CN102080066B

CN102080066B - 一种检测t-2毒素的方法及其专用试剂盒

Info

Publication number: CN102080066B
Application number: CN2009102379492A
Authority: CN
Inventors: 吴小平; 江海洋; 王战辉; 史为民; 徐飞; 张兴祥; 王熙; 潘净如; 王进; 李娜
Original assignee: BEIJING WDWK BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: BEIJING WDWK BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2009-11-26
Filing date: 2009-11-26
Publication date: 2012-07-04
Anticipated expiration: 2029-11-26
Also published as: CN102080066A

Abstract

本发明公开了一种检测T-2毒素的方法及其专用试剂盒。本发明提供了保藏编号为C6MCC No.3395的杂交瘤细胞株3E-5A-7H-8B。本发明还提供了一种单克隆抗体，是由保藏编号为CGMCC No.3395的杂交瘤细胞株3E-5A-7H-8B分泌产生的。本发明提供的试剂盒包括所述单克隆抗体。本发明中将T-2毒素进行结构改造，加入间隔臂，合成了人工抗原。用所述人工抗原免疫动物，获取到了一个杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株分泌得到的单克隆抗体特异性很高。本发明的试剂盒，操作简便易行，造价低廉，具有特异性高、灵敏度高、精确度高等特点，能够现场监控且适合大量样本筛查，将在T-2毒素的检测中发挥重要作用。

Description

一种检测T-2毒素的方法及其专用试剂盒

技术领域

本发明涉及一种检测T-2毒素的方法及其专用试剂盒。

背景技术

T-2毒素(T-2toxin)，属于单端孢霉烯族A族化合物，是该类化合物中毒性最强、污染水平较高的毒素之一，主要由镰刀霉菌产生。T-2毒素主要污染小麦、玉米、大麦、燕麦和黑麦等谷物及麦芽、啤酒和面包等农产品。关于T-2毒素污染情况的报道，大多集中于对谷物和饲料的报道。T-2毒素是体内蛋白质合成的抑制剂，人畜误食病谷后，可引起呕吐、腹泻、发热等急性中毒症状，严重时可损伤造血组织，造成伤亡。此外，T-2毒素还与我国某些地区食管癌、克山病和大骨节病的高发病率有着密切的关系。

T-2毒素的检测方法有气相色谱法、薄层层析法、高效液相色谱法和气质联仪法等。这些方法有的太复杂，有的缺乏灵敏度，有的价格昂贵，不适于常规毒素分析。因此有必要建立一种特异性强、灵敏可靠、简单快速、适于检测大量样品的方法，以便加强对T-2毒素的监控。酶联免疫吸附测定(ELISA)法是一种准确、可靠、快速、特异的检测方法，适合于大量样品的检测。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测T-2毒素的方法及其专用试剂盒。

本发明提供了分泌T-2毒素单抗的杂交瘤细胞株，即为保藏编号为CGMCCNo.3395的T2毒素单克隆抗体杂交瘤细胞株(3E-5A-7H-8B)。该细胞株已于2009年11月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.3395。

本发明还保护一种单克隆抗体，是由保藏编号为CGMCC No.3395的T2毒素单克隆抗体杂交瘤细胞株(3E-5A-7H-8B)分泌产生的。

本发明同时保护一种检测T-2毒素的酶联免疫试剂盒，包括所述单克隆抗体。

所述试剂盒可为如下1)至4)中的任意一种：

1)所述试剂盒包括包被有包被原的酶标板、一抗和酶标二抗；所述包被原为式(I)所示的化合物和载体蛋白偶联得到的偶联物；所述一抗为所述单克隆抗体；

2)所述试剂盒包括包被有包被原的酶标板和酶标半抗原；所述包被原为所述单克隆抗体；所述酶标半抗原中的半抗原为式(I)所示的化合物；

3)所述试剂盒包括包被有包被原的酶标板和酶标一抗；所述包被原为式(I)所示的化合物和载体蛋白偶联得到的偶联物；所述酶标一抗中的一抗为所述单克隆抗体；

4)所述试剂盒包括包被有包被原的酶标板、一抗和酶标半抗原；所述包被原为二抗；所述一抗为所述单克隆抗体；所述酶标半抗原中的半抗原为式(I)所示的化合物；

(式I)。

1)所述试剂盒的检测原理为：当在微孔条上预包被T-2毒素抗原(CMO-T-2-载体蛋白)时，加入样本溶液或标准品溶液后，再加入T-2毒素特异性抗体溶液，样本中残留的T-2毒素或T-2毒素标准品与酶标板上包被的T-2毒素抗原竞争T-2毒素特异性抗体，加入酶标记二抗进行放大作用，用显色液显色，样本吸光值与样本中T-2毒素的含量成负相关，与标准曲线比较即可得出样本中T-2毒素的含量。同时也可根据酶标板上颜色的深浅，与系列浓度T-2毒素标准品溶液颜色比较粗略判断样品中T-2毒素含量的浓度范围。

2)所述的试剂盒的检测原理为：当在微孔条上预包被T-2毒素特异性抗体时，加入样本溶液或标准品溶液后，再加入酶标记T-2毒素半抗原溶液，样本中残留的T-2毒素或T-2毒素标准品与酶标记半抗原(CMO-T-2)竞争包被在酶标板上的T-2毒素特异性抗体，用显色液显色，样本吸光值与T-2毒素的含量成负相关，与标准曲线比较即可得出样本中T-2毒素的含量。同时也可根据酶标板上的颜色深浅，与系列浓度的T-2毒素标准品溶液颜色比较粗略判断样品中T-2毒素含量的浓度范围。

3)所述的试剂盒的检测原理为：当在微孔条上预包被T-2毒素抗原(CMO-T-2-载体蛋白)时，加入样本溶液或标准品溶液后，再加入酶标记T-2毒素特异性抗体溶液，样本中的T-2毒素或T-2毒素标准品与酶标板上包被的T-2毒素抗原竞争T-2毒素特异性抗体，用显色液显色，样本吸光值与样本中T-2毒素的含量成负相关，与标准曲线比较即可得出样本中T-2毒素的含量。同时也可根据酶标板上的颜色深浅，与系列浓度T-2毒素标准品溶液颜色比较粗略判断样品中T-2毒素含量的浓度范围。

4)所述的试剂盒的检测原理为：当在微孔条上预包被二抗时，加入T-2毒素抗体孵育后，加入样本溶液或标准品溶液，再加入酶标记T-2毒素半抗原(CMO-T-2)溶液，样本中的T-2毒素或T-2毒素标准品与酶标记T-2毒素半抗原竞争T-2毒素特异性抗体，用显色液显色，样本吸光度值与样本中T-2毒素的含量成负相关，与标准曲线比较即可得出样本中T-2毒素的含量。同时也可根据酶标板上的颜色深浅，与系列浓度T-2毒素标准品溶液颜色比较粗略判断样品中T-2毒素含量的浓度范围。

所述的载体蛋白可为牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、鼠血清蛋白(MSA)、甲状腺蛋白(BCG)、兔血清白蛋白(RSA)、血蓝蛋白(KLH)或卵清白蛋白(OVA)，其中优选BSA、KLH。

所述二抗可为羊抗鼠二抗或羊抗兔二抗。

所述试剂盒还可包括T-2毒素标准品溶液、底物显色液、终止液、浓缩洗涤液、样品浓缩液等组分。把浓缩液进行20倍稀释，即为检测中使用的样品稀释液。

所述T-2毒素标准品溶液，可以是一定浓度范围内的多种浓度的标准溶液，其浓度可在0-4ng/mL之间。例如可以是含有8瓶的标准品溶液，其浓度分别为0ng/mL、0.2ng/mL、0.4ng/mL、0.8ng/mL、1.6ng/mL、3.2ng/mL。

所述浓缩洗涤液可采用任何本领域常用的浓缩洗涤液，优选为磷酸盐缓冲液，例如含有吐温和叠氮钠的磷酸盐缓冲液。所述浓缩洗涤液具体可为：将0.8-1.2mL吐温20和0.5g叠氮钠加入100mL pH7.4 0.01M磷酸盐缓冲液得到的溶液。

所述样品浓缩液即为试剂盒应用中的样品稀释液的母液，样品浓缩液稀释后(如稀释至20倍体积)即为样品稀释液。所述样品稀释液优选为磷酸盐缓冲液，例如0.04mol/L pH7.2-7.5的磷酸盐缓冲液，还可以是本领域常用的其它样品稀释液。所述样品浓缩液具体可为0.8mol/L(20×0.04mol/L)pH7.2-7.5的磷酸盐缓冲液。

所述酶标记复合物(酶标记的T-2毒素半抗原、酶标记的T-2毒素特异性抗体、酶标记的二抗)的标记酶可为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶，其中优选辣根过氧化物酶。可采用现有技术中的多种方法将辣根过氧化物酶与二抗进行偶联，如戊二醛法，过碘酸钠法等。具体可采用如下方法将二抗与辣根过氧化物酶(HRP)进行偶联：①将辣根过氧化物酶溶解于蒸馏水中；②加入NaIO₄溶液，室温搅拌反应；③用醋酸盐缓冲液于4℃透析过夜，除去多余的NaIO₄，同时使自身偶联的酶还原；④加入磷酸盐缓冲液和含有IgG(羊抗鼠二抗)的磷酸盐缓冲液，室温搅拌反应；⑤加入NaBH₄水溶液，在4℃反应4h，以还原Schiff碱；⑥纯化保存。该改良的过碘酸钠法省时、降低了辣根过氧化物酶(HRP)与二抗的浓度比率，节省了原材料。当标记酶为辣根过氧化物酶时：底物显色液由显色液A液和显色液B液组成；显色液A液优选为过氧化氢或过氧化脲溶液；显色液B液优选为邻苯二胺或四甲基联苯胺溶液；终止液为硫酸或盐酸溶液，优选为硫酸溶液，其浓度例如为1-2mol/L。当标记酶为碱性磷酸酯酶时：显色液优选为对硝基苯磷酸酯缓冲液；终止液优选为氢氧化钠溶液，其浓度优选为1-2mol/L，更特别的优选为2mol/L。显色液和终止液也可以是本领域常用的其它显色液和终止液。

可采用如下方法用包被原包被酶标板：用包被缓冲液将包被原稀释，并加入各孔中，37℃左右温育数小时(或4℃左右过夜)，倾去包被缓冲液，用洗涤液洗涤，拍干，然后在每孔中加入封闭液，温育，倾去孔内液体拍干，干燥后用铝膜真空密封保存。例如，用包被缓冲液将包被原稀释为0.05-0.1μg/mL，每孔加入100μL，37℃温育2h，倾去包被缓冲液，用洗涤液洗涤2次，每次30s，拍干，然后在每孔中加入150-200μL封闭液，37℃温育1-2h，倾去孔内液体拍干，干燥后用铝膜真空密封保存。

以上包被酶标板的方法中：所用的包被缓冲液优选为碳酸盐缓冲液，例如pH9.6、0.01-0.1mol/L的碳酸钠缓冲液。所用的封闭液优选为磷酸盐缓冲液，例如如下溶液：将0.5mL马血清、0.1g叠氮化钠和3g酪蛋白加入100mL 0.02M pH7.2磷酸盐缓冲液中得到的溶液；包被缓冲液和封闭液也可以是本领域常用的其它包被缓冲液和封闭液。

本发明还保护一种检测样品中T-2毒素的方法，包括如下步骤：

1)将待测样品进行前处理，得到待测样本溶液；

2)用以上任一所述试剂盒对所述待测样本溶液进行检测；

1)将待测样品进行前处理，得到待测样本溶液；

2)用以上任一所述试剂盒对所述待测样本溶液进行检测；

所述待测样品为谷物或饲料；

所述前处理的方法为：

称取待测样品，溶于甲醇/蒸馏水(体积比为80∶20)溶液中，超声波提取，过滤，即为待测样本溶液。

T-2毒素是只有免疫反应性，没有免疫原性，不能诱发机体产生免疫应答，必须与大分子载体蛋白偶联后才具有免疫原性。本发明中将T-2毒素进行结构改造，加入间隔臂，合成了人工抗原。用所述人工抗原免疫动物，获取到了一个杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株分泌得到的单克隆抗体特异性很高。本发明还提供了基于不同ELISA原理的四种试剂盒，可以定性或定量检测谷物、饲料及其加工产品中T-2毒素的含量，样品前处理过程简单，能同时检测大批样品。本发明的试剂盒，操作简便易行，造价低廉，具有特异性高、灵敏度高、精确度高等特点，能够现场监控且适合大量样本(谷物、饲料及其加工产品)筛查，将在T-2毒素的检测中发挥重要作用。

附图说明

图1为T-2毒素的检测标准曲线图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

T-2毒素标准品：Sigma Aldrich公司，CAS号：21259-20-1；DBalb/c小鼠：北京实验动物研究中心；SP2/0骨髓瘤细胞：上海玉博生物科技有限公司；新西兰大白兔：北京实验动物研究中心。

实施例1、试剂盒组分的制备

产率＝转化为产物所消耗掉的主反应物量/主反应物消耗总量×100％。

一、抗原的制备

1、半抗原(CMO-T-2)的制备

所述T-2毒素半抗原是指T-2毒素与O-(羧甲基)羟胺半盐酸盐反应得到的产物(CMO-T-2)。制备的具体步骤如下：

①称取9.5mg T-2毒素溶解于1ml干燥的二氯甲烷中，称为A液；称取17mg氯铬酸吡啶嗡盐(PCC)溶解于2ml干燥的二氯甲烷中，称为B液；

②室温条件下，在搅拌状态下，B液逐滴加入到A液中，搅拌反应66h；

③反应混合物(黑色)用5ml二氯甲烷稀释，5ml饱和食盐水洗涤4次，无水硫酸钠干燥，浓缩得到淡黄色化合物3-Dehydro-T-2 7.7mg，产率81.2％；

④5.0mg 3-Dehydro-T-2溶于3ml 90％甲醇溶液(溶有1mg乙酸钠；体积百分含量)，随后再加入2mg羧甲氧基胺半盐酸盐，室温搅拌过夜；

⑤反应混合物蒸干，10ml乙酸乙酯复溶，10ml 0.1M HCl洗涤3次，蒸干浓缩，得到3.43mg CMO-T-2(式I所示化合物)，产率57.4％。

(式I)

2、抗原(CMO-T-2-载体蛋白)的制备

将T-2毒素半抗原与载体蛋白采用碳化二亚胺法进行偶联得到抗原。

(1)CMO-T-2-BSA的制备

称取5mg CMO-T-2溶于1ml N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，称为A液；20mg BSA和10mg 1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)溶于10ml蒸馏水中，称为B液；在搅拌状态下，A液逐滴加入到B液中，10min后，再加入5mgN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温下搅拌18h，期间通过滴加Na₂HPO₄维持pH在5.5；反应结束后，4℃透析72h，冻干，得到CMO-T-2-BSA，产率为62.3％。

(2)CMO-T-2-OVA的制备

称取5mg CMO-T-2溶于1ml N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，称为A液；20mg OVA和10mg 1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)溶于10ml蒸馏水中，称为B液；在搅拌状态下，A液逐滴加入到B液中，10min后，再加入5mgN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温下搅拌18h，期间通过滴加Na₂HPO₄维持pH在5.5；反应结束后，4℃透析72h，冻干，得到CMO-T-2-OVA，产率为62.3％。

用其它载体蛋白与CMO-T-2偶联，同样可以制备得到抗原，在制备过程中，用其它载体蛋白代替BSA即可。

二、特异性抗体的制备

(一)单克隆抗体的制备

1、动物免疫

将步骤一制备的CMO-T-2-BSA作为免疫原注入到Balb/c小鼠体内，免疫剂量为75μg/只，使其产生多克隆抗体。

2、细胞融合和克隆化

取步骤1的小鼠的脾细胞，按5∶1比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到稳定分泌单克隆抗体的T2毒素单克隆抗体杂交瘤细胞株(3E-5A-7H-8B)。该细胞株已于2009年11月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.3395。

3、细胞冻存和复苏

将T-2毒素的单克隆杂交瘤细胞株3E-5A-7H-8B用冻存液制成1×10⁶个/mL的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。

4、单克隆抗体的制备与纯化

(1)增量培养法：将杂交瘤细胞株3E-5A-7H-8B置于细胞培养基中，在37℃条件下进行培养，用辛酸-饱和硫酸铵法将得到的培养液进行纯化，得到单克隆抗体，-20℃保存。所述细胞培养基是将20mL小牛血清和0.2g碳酸氢钠加入100mLRPMI-1640培养基中得到的；所述细胞培养基的pH为7.4。

抗体效价的测定：通过棋盘法测定抗体的效价为1.5×10⁷，其中包被抗原为CMO-T-2-OVA。

(2)上述单克隆抗体还可以采取以下方法制备：将Balb/c小鼠腹腔注入灭菌石蜡油0.4mL/只，7天后腹腔注射T-2毒素的单克隆杂交瘤细胞株3E-5A-7H-8B5×10⁵个/只，7天后采集腹水。用辛酸-饱和硫酸铵法进行纯化，纯化后的腹水放入-20℃环境保存。

当抗原为其他载体蛋白与CMO-T-2的偶联物时，单克隆抗体的制备方法同上。

(二)多克隆抗体的制备

采用新西兰大白兔作为免疫动物，采用步骤一制备的CMO-T-2-BSA为免疫原，免疫剂量为1.5mg/kg；首免时将免疫原与等量的弗氏完全佐剂混合制成乳化剂，颈背部皮下多点注射，间隔3～4周取相同剂量免疫原加等量弗氏不完全佐剂混合乳化，加强免疫一次，共免疫5次，最后一次不加佐剂；最后一次免疫10天后采血，测定血清抗体效价，心脏采血，用硫酸铵分级沉淀得到纯化的多克隆抗体。

当抗原为其他载体蛋白与CMO-T-2的偶联物时，多克隆抗体的制备方法同上。

三、二抗的制备

以山羊作为免疫动物，以步骤二的(一)的4的(1)制备的单克隆抗体为免疫原对无病原体山羊进行免疫，得到羊抗鼠二抗。以山羊作为免疫动物，以步骤二的(二)制备的多克隆抗体为免疫原对无病原体山羊进行免疫，得到羊抗兔二抗。

用其它动物制备二抗时，用特异性抗体(单克隆抗体或多克隆抗体)免疫动物即可。

四、酶标复合物的制备

1、酶标记羊抗鼠二抗的制备

采用改良的碘酸钠法将步骤三制备的羊抗鼠二抗与辣根过氧化物酶(HRP)进行偶联，具体方法如下：

①将8mg辣根过氧化物酶溶解于2mL蒸馏水中。

②加入现配制的100mmol/L NaIO₄溶液0.4mL，室温搅拌反应20min。

③用1mmol/L醋酸盐缓冲液于4℃透析过夜，除去多余的NaIO₄，同时使自身偶联的酶还原。

④加入磷酸盐缓冲液(pH8.6、0.5mol/L)40μL和含有IgG(羊抗鼠二抗)16mg的磷酸盐缓冲液(pH 8.6、5mol/L)2.0mL，室温搅拌反应4h。

⑤加入现配制的NaBH₄水溶液(1mol/L)0.1mL，在4℃反应4h，以还原Schiff碱。

⑥纯化保存。

改良的碘酸钠法省时，且降低辣根过氧化物酶(HRP)与二抗的浓度比率，节省了原材料。

用其它二抗制备酶标二抗的方法参见酶标羊抗鼠二抗的制备方法。

五、酶标板的包被

包被缓冲液为pH9.6、0.01～0.1mol/L的碳酸钠缓冲液；封闭液为：将0.5mL马血清、0.1g叠氮化钠和3g酪蛋白加入100mL pH7.2 0.02M磷酸盐缓冲液中得到的。

用包被缓冲液将步骤一制备的CMO-T-2-OVA稀释成0.5-10.0μg/mL，每孔加入100μL，37℃温育2h(或4℃过夜)，倾去包被缓冲液，用样品稀释液(将样品浓缩液20倍稀释)洗涤2次，每次30s，拍干，然后在每孔中加入200μL封闭液，37℃温育2h，倾去孔内液体，拍干，干燥后用铝膜真空密封保存。即为包被有包被原(CMO-T-2-OVA)的酶标板。

包被有其它包被原的酶标板的制备方法同上，用其它包被原(如其他载体蛋白与CMO-T-2的偶联物、步骤二制备的特异性抗体或步骤三制备的二抗)代替CMO-T-2-OVA即可。

实施例2、检测呕吐毒素的酶联免疫试剂盒的制备、应用和性能鉴定

一、试剂盒的组成

1、T-2毒素标准品溶液

T-2毒素标准品溶液6瓶，浓度分别为0ng/mL、0.2ng/mL、0.4ng/mL、0.8ng/mL、1.6ng/mL、3.2ng/mL。

2、底物显色液

底物显色液由A液和B液组成，底物显色液A液为2％过氧化脲溶液，底物显色液B液为1％四甲基联苯胺溶液(TMB)。

3、终止液

终止液为2mol/L硫酸。

4、浓缩洗涤液

浓缩洗涤液为将1.0mL吐温20和0.5g叠氮钠加入100mL pH7.4 0.01M磷酸盐缓冲液得到的溶液。

5、样品浓缩液

样品浓缩液为0.8mol/L(20×0.04mol/L)pH7.3的磷酸盐缓冲液。

6、包被有包被原的酶标板

实施例1制备的包被有CMO-T-2-OVA的酶标板。

7、酶标二抗

实施例1制备的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗。

8、一抗

实施例1的步骤二的(一)的4的(1)制备的单克隆抗体。

二、应用试剂盒进行检测的方法

1、谷物和饲料样品的前处理

称取5g粉碎后的样品，溶于25ml甲醇/蒸馏水(体积比为80∶20)溶液中，室温条件下，超声波提取20min。过滤后，取1ml上清液溶于4ml样品稀释液(将样品浓缩液20倍稀释)中，充分混匀。取50μl稀释后滤液进行检测。

2、用试剂盒对样品进行检测

向包被有包被原的酶标板微孔中加入T-2毒素标准品溶液或样本溶液50μL，再加入一抗50μL，用盖板膜封板，37℃恒温箱中反应30min，倒出孔中液体，每孔加入250μL浓缩洗涤液，30s后倒出孔中液体，如此重复操作共洗板5次，用吸水纸拍干。加入酶标二抗100μL，37℃恒温箱中反应30min，倒出孔中液体，重复洗涤步骤，每孔加入底物显色液A液，底物显色液B液，轻轻振荡混匀，37℃恒温箱避光显色15min，每孔加入2mol/L终止液50μL，轻轻振荡混匀，用酶标仪，测定每孔吸光度值。

3、检测结果分析

用得的每个浓度的标准品溶液的吸光度平均值(B)除以第一个标准品溶液(0标准)的吸光度值(B₀)再乘以100％，得到百分吸光度值(百分吸光度值(％)＝(B/B₀)×100％)。以T-2毒素标准品浓度(μL/L)为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线图(见图1)。用同样的办法计算样品溶液的百分吸光度值，相对应每一个样品的浓度，则可从标准曲线上读出样本中T-2毒素的含量。

检测结果的分析也可以采用回归方程法，计算出样品溶液浓度。检测结果的分析还可以利用计算机专业软件，此法更便于大量样品的快速分析，整个检测过程只需较短时间，1.5h内即可以完成。

三、试剂盒的性能鉴定

1、标准品精密度试验

分别从三个不同的时间段制备的酶标板中各抽出一批酶标板，每批各抽取10个试剂盒，每板各抽出20个微孔，测定0.8μg/L标准品溶液的吸光度值，计算变异系数，结果见表1。变异系数的计算方法：变异系数(CV)＝测定结果的标准差与其平均值的百分比。

表1标准品精密度试验结果(CV％)

通过上述试验结果可以得出，每批试剂盒各测定10次标准品变异系数在4.6％-13.5％之间，符合精密度小于或等于20％的规定。

2、样本精密度和准确度试验

a.样品精密度试验：

向不含T-2毒素的样品(小麦或饲料)中添加T-2毒素标准品，使T-2毒素在小麦中的浓度为5ng/g、在饲料中的浓度为10ng/g，每个样品设置5个重复。分别取三个不同批次的试剂盒各三个，分别计算变异系数。试验结果分别见表2和表3。板内变异系数的计算方法：板内变异系数＝同一次测定的同一块板内某样本(一般为中等水平)重复测定次数所得结果的变异系数。

批内变异系数的计算方法：批内变异系数＝同一次测定中各平行样本的变异系数。

批间变异系数的计算方法：批间变异系数＝同一样本在不同批次测定结果的变异系数，取其平均值。

表2小麦的精密度试验结果(添加浓度5ng/g)

表3饲料样品精密度试验(添加浓度10ng/g)

结果表明，本试剂盒对以上2种添加样品，板内变异系数小于10％，批内变异系数小于15％，批间变异系数小于20％，满足试剂盒精密度的规定。

b.样本回收率试验

向不含T-2毒素的样品(小麦或饲料)中添加T-2毒素标准品，得到如下四种样品：T-2毒素在小麦中的浓度为5ng/g；T-2毒素在小麦中的浓度为10ng/g；T-2毒素在饲料中的浓度为5ng/g；T-2毒素在饲料中的浓度为10ng/g；每个样品设置5个重复。分别取三个不同批次的试剂盒各三个，分别计算回收率。试验结果分别见表4。回收率＝实测值/添加值。

表4试剂盒的样本回收率测定

从表中可看出，小麦样品的添加回收率在73％-113％之间；饲料样品的添加回收率在69％-100％之间，符合准确度的测定标准。

3、交叉反应率试验

选择与T-2毒素类似结构的化合物，测定交叉反应率。通过各种标准曲线分别得到其50％抑制浓度。用下式计算试剂盒对其它类似物的交叉反应率。

结果见表5。

表5试剂盒的特异性

名称	购买途径	交叉反应率(％)
			T-2毒素	Sigma Aldrich公司产品目录号：33947	100.0
HT-2毒素	Sigma Aldrich公司产品目录号：34136	8.0
			HT-2毒素	Sigma Aldrich公司产品目录号：T127	＜1.0

黄曲霉毒素B1	Sigma Aldrich公司产品目录号：34029	＜1.0
			呕吐毒素(DON)	Sigma Aldrich公司产品目录号：32943	＜1.0

4、试剂盒的保存期

试剂盒保存条件为2-8℃，经过12个月的测定，试剂盒的最大吸光度值(零标准)、50％抑制浓度、T-2毒素添加实际测定值均在正常范围之内。考虑到运输和使用过程中，会有非正常保存条件出现，将试剂盒在37℃保存的条件下放置8天，进行加速老化实验，结果表明该试剂盒的各项指标完全符合要求。考虑到试剂盒冷冻情况发生，将试剂盒放入-20℃冰箱冷冻8天，测定结果也表明试剂盒各项指标完全正常。从以上结果可得出试剂盒可以在2-8℃至少可以保存12个月以上。

5、试剂盒的最低检测限

本试剂盒对小麦等谷物样品的最低检测限为4ppb，对饲料样品的最低检测限为3.5ppb。

Claims

1.保藏编号为CGMCC No.3395的T2毒素单克隆抗体杂交瘤细胞株。

2.一种单克隆抗体，是由保藏编号为CGMCC No.3395的T2毒素单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌产生的。

3.一种检测T-2毒素的酶联免疫试剂盒，包括包被有包被原的酶标板、一抗、酶标二抗、底物显色液、终止液、浓缩洗涤液和样品浓缩液；

所述包被原为式(I)所示的化合物和载体蛋白偶联得到的偶联物；所述包被原的制备方法如下：称取5mg式(I)所示的化合物溶于1ml N，N-二甲基甲酰胺中，称为A液；20mg卵清白蛋白和10mg 1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶于10ml蒸馏水中，称为B液；在搅拌状态下，A液逐滴加入到B液中，10min后，再加入5mg N-羟基琥珀酰亚胺，室温下搅拌18h，期间通过滴加Na₂HPO₄维持pH在5.5；反应结束后，4℃透析72h，冻干，得到包被原；

(式I)；

所述一抗为权利要求2所述单克隆抗体；

所述酶标二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗；

所述底物显色液由A液和B液组成，底物显色液A液为2％过氧化脲溶液，底物显色液B液为1％四甲基联苯胺溶液；

所述终止液为2mol/L硫酸；

所述浓缩洗涤液为将1.0mL吐温20和0.5g叠氮钠加入100mL pH7.40.01M磷酸盐缓冲液得到的溶液；

所述样品浓缩液为0.8mol/L pH7.3的磷酸盐缓冲液。

4.一种检测样品中T-2毒素的方法，包括如下步骤：

1)将待测样品进行前处理，得到待测样本溶液；

2)用权利要求3所述试剂盒对所述待测样本溶液进行检测；

所述待测样品为谷物或饲料；

所述前处理的方法为：称取待测样品，溶于20体积份甲醇和80体积份水的混合液中，超声波提取，过滤。