒保存条件为2~8℃，经过12个月的测定，试剂盒的最大吸光度值（零标准）、50%抑制浓度、三唑醇添加实际测定值均在正常范围之内。考虑在运输和使用过程中，会有非正常保存条件出现，将试剂盒在37℃保存条件下放置7天，进行加速老化实验，结果表明该试剂盒各项指标完全符合要求。考虑到试剂盒冷冻情况发生，将试剂盒放入-20℃冰箱冷冻7天，测定结果也表明试剂盒各项指标完全正常。从以上结果可得出试剂盒可以在2~8℃至少保存12个月以上。

Claims

1.一种检测三唑醇的酶联免疫试剂盒，其特征在于：包括包被有三唑醇偶联抗原的酶标板、三唑醇单克隆抗体、酶标记抗抗体、三唑醇标准品溶液、底物显色液、终止液、洗涤液、复溶液；所述三唑醇偶联抗原是由三唑醇半抗原与载体蛋白偶联得到，所述载体蛋白为甲状腺蛋白、牛血清白蛋白、兔血清蛋白、人血清蛋白或血蓝蛋白；所述三唑醇半抗原是由三唑酮与氨基己酸在有机碱1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯的催化下进行酮胺的缩合反应得到，分子结构式为：

所述三唑醇单克隆抗体是以三唑醇偶联抗原作为免疫原制备获得，

所述酶标记抗抗体中的抗抗体为羊抗鼠抗抗体。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述三唑醇半抗原的合成方法为：取1.0 g三唑酮加乙醇溶解，加入0.35 g 1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯，搅拌，再加入0.87 g氨基己酸水溶液，加热回流反应12 h，停止反应，旋蒸，除去乙醇，加水和1.3 g氢氧化钾，震荡，加乙酸乙酯萃取，分去有机相，水相调节pH值到4，加乙酸乙酯萃取，有机相水洗，无水硫酸钠干燥蒸干，得到浅黄色油状物，二氯甲烷/石油醚=1:10重结晶，得到述三唑醇半抗原产物。

3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述酶标记抗抗体的标记酶为辣根过氧化物酶或细菌提取碱性磷酸酯酶，当标记酶为辣根过氧化物酶时，底物显色液A液为过氧化氢或过氧化脲，底物显色液B液为邻苯二胺或四甲基联苯胺，终止液为1~2 mol/L的硫酸或盐酸缓冲液；当标记酶为细菌提取碱性磷酸酯酶时，底物显色液为对硝基磷酸盐缓冲液，终止液为1~2 mol/L氢氧化钠溶液。

4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述洗涤液为pH值为7.4，含有0.05%吐温-20、0.01‰硫柳汞防腐剂的0.02 mol/L磷酸盐缓冲液；所述复溶液为pH值为7.0、0.1 mol/L的磷酸盐缓冲液，洗涤液中的百分比为重量体积百分比，单位g/mL。

5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述三唑醇标准品溶液的浓度分别为0 µg/L、1 µg/L、3 µg/L、9 µg/L、27 µg/L、81 µg/L。

6.一种利用权利要求1所述试剂盒检测烟叶样品中三唑醇残留量的方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）样品前处理；

（2）用试剂盒进行检测；

（3）分析检测结果。