CN101113981A - 磺胺类药物直接竞争酶联免疫检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种磺胺类药物直接竞争酶联免疫检测试剂盒，属于酶联免疫和兽药残留检测技术领域。包括制备能产生磺胺类药物抗体的人工免疫抗原、酶标抗原、抗磺胺类药物抗体、标准溶液试剂、底物溶液试剂、显色剂溶液试剂、终止液试剂、酶标抗原稀释液试剂、包被抗磺胺类药物抗体的多孔聚苯乙烯微量反应板及浓缩洗涤液试剂。本发明的主要采用直接竞争酶联免疫方法定性或定量地检测食品和饲料中磺胺类药物的残留量；其检测限大于2μg/kg，检测时间仅需2小时；平均回收率70％－120％，批内误差小于10％，批间误差小于20％；并具有简便、快速、准确的特点，可直接用于食品和饲料中磺胺类药物残留量的检测。

Description

磺胺类药物直接竞争酶联免疫检测试剂盒

技术领域

本发明涉及一种磺胺类药物直接竞争酶联免疫检测试剂盒，具体地说是用于食品和饲料中磺胺类药物残留量的检测，属于酶联免疫和兽药残留检测技术领域。

背景技术

因磺胺类药物具有抗菌谱广，能抑制大多数革兰氏阳性菌和阴性菌，性质稳定便于长期保存，价格比较便宜，又有长效、中效、短效等各种制剂的优点，不仅广泛用于人类，还广泛用于兽医临床，在动物的防病、治病方面具有显著的疗效。它们的用药方式可以是加药饲料、水剂、丸剂或针剂。通常将磺胺类药物用于家禽以预防球虫病、霍乱和感染性鼻炎；在水产品养殖过程中用于控制疔疮和肠败血症等；同时还以亚临床治疗剂量，作为饲料添加剂，用于防病和促进动物生长，以提高奶牛、生猪的抗病能力和增进其食欲，提高产奶量和产肉量。

由于此类药物在体内作用和代谢时间较长，若不按规定要求合理地使用与停药，易引起在动物体内残留，并通过奶、肉、蛋借食物链以低剂量传递，从而影响人类健康。因此，国内外对磺胺类药物等残留均有限量要求，其最大残留限量不超过100μg/kg，并且有逐步严格控制的趋势。

磺胺类药物的检测方法，有抑制微生物法、分光光度法、荧光法、薄层色谱法、气相色谱法(GC)和液相色谱法(HPLC)，以及气相色谱/质谱法(GC/MS)、液相色谱/质谱法(HPLC/MS)、免疫检测法等。气相色谱、高效液相色谱和气质联用等方法分离度好、特异性强、灵敏度高，可以同时测定多种药物。但缺点是样品的提取净化等前处理步骤繁琐，检测的成本较高，对操作人员的要求也较高，不适宜大批量样品的筛选检测，很难推广。微生物学方法缺乏灵敏度、特异性，准备工作繁琐，检测所需时间较长，在定性定量上都存在困难，不能满足测定的要求。酶联免疫法是一种快速、灵敏、特异和安全的检测小分子药物残留的检测技术，其规模化筛选特点更适用于常规化检测需要，目前，磺胺类药物残留检测试剂盒主要为接间竞争性酶联免疫检测试剂盒，与本发明直接竞争性酶联免疫检测试剂盒不同。如专利CN1262839C为接间竞争性酶联免疫检测试剂盒，是将人工抗原或二抗包被于酶标板上，检测时再加抗体，而后加酶标二抗、显色剂等。

发明内容

本发明的目的在于克服上述不足之处，从而提供一种磺胺类药物直接竞争酶联免疫检测试剂盒，其采用直接竞争酶联免疫方法定性或定量地检测食品和饲料中磺胺类药物的残留量；检测时间短、平均回收率高、批内、批间误差小，并具有简便、快速、准确的特点。

本发明的主要解决方案是这样实现的：

本发明酶联免疫检测试剂盒包括制备能产生磺胺类药物抗体的人工免疫抗原、酶标抗原、抗磺胺类药物抗体。

本发明将磺胺类药物与载体蛋白偶联制备成人工免疫抗原；用人工免疫抗原免疫动物制备抗磺胺类药物抗体；将磺胺类药物与酶偶联制备成酶标抗原。

本发明所述的酶联免疫检测试剂盒还包括标准品溶液系列试剂、酶标抗原溶液试剂、底物溶液试剂、显色剂溶液试剂、终止液试剂、酶标抗原稀释液试剂、浓缩洗涤液试剂。

本发明所述的载体蛋白可以是牛血清白蛋白、卵血清白蛋白等。

本发明所述的抗磺胺类药物抗体为用人工免疫抗原免疫动物制备多克隆或单克隆抗体；所述的多克隆抗体或单克隆抗体可为鼠、马、羊、兔源的抗体，所述的磺胺类药物多克隆抗体优选为磺胺类药物兔多克隆抗体，所述的磺胺类药物单克隆抗体优选为磺胺类药物鼠单克隆抗体。

本发明所述的包被抗磺胺类药物抗体的多孔聚苯乙烯微量反应板在制备过程中，所用的人工免疫原是采用重氮偶合法将磺胺类药物与牛血清白蛋或卵血清白蛋白偶合得到的结合物(摩尔比1∶5～1∶20)。

本发明所述的包被缓冲溶液是pH9.6 0.05mol/L的碳酸盐缓冲液，所用的封闭液是1％～5％牛血清白蛋白或卵血清白蛋白的0.01mol/L pH7.5磷酸盐缓冲液。

本发明所述的磺胺类药物可以是磺胺二甲嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺等。所述磺胺类药物标准溶液的浓度范围为1.0μg/L～625μg/L。

本发明所述的酶标抗原中的酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶，优选为辣根过氧化物酶，辣根过氧化物酶-磺胺类药物标记物采用二步戊二醛法制备。

本发明所述的显色剂由底物溶液和显色液组成，底物溶液为50μg/mL～200μg/mL过氧化氢或过氧化脲溶液，显色液为50μg/mL～200μg/mL邻苯二胺或四甲基联苯胺溶液。

本发明所述的终止液为1～2mol/L硫酸溶液。

本发明所述的酶标抗原稀释液含0.5％～2％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液中含0.15mol/L的氯化钠。

本发明所述的浓缩洗涤液为含有0.5％～1％吐温20的0.1mol/L pH7.5磷酸盐缓冲液。

本发明使用时将标准品或样品和酶标抗原加入包被抗磺胺类药物抗体的多孔聚苯乙烯微量反应板中，与固相载体上的抗体竞争性结合，洗涤分离游离抗原和酶标抗原，结合在固相载体上的酶标记物，与酶底物和显色剂反应，结合的酶标记物将无色的显色剂转化为蓝色的产物。加入反应终止液后使颜色由蓝转变为黄色。在450nm处检测吸光度，吸收光强度与样品中磺胺类药物浓度成反比。可通过标准曲线计算磺胺类药物的浓度，或通过与标准品颜色比较，判断样品中磺胺类药物浓度限量。

本发明与已有技术相比具有以下优点：

本发明主要采用直接竞争酶联免疫方法定性或定量地检测食品和饲料中磺胺类药物的残留量；其检测限大于2μg/kg，检测时间仅需2小时；平均回收率70％～20％，批内误差小于10％，批间误差小于20％；并具有简便、快速、准确的特点，可直接用于食品和饲料中磺胺类药物残留量的检测。

附图说明

图1是本发明磺胺类药物酶联免疫检测试剂盒的结构示意图。

图2是本发明包被抗磺胺类药物抗体的多孔聚苯乙烯微量反应板及支架的示意图。

具体实施方式

下面本发明将结合附图中的实施例作进一步描述：本发明磺胺类药物酶联免疫检测试剂盒由标准品溶液系列试剂瓶1、酶标抗原溶液试剂瓶2、底物溶液试剂瓶3、显色剂溶液试剂瓶4、终止液试剂瓶5、酶标抗原稀释液试剂瓶6、浓缩洗涤液试剂瓶7、包被抗磺胺类药物抗体的多孔聚苯乙烯微量反应板8及反应板支架9、盒体10所组成。上述试剂瓶、包被抗磺胺类药物抗体的多孔聚苯乙烯微量反应板和反应板支架均装在盒体内。

实施例一：

一、免疫抗原、抗体及酶标抗原的制备

1、免疫抗原的制备

本发明所述的人工免疫抗原为采用重氮偶合法制备的磺胺类药物与载体蛋白结合物，其磺胺类药物采用磺胺二甲嘧啶。

称取20mg～100mg磺胺二甲嘧啶(SMZ)，加入0.5mol/L硫酸，4℃避光搅拌过夜，置冰浴中，逐滴加入1.9％亚硝酸钠溶液，避光反应约20分钟，加180μL氨基磺酸铵溶液，终止反应为重氮化磺胺二甲嘧啶液。

载体蛋白采用牛血清白蛋白(BSA)。称取30mg～600mg牛血清白蛋白，以0.2mol/L pH10碳酸盐缓冲液6mL溶解，然后加入上述重氮化磺胺二甲嘧啶液，调反应液pH值为9-10，于4℃避光搅拌18小时。将反应液于4℃蒸馏水中透析72小时，期间换蒸馏水5次。或过萄聚糖凝胶G50(Sephadex G50)柱提纯，以0.05mol/L pH8.0碳酸盐缓冲溶液洗脱。收集透析纯化液或第1峰的柱洗脱液(棕色液体)，分装保存于-20℃作免疫原用。

2、磺胺二甲嘧啶多克隆抗体的制备

将上述合成的磺胺二甲嘧啶-牛血清白蛋白结合物(SMZ-BSA)作免疫抗原，采用皮内或皮下多点注射方式，接种1kg～1.5kg雄性新西兰兔；每隔4周免疫1次，第一次免疫时，在免疫原中加等量福氏完全佐剂混匀制成乳剂，以后免疫均加等量福氏不完全佐剂；自第二次免疫开始，每次免疫后8～10天采血测试抗血清效价。观察抗血清效价增长情况，达满意效价时将兔宰杀，取全血分离血清。

抗血清经过3次硫酸铵沉淀后，再用层析柱分离纯化，对磷酸盐缓冲溶液透析。吸取抗血清10mL，平衡至室温，加入等量的0.01moL/L pH7.8磷酸盐缓冲溶液，充分混匀，加入20mL饱和硫酸铵溶液(以浓氨水调至pH7.8)，摇匀，4℃静止1小时后，以5000转/分钟离心5分钟，去上清液。沉淀物用20mL 0.01moL/L pH7.8磷酸盐缓冲溶液溶解，然后加入10mL饱和硫酸铵溶液(pH7.8)，摇匀，4℃静止30分钟后，以5000转/分钟离心5分钟，去上清液。重复盐析两次。最终以2mL0.01moL/L pH7.8磷酸盐缓冲溶液溶解免疫球蛋白IgG沉淀物，装入透析袋，对2000mL 0.01moL/L pH7.2磷酸盐缓冲溶液透析12小时。将上述透析液，加入到约25克湿重的纤维素DEAE-52(取纤维素DEAE-52干粉10克，用500mL 0.01moL/L pH8.0的磷酸盐缓冲溶液浸泡过夜，抽滤)中，4℃平衡1小时，每10分钟搅拌一次，倾入布氏漏斗中，用pH8.0的0.2moL/L磷酸盐缓冲溶液洗滤。收集滤液，再对0.01moL/LpH7.4磷酸盐缓冲溶液透析12小时，最后加入适量甘油-20℃保存。

3、单克隆抗体的制备

用磺胺二甲嘧啶-牛血清白蛋白结合物作免疫原，免疫BALB/c小白鼠，免疫剂量40μg/只，含福氏完全佐剂的免疫原首次免疫，以后每隔四周，用含福氏不完全佐剂的免疫原加强免疫，最后一次免疫后10天，采血，取脾细胞。取免疫小白鼠的脾细胞与小白鼠的骨髓瘤细胞杂交融合，制备杂交瘤细胞。采用有限稀释法筛选杂交瘤细胞，筛选能够稳定分泌磺胺类药物单克隆抗体的杂交瘤细胞株。单克隆抗体的生产与纯化，小鼠腹腔注射杂交瘤细胞，采集腹水，经硫酸铵盐析纯化，分装待用。

4、酶标抗原的制备

酶标抗原中的酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶，优选为辣根过氧化物酶，辣根过氧化物酶-磺胺类药物标记物采用二步戊二醛法制备：

戊二醛活化辣根过氧化物酶(HRP)：称取10mg～50mg辣根过氧化物酶溶于0.5mL～2mL 1.25％戊二醛溶液中，室温避光搅拌反应10～20小时，然后将反应液于4℃对0.1mol/L pH6.8磷酸盐缓冲溶液透析48～72小时，期间换液4次。

磺胺二甲嘧啶-辣根过氧化物酶结合物(SMZ-HRP)的制备：称取2mg～20mg磺胺二甲嘧啶溶于1mL 0.1mol/L pH6.8磷酸盐缓冲溶液内，然后加入上述经戊二醛活化的辣根过氧化物酶，再加0.1mL 1mol/L pH9.5碳酸盐缓冲液，于4℃避光搅拌反应19小时，再加0.1mL 0.2mol/L L-赖氨酸溶液。上葡聚糖凝胶G75(sephadex G75)柱层析，收集在402nm和242nm波长处有最大吸收峰的洗脱液，合并收集液，在4℃，对0.1mol/L pH6.8磷酸盐缓冲溶液透析50小时，期间换液4次，最后加等量甘油保存于-20℃备用。

二、试剂盒的制备

1、试剂盒

如图1所示：由标准品溶液系列试剂瓶1、酶标抗原溶液试剂瓶2、底物溶液试剂瓶3、显色剂溶液试剂瓶4、终止液试剂瓶5、酶标抗原稀释液试剂瓶6、浓缩洗涤液试剂瓶7、包被抗磺胺类药物抗体的多孔聚苯乙烯微量反应板8及反应板支架9、盒体10所组成。将含上述试剂的试剂瓶、包被抗磺胺类药物抗体的多孔聚苯乙烯微量反应板及反应板支架装入盒内，组成磺胺二甲嘧啶酶联免疫检测试剂盒。

2、试剂的配制

(1)、标准溶液的配制：准确称取标准磺胺二甲嘧啶1mg(精确到0.00001g)，配成4mg/mL母液，再用磷酸盐缓冲溶液稀释成20μg/mL中间液，最终稀释成所需的浓度(1.0μg/L～625μg/L)，灌装。为试剂1。

(2)、酶标抗原溶液：辣根过氧化物酶-磺胺二甲嘧啶溶液原液，灌装。为试剂2。

(3)、底物溶液：先用0.1mol/L pH5.0的醋酸钠-柠檬酸缓冲液配制成0.3％过氧化氢贮备液，每1mL缓冲液中加入14μL贮备液。灌装。为试剂3。

(4)、显色溶液：四甲基联苯胺先用丙酮配制10mg/mL溶液，用0.1mol/LpH5.0的醋酸钠-柠檬酸缓冲液配制成0.2mg/L溶液。灌装。为试剂4。

(5)、终止液：2mol/L硫酸溶液。灌装。为试剂5。

(6)、酶标抗原稀释液：含1％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液。磷酸盐缓冲液：0.01mol/L pH7.5磷酸盐缓冲液中含0.15mol/L的氯化钠。灌装。为试剂6。

(7)、浓缩洗涤液：含0.5％吐温20的磷酸盐缓冲液。磷酸盐缓冲液：0.1mol/L pH7.5磷酸盐缓冲液中含1.5mol/L的氯化钠。灌装。为试剂7。

(8)、包被抗磺胺类药物抗体的多孔聚苯乙烯微量反应板：取0.5～5μg/L抗磺胺二甲嘧啶抗体溶液150μL～200μL，加入到反应板小孔中，摇匀，置4℃冰箱中过夜。倒出孔内液体，用含0.15mol/L的氯化钠的0.01mol/L pH7.5磷酸盐缓冲液洗涤，重复3～5次，将反应板倒置在吸水纸上拍打，吸干。在已包被抗体的反应板小孔中加200μL含1％牛血清白蛋白的0.01mol/L pH7.5磷酸盐缓冲液封闭液，37℃恒温培育1小时，用洗涤液洗涤，重复3次，用吸水纸吸干，封装。上述所述的包被抗体的反应板有24孔或48孔或96孔，并采用铝膜真空密封。

三、样品中磺胺二甲嘧啶残留的检测

1、样品的前处理

(1)、乳制品

牛奶：取适量牛奶，置4℃，以3000转/分速度离心10分钟，移弃上层相脂肪层，下层用蒸馏水按1∶4稀释后测定(稀释倍数n＝5)。

奶粉：称取奶粉1g，溶解于19mL蒸馏水中，置4℃，以3000转/分速度离心10分钟，移弃上相脂肪层，取下层溶液待测量(稀释倍数n＝20)。

(2)、蜂蜜称取蜂蜜2g，加4mL蒸馏水，10mL乙酸乙酯，振荡10分钟，取上相乙酸乙酯层5mL，低温水浴挥干，残留物加1mL蒸馏水溶解(稀释倍数n＝1)。

(3)、肌肉组织和脏器取试样匀浆，称2g匀浆样品，加20mL超声提取，(标记好刻度)超声波提取15分钟。若溶剂挥发，用三氯甲烷补至刻度，混均，过滤。取滤液10mL，减压或60℃～70℃水浴，挥干溶剂。用5mL水溶解，待测(稀释倍数n＝5)。

若组织样品脂肪含量很高，可在加水溶解后，再加正己烷5mL，振摇，转移至离心管，置4℃，以3000转/分速度离心10分钟，弃正己烷相，下层待测定。

(4)、饲料称取饲料2g，加20mL乙酸乙酯，振荡10分钟，静置，取上清液10mL，蒸干，加2mL蒸馏水溶解，待测(稀释倍数n＝2)。

2、检测方法

(1)、准备：分析前将所有试剂平衡至室温；按要求将有关试剂稀释至使用浓度；分析后立即将所有试剂放回4℃～8℃冰箱；在所有培育中，避光，盖上微孔板盖。

(2)、试剂配制：酶标抗原(试剂2)的稀释：使用前取酶标抗原250μL用酶标抗原稀释剂(试剂6)稀释成工作浓度。浓缩洗涤液(试剂7)的稀释：使用前用蒸馏水将浓缩洗涤液稀释10倍。

(3)定位：根据需要设定限量法(见表1)和定量法(见表2)。取足够数量的反应板微孔置于反应板支架上，记录标准品孔和试样孔的位置。限量法以控制标准孔号中的浓度为5μg/L为例。

表1  限量法微孔定位

零标准孔号	控制标准孔号	样品孔号
								1	2	3	4	5	6	7	8

表2  定量法微孔定位

标准孔浓度  μg/L						样品孔号
												a	b	c	d	e	f	1	2	3	4	5	6

(4)、反应：在每孔中依次加入试剂，加入50μL标准溶液或试样提取液至相应微孔中；再加入50μL酶标抗原溶液到每个微孔中。摇匀，将反应板放在塑料袋内，置暗处，25℃～37℃反应1小时。将微孔中液体倾倒到水池内，倒置微孔支架，在干净纸巾上轻拍，除去所有残留的液体，加洗涤液约250μL到每个微孔中洗板，再排空液体，重复洗涤4次。

(5)、显色测定：每孔分别加入底物溶液和显色剂溶液各50μL，充分摇匀，置暗处，25℃～37℃反应15分钟。加50μL终止液到每孔中，摇匀。在450nm波长处，以空气为空白调零，测定吸收值。在60分钟内读数。

3、结果计算和表述

(1)、限量法：若试样孔的吸收值小于标准孔的吸收值，即A_试样＜A_标准，超过限量值，为阳性。若试样孔的吸收值大于标准孔的吸收值，即A_试样＞A_标准，则小于所设限量值，为阴性。限量值为100μg/L或100μg/kg。

若样品有其它限量要求时，可通过调整试样稀释倍数或控制标准孔的浓度进行控制，三者的关系式为：限量值＝控制标准孔的浓度×稀释倍数。

(2)、定量法：标准曲线的绘制，所测标准品的吸收值对应磺胺二甲嘧啶浓度(μg/L)的半对数坐标作标准曲线图，曲线在一定范围内应当成线性。根据试样的吸收值，通过标准曲线，查得相对应浓度。按式(1)计算试样中的磺胺二甲嘧啶含量。

试样中的磺胺二甲嘧啶含量X，单位为微克每千克(μg/kg)，按下式计算；

X＝Cn    …………………………………(1)

式中：

C——从标准曲线上查得相对应提取液中磺胺二甲嘧啶浓度，单位为微克每升(μg/L)；

n——试样稀释倍数。

计算结果表示到小数点后一位有效数字。

实施例二：

抗原改用磺胺标准品，抗体改用抗磺胺抗体溶液，酶标抗原改用辣根过氧化物酶-磺胺，反应板改用抗磺胺抗体包被，其余试剂瓶的配制同实施例一，即为磺胺酶联免疫检测试剂盒。

实施例三

抗原改用磺胺甲嘧啶标准品，抗体改用抗磺胺甲嘧啶抗体溶液，酶标抗原改用辣根过氧化物酶-磺胺甲嘧啶，反应板改用抗磺胺甲嘧啶抗体包被，其余试剂瓶的配制同实施例一，即为磺胺甲嘧啶酶联免疫检测试剂盒。

Claims (2)

1.一种检测磺胺类药物直接竞争酶联免疫试剂盒，包括标准品溶液系列试剂、酶标抗原溶液试剂、底物溶液试剂、显色剂溶液试剂、终止液试剂、酶标抗原稀释液试剂、包被抗磺胺类药物抗体的多孔聚苯乙烯微量反应板、浓缩洗涤液试剂，其特征是所述的包被抗磺胺类药物抗体的多孔聚苯乙烯微量反应板在制备过程中，所用的人工免疫原是采用重氮偶合法将抗磺胺类药物抗体与牛血清白蛋或卵血清白蛋白偶合得到的结合物，所用的抗磺胺类药物抗体是免疫原免疫动物得到的多克隆抗体或单克隆抗体；所述的包被缓冲溶液是pH9.6 0.05mol/L的碳酸盐缓冲液，所用的封闭液是1％～5％的牛血清白蛋白或卵血清白蛋白；所述的酶标抗原溶液中的酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶，优选为辣根过氧化物酶；所述的磺胺类药物标准溶液的浓度范围为1.0μg/L～625μg/L；所述的显色剂由底物溶液和显色液组成，底物溶液为过氧化氢或过氧化脲溶液，显色液为邻苯二胺或四甲基联苯胺溶液；所述的终止液为1～2mol/L硫酸溶液；所述的酶标抗原稀释液含0.5％～2％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液中含0.15mol/L的氯化钠；所述的浓缩洗涤液为含有0.5％～1％吐温20的0.1mol/L pH7.5磷酸盐缓冲液。

2.根据权利要求1所述的检测磺胺类药物直接竞争酶联免疫试剂盒，其特征所述的抗磺胺类药物为磺胺二甲嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺。

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