CN101429250A - 霉菌毒素青霉酸单克隆抗体及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种霉菌毒素青霉酸单克隆抗体及其制备方法。其步骤为将青霉酸分别与载体蛋白偶联获得完全抗原，再以完全抗原免疫小鼠，然后采用杂交瘤技术，经细胞融合、筛选、克隆、扩大培养和动物体内诱生腹水法获得单克隆抗体。所得的抗体效价为1∶2.05×105，抗体类型为IgG1型，与黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、T－2毒素和伏马毒素均无交叉反应率，亲和常数为1.54×108L/mol，可以用于研制检测青霉酸的ELISA试剂盒。
Description
技术领域
本发明属于生物免疫技术领域，涉及霉菌毒素青霉酸单克隆抗体及其制备方法。
背景技术
近年来随着养殖业的集约化生产，饲料工业蓬勃发展，由饲料霉变问题开始引起人们的高度关注。霉菌对饲料的污染是十分常见的，饲料被霉菌污染后，除了会引起饲料的变质外，更为严重的是这些霉菌可以产生具有致畸、致癌、致突变“三致”效应的霉菌毒素而引起中毒，给养殖业造成巨大的经济损失。据世界粮农组织报告，全球每年大约有25％的农作物受到霉菌及毒素的污染，造成的直接和间接经济损失达数千亿美元。另外，饲料中的霉菌毒素还可能通过食物链，或通过吸入及皮肤接触而对人体产生危害。因此，预防和控制饲料霉菌毒素污染是保障其质量安全的主要内容，而对霉菌毒素的准确、快速检测则是预防和控制饲料霉菌毒素污染的关键内容。
据统计，饲料中真菌有毒代谢产物及真菌毒素共21类，340余种。其中黄曲霉毒素(AF)为公认的危害最严重的毒素，但由于霉菌或毒素很少是单独存在，且毒素之间有累加、协同甚至增强作用，这使对其他毒素，尤其是高产毒素的危害引起重视。圆弧青霉菌毒素就是高产毒素类的一种，由青霉菌属圆弧青霉菌产生，是一类多聚乙酰类霉菌毒素，其中以青霉酸为主。据袁慧报道，青霉菌在饲料中的污染率占89.30％，而圆弧青霉菌占青霉菌污染率的60.30％，圆弧青霉菌毒素(青霉酸占90％以上)的平均含量为0.38％，最高为1.4％。Kurtzman &Ciegler曾报道，霉变饲料中该毒素含量高达2％。由此可见，饲料中圆弧青霉菌毒素的含量很高。青霉酸(Penicillic Acid，PA)是圆弧青霉有毒代谢产物的主要成分，自1931年由Alsbrg和Black首次从侵染软毛青霉的玉米中分离出后，到现在查明有曲霉属、青霉属和瓶梗青霉属共28种真菌能产生青霉酸，是饲料中主要真菌毒素之一。国内外许多研究表明青霉酸对各种动物均具有毒性。何祖平、袁慧等所做的青霉酸对尼西鸡的毒性作用实验表明，中毒尼西鸡的主要病理变化是肝脏细胞脂肪变性、肾小管上皮细胞浊肿、心肌细胞颗粒变性；红细胞平均压积(MCV)和红细胞平均血红蛋白浓度(MCHC)显著低于对照组，而谷丙转氨酶(SGPT)、乳酸脱氢酶(LDH)和碱性磷酸酶(AKP)等血清酶活性显著高于对照组；青霉酸在各脏器中含量分布依次为肝>肾>心，表明肝脏是青霉酸作用的靶器官。青霉酸对体外培养的小鼠肺脏巨噬细胞的毒性实验表明，巨噬细胞中ATP减少，青霉酸能阻止亮氨酸进入蛋白质，从而影响RNA转录和蛋白质合成，阻碍肺泡巨噬细胞的吞噬功能。青霉酸能抑制Na+、K+、Ca2+进入青蛙的离体心肌，引起心脏功能障碍。有实验表明对体外培养的小鼠成纤维细胞，当青霉酸浓度大于5mg/ml时，可以抑制DNA的合成，而对体外培养的中国仓鼠卵巢细胞，当浓度大于0.5mg/ml，可以诱导DNA单链断裂，另有报道PA能抑制细胞凋亡，这些说明青霉酸是一种潜在的致癌物。而且青霉酸与饲料中其他毒素(如赭曲霉素A、展青霉毒素、红青霉毒素B及桔青霉毒素等)同时存在时，有毒性增强作用。有研究发现，PA能抑制胰羧肽酶A的活性，从而使胰羧肽酶A对赭曲霉素A的解毒作用得到抑制。当青霉酸与赭曲霉素A共同作用于雏鸡时，引起肝脏和肾脏的上皮细胞颗粒变性和水泡变性，单核细胞增多，免疫器官(如脾、法氏囊等)萎缩，淋巴细胞减少。用含有青霉酸与赭曲霉素A的饲料饲喂仔猪，由于协同作用使赫曲霉素A毒性作用增强，使早期出现肾近曲小管上皮脏细胞变性，后期间质增生；对小鼠的实验表明，两毒素单独存在时不引起死亡，而同时存在时死亡率达20％，主要病理变化为多病灶性肾小管坏死。由此可见，青霉酸对动物和人类的健康都构成了严重的威胁。
目前，对于青霉酸的测定主要有生物鉴定法、仪器分析法，现在还没有建立免疫检测方法。仪器分析方法常用的薄层色谱(TLC)、高效液相色谱(HPLC)方法操作烦琐、样品前处理复杂，所需仪器价格昂贵，操作时需要专门的技术人员，不适于推广应用。而免疫分析法主要应用了抗原抗体免疫反应的特异性，灵敏度高，干扰小，操作简便，非常适合真菌毒素的快速分析及技术推广。因此，本发明提供青霉酸单克隆抗体及其制备方法，为建立青霉酸免疫快速检测方法奠定基础。
发明内容
本发明的目的旨在提供一种青霉酸单克隆抗体。
本发明的第二个目的旨在提供一种能产生青霉酸单克隆抗体的杂交瘤细胞。
本发明的第三个目的旨在提供一种能产生青霉酸单克隆抗体的杂交瘤细胞的制备方法。
本发明的第四个目的旨在提供一种青霉酸单克隆抗体的制备方法
本发明的目的是通过以下方式实现的：
一种青霉酸单克隆抗体是能特异性地与青霉酸结合的IgG1型单克隆抗体，所述单克隆抗体是完全抗原PA-BSA(预先合成)免疫小鼠脾脏所得脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合得到的杂交瘤细胞产生的。
所述的小鼠脾脏是用完全抗原PA-BSA免疫Balb/c小鼠，免疫四次后采血检测血效价，选择抗血清效价高、竞争抑制强的小鼠脾脏；所述的杂交瘤细胞是将免疫3天后脾细胞与SP2/0细胞按10：1的比例在50％PH8.0的PEG作用下进行细胞融合；然后选择性培养，用已建立好的间接ELISA进行阳性克隆的筛选，筛选出的阳性克隆细胞采用有限稀释法进行3次连续克隆，直到阳性率达100％获得的；所述杂交瘤细胞的染色体数目为95-108条，平均98条。
所得到的单克隆抗体与黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、T-2毒素和伏马毒素均无交叉反应率。
制备青霉酸单克隆抗体的方法包括以下步骤：将青霉酸分别与载体蛋白偶联获得完全抗原，免疫小鼠，选择抗血清效价高、竞争抑制强的小鼠脾脏进行免疫，然后采用杂交瘤技术，把骨髓瘤细胞和免疫的小鼠脾细胞融合、克隆筛选、扩大培养和动物体内诱生腹水法获得单克隆抗体。
制备所述青霉酸单克隆抗体的方法包括以下具体步骤：首先合成完全抗原PA-BSA，然后用完全抗原PA-BSA免疫Balb/c小鼠，免疫四次后采血检测血效价。选择抗血清效价高、竞争抑制强的小鼠脾脏进行第五次免疫，不加佐剂；免疫3天后取脾细胞与清SP2/0细胞按10：1的比例在50％PH8.0分子量1450的PEG作用下进行细胞融合；然后用HAT和HT培养基进行选择性培养，用已建立好的间接ELISA进行阳性克隆的筛选，筛选出的阳性克隆细胞采用有限稀释法进行3次连续克隆，直到阳性率达100％；再取阳性杂交瘤细胞注射到BALB/c小鼠腹腔内，每只0.5-1×106个细胞，10天后当小鼠腹部明显增大时收集腹水，离心去油脂和沉淀后，取上清液，采用饱和硫酸铵和辛酸-硫酸铵沉淀法提纯，获得单克隆抗体。
具体检测方法如下：
1、通过SDS-PAGE凝胶电泳测定，纯化后的单克隆抗体有一条约57KD的重链带和一条约25KD的轻链带，蛋白质的分子量为164KD。见图1，1：两次纯化后的单抗2：粗提纯后的单抗M：低分子量蛋白标准。
2、根据紫外扫描结果计算出单克隆抗体蛋白质的含量为2.56mg/mL。间接ELISA法检测单克隆抗体亚类的免疫球蛋白亚型为IgG1型，杂交瘤细胞株上清液体的抗体效价为1：400，腹水的效价为1：2.05×105。
3、用不同稀释度的单克隆抗体分别与青霉酸、BSA、OVA、黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、T-2毒素和伏马毒素进行竞争ELISA试验，根据结果分别绘制曲线，根据曲线计算半数抑制率，然后计算交叉反应率。结果得出单克隆抗体与青霉的结合率为100％，而与其它几种毒素均无交叉反应率。
4、采用间接非竞争ELISA法进行单克隆抗体亲和力的测定，用不同浓度抗原包被，根据吸光度与稀释度的关系，描绘出抗体的稀释曲线，计算出单抗的亲和常数为1.54×108L/mol。见图2。
目前，对于青霉酸的测定主要有生物鉴定法、仪器分析法，现在还没有建立免疫检测方法。仪器分析方法常用的薄层色谱(TLC)、高效液相色谱(HPLC)方法操作烦琐、样品前处理复杂，所需仪器价格昂贵，操作时需要专门的技术人员，不适于推广应用。而免疫分析法主要应用了抗原抗体免疫反应的特异性，灵敏度高，干扰小，操作简便，非常适合真菌毒素的快速分析及技术推广。本发明杂交瘤细胞株上清液体的抗体效价为1∶400，腹水的效价为1：2.05×105；所得到的单克隆抗体与黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、T-2毒素和伏马毒素均无交叉反应率；单抗的亲和常数为1.54×108L/mol，为建立青霉酸免疫快速检测方法奠定基础。
附图说明
图1为单克隆抗体SDS-PAGE凝胶电泳结果图；
图2为不同抗原包被浓度时单克隆抗体的稀释曲线；
图3为分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞染色体核型图。
具体实施方式
以下实例仅用于说明本发明，但不用于限制本发明的范围。
材料与仪器
动物及细胞
SP2/0细胞购于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，BABL/C小鼠(8周龄)购于中南大学实验动物中心，昆明鼠购于湖南中医药大学。
主要试剂、耗材与仪器
| 试剂等名称 | 公司 |
| 青霉酸 | Iris Biotech GmbH公司 |
| 牛血清白蛋白BSA、卵清蛋白OVA | Sigma公司 |
| 水溶性碳化二亚胺(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、二甲基甲酰胺(DMF) | Sigma公司 |
| 考马斯亮蓝 | Sigma公司 |
| 弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂 | Gibco公司 |
| 透析袋 | 北京索莱宝生物技术有限公司 |
| Na2CO3、NaHCO3、硫酸铵 | 国药集团化学试剂有限公司 |
| NaCl、KCl、KH2PO4、Na H2PO4·12H2O | 国药集团化学试剂有限公司 |
| HRP酶标兔抗鼠(酶标二抗) | 北京中杉金桥生物技术有限公司 |
| 可溶性单组分TMB底物溶液 | 北京天根生化科技有限公司 |
| HAT和HT培养基 | Sigma公司 |
| PEG | Sigma公司 |
| 鼠单抗分型检测试剂 | Sigma公司 |
| PRMI1640培养基 | Hyclone公司 |
| 新生牛血清、胎牛血清 | Hyclone公司 |
| 弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂 | Gibco公司 |
| 台盼兰 | 北京索莱宝生物技术有限公司 |
| 96孔酶标板和细胞培养板 | Costar公司 |
| 紫外可见分光光度计 | Unico-3802 |
| 酶标仪 | AT-858 |
| 微量移液器 | Gilson |
| 倒置显微镜 | Motic公司 |
| CO2培养箱 | SANYO |
| 低温冷冻离心机 | Hermle Z383K |
| 电泳仪 | 北京市六一仪器厂 |
| 超净工作台 | 苏净集团安泰公司 |
实施例1
动物免疫方案
通过碳二亚胺法将青霉酸(PA)分别与牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)偶联获得完全抗原PA-BSA和PA-OVA。取2g PA，23g EDC，9.2mg NHS，充分溶解于1mL DMF中，4℃搅拌反应6h。取6.5mg BSA溶解于2.0mL 0.01M磷酸缓冲液(PBS，PH7.4)中，缓慢加入反应液中，边加边摇晃，室温避光反应12h。将反应产物用0.01M磷酸缓冲液(PH7.4)在4℃下透析72h，第一天每4h换透析液一次，以后每12h换透析液一次。分装后于-20℃保存。采用相同的方法将青霉酸与卵清蛋白(OVA)偶联，以17mg OVA取代BSA，其他步骤相同，获得完全抗原PA-BSA和PA-OVA。选用12只8周龄BABL/C小鼠进行免疫，免疫原为完全抗原PA-BSA，每次免疫剂量为100μg/只，腹腔注射，每两周免疫一次。初次免疫采用弗氏完全佐剂乳化完全抗原，加强免疫采用弗氏不完全佐剂乳化完全抗原。免疫7天后断尾采血，用间接ELISA法检测血清效价。用包被液(碳酸盐缓冲液)将PA-OVA以1：400倍稀释，按每孔100μl/孔包被酶标板，37℃温育1h，倒出孔内液体，用洗涤液(含0.05％吐温-20的PBS液)洗涤3次。加封闭液(1％牛血清蛋白液)100μl/孔，37℃温育1h，倒出孔内液体，洗涤3次。待检血清样品倍比稀释后，100μl/孔，37℃温育1h，洗涤3次。酶标二抗以1：1000倍稀释后加入100μl/孔，37℃温育1h，洗涤3次。加入TMB底物溶液100μl/孔，避光静置10min，加终止液(2MH2SO4)50μl/孔，采用酶标仪测定450nm处OD值。当OD值大于或等于阴性对照OD值2倍时的最高血清稀释倍数为血清效价。第四次免疫7天后小鼠血清平均效价为1:12800。
实施例2
细胞融合、筛选及克隆方案
饲养细胞的制备：融合前1-2天，取2只小鼠摘眼球放血，颈部脱臼处死，75％酒精浸泡消毒10分钟，然后将小鼠固定于超净工作台的鼠板上。打开腹部皮肤，充分暴露腹膜。用5ml注射器取5ml1640培养液注射入腹腔，注射器不取出，用镊子夹住酒精棉球按摩两侧腹部1分钟，然后吸出培养液，置于50ml离心管中。同法进行三次。将离心管中液体1000rpm离心10分钟，弃上清。用50mlHAT培养液悬浮细胞，分别滴加到5块96孔细胞培养板中，37℃，5％CO2中培养。
SP2/0骨髓瘤细胞的准备：融合前36-48h将培养好处于对数生长期的骨髓瘤细胞扩大培养，融合前用弯头吸管将细胞从细胞培养瓶壁上吹下，收集于50ml离心管中，1000rpm离心10分钟，弃上清。再加入20ml1640培养液，重新混匀，1000rpm离心10分钟，弃上清，加10ml1640培养液，混匀。取细胞悬液0.1ml，再加入0.9ml1％台盼兰，混匀，滴于计数板上显微镜下计数，备用。
脾细胞的准备：选择抗血清效价高的BABL/C小鼠于融合前3天腹腔加强免疫1次，免疫原为PA-BSA，100μg/只，不加佐剂。融合前取小鼠摘眼球放血，颈部脱臼处死，75％酒精浸泡消毒10分钟，然后将小鼠固定于超净工作台的鼠板上。无菌打开腹腔，取出脾脏，于含10ml1640培养液的平皿中洗涤两次，去掉周围的脂肪组织与结缔组织，置于含10ml1640培养液的平皿中。取200目网筛放于平皿中，加1640培养液至浸没网筛，将脾脏置于网筛上培养液中，用L型棒轻轻挤压脾脏，使脾细胞完全进入培养液中。将脾细胞液吸入50ml离心管中，1000rpm离心10分钟，弃上清，再加10ml1640培养液，混匀。同上细胞计数，备用。
细胞融合：取脾细胞(108左右)与SP2/0(107左右)骨髓瘤细胞细胞充分混匀于50ml离心管中，1000rpm离心8分钟，弃干净上清液体。用手掌轻击离心管底，使细胞沉淀松散混匀，然后置于37℃水中预热。同时，用1ml吸管吸1ml 50％ PEG(分子量为1450，PH8.0)在50秒内均匀加入离心管，边加边混匀，使细胞与PEG充分接触，静置90秒，再在2分钟内加入20-30ml 1640培养液，37℃静置10分钟。800rpm离心8分钟，弃上清，用50mlHAT培养液悬浮细胞，分别滴加预先已经制备好饲养细胞的5块96孔细胞培养板中，37℃，5％CO2中培养，7-10天后用一半HT培养液换出HAT培养液，14天后可以用HT培养液培养。
阳性克隆的筛选和克隆：经常观察杂交瘤细胞生长情况，待细胞长到孔底面积的1/10以上时吸出上清供抗体检测。采用已建立的间接ELISA法(同上)，以PA-OVA为包被原，免疫小鼠血清为阳性对照，SP2/0细胞培养上清液为阴性对照，对阳性克隆进行初步筛选。采用已经建立好的间接竞争ELISA对阳性进行杂交瘤细胞进一步的筛选。筛选出的阳性杂交瘤细胞采用有限稀释法进行克隆。克隆前1-2天按前述方法制备饲养细胞。先将需克隆的阳性杂交瘤细胞按前述方法用1％台盼兰染色，计数板计数，根据计数结果将细胞倍比稀释至10个/ml，分别加入已经制备好饲养细胞的5块96孔细胞培养板中，100μl/孔，37℃，5％ CO2中培养，仔细观察各孔细胞的生长情况。取单个克隆的孔细胞上清液进行抗体检测，检测结果为阳性的克隆继续扩大培养和进行下一次克隆，连续3次克隆，直到阳性率达100％。
实施例3
单克隆抗体腹水的制备和纯化方案
取6只BALB/c小鼠，腹腔注射灭菌液体石蜡0.5ml/只，1-2周后接种杂交瘤细胞(1-2×106/ml)，0.5ml/只，7-12d后当小鼠腹部明显增大时用注射器收集腹水，4℃下10000rpm离心10分钟，去油脂和沉淀后，取上清液，-20℃保存备用。腹水的纯化采用饱和硫酸铵法，具体步骤为：取腹水样品10ml，加10mlPBS(0.02M，PH7.0)，在冰上缓慢加入饱和硫酸铵溶液20ml，边加边搅匀，搅拌10分钟，4℃过夜。4℃，12000rpm离心10分钟，弃上清，沉淀用12mlPBS溶解，同上加入饱和硫酸铵溶液8ml，搅拌10分钟，4℃静置1小时。4℃，12000rpm离心10分钟，弃上清，沉淀用13.4mlPBS溶解，同上加入饱和硫酸铵溶液6.6ml，搅拌10分钟，4℃静置1小时。4℃，12000rpm离心10分钟，弃上清，沉淀用少量PBS溶解，装入透析袋中，4℃透析72h，第一天每4h换透析液一次，以后每8h换透析液一次。
实施例4
杂交瘤细胞染色体的分析方案
取生长旺盛的杂交瘤细胞，在加秋水仙素前1-2天传代一次。往培养基中加人最终浓度为0.1μg/ml的秋水仙素，继续培养4h后用弯头吸管将细胞从细胞培养瓶壁上吹下，收集于50ml离心管中，1000rpm离心10分钟，弃上清。加入37℃的0.075mol/L KCl溶液5ml，悬浮沉淀细胞并混匀，37℃水浴20min，加入新配制的固定液(甲醇：冰醋酸＝3：1)1ml，混匀，1000rpm离心10分钟，弃上清。加入固定液5ml，使细胞悬浮并混匀，室温静置20分钟，1000r/min 10分钟，弃去上清液。加入固定液5ml，使细胞悬浮并混匀，室温静置20分钟，1000r/min 10分钟，弃去上清液。加入固定液5ml，使细胞悬浮混匀，4℃过夜，1000r/min 5分钟，吸去上清液，留下0.5ml液体。将细胞悬浮混匀，从高处滴于冷冻的玻片上，并吹散，自然干燥，10％ Giemsa染液染色。在油镜下选择染色体分散良好、无重叠、无散失的细胞进行观察计数。见图3。
实施例5
单克隆抗体亚类的鉴定方案
以包被原PA-OVA(1：400稀释)包被酶标板，100μl/孔，4℃过夜，倒出孔内液体，洗涤液(含0.05％吐温20的PBS液)洗涤3次，再加入杂交瘤细胞培养上清，100μl/孔，室温孵育2h，洗涤3次，然后分别加入抗体亚类分型检测试剂，100μl/孔，室温孵育0.5h，洗涤3次，加HRP标记的羊抗鼠IG(1：1000倍稀释)，室温孵育0.5h，洗涤3次，加新鲜配制的底物溶液，100μl/孔，避光反应10-15min，加终止液(2MH2SO4)50μl/孔终止反应，酶标仪检测相应吸光值。当OD值大于或等于阴性对照OD值2倍时为阳性。
实施例6
单克隆抗体与其他毒素之间交叉反应率的测定方案
以包被原PA-OVA(1：400稀释)包被酶标板，100μl/孔，4℃过夜，倒出孔内液体，洗涤液(含0.05％吐温20的PBS液)洗涤3次。加封闭液(1％牛血清蛋白液)100μl/孔，37℃温育1h，倒出孔内液体，洗涤3次。取不同稀释浓度(1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、1μg/ml)的青霉酸(PA)、黄曲霉毒素B1(AFB1)、玉米赤霉烯酮(ZON)、T-2毒素和伏马毒素(FB)标准品与等体积适度稀释(1：400、1：1600、1：6400、1：25600、1：102400、1：409600、1：1638400)的单抗混合，4℃过夜，加入PA-OVA包被的酶标板中进行反应，100μl/孔，37℃温育1h，倒出孔内液体，洗涤3次。再加酶标二抗(1：1000倍稀释)，100μl/孔，37℃温育1h，洗涤3次。加入TMB底物溶液100μl/孔，避光静置10min，加终止液(2MH2SO4)50μl/孔，采用酶标仪测定450nm处各孔的吸光率(A)。根据公式：竞争抑制率＝(阳性对照孔A值-阻断孔的A值)/阳性对照孔A值×100％计算竞争抑制率，再根据公式：交叉反应率＝抑制率为50％时PA浓度/抑制率为50％时竞争物浓度×100％计算交叉反应率。结果表明单克隆抗体与青霉酸的交叉反应率为100％，与AFB1、ZON、T-2和FB的交叉反应率为0.01％。
实施例7
单克隆抗体亲和力的测定方案
将包被原PA-OVA分别以1.25、2.5和5μg/ml的浓度包被酶标板，100μl/孔，37℃温育1h，倒出孔内液体，用洗涤液(含0.05％吐温20的PBS液)洗涤3次。再加入倍比系列稀释(1：400、1：1600、1：6400、1：25600、1：102400、1：409600、1：1638400)的单克隆抗体，100μl/孔，37℃温育1h，倒出孔内液体，洗涤3次。加酶标二抗(1：1000倍稀释)100μl/孔，37℃温育1h，洗涤3次。加入TMB底物溶液100μl/孔，避光静置10min，加终止液(2MH2SO4)50μl/孔，采用酶标仪测定450nm处各孔的吸光值(A)。以抗体浓度(Ab)为横坐标，吸光值为纵坐标绘制三条不同包被浓度的曲线图，以各条曲线上部趋于平坦段的A值的100％查出A值的一半(即A值的50％)时的相对应的抗体浓度，按公式K＝(n-1)/2(nAb′-Ab)计算K值，公式中Ab′和Ab分别为当抗原浓度为Ag′和Ag时，A值的50％时的抗体浓度(mol/L)，n＝Ag/Ag′。可以得到3个K值，取这3个K值的平均值即为亲和常数，结果为1.54×108L/mol。
Claims (5)
1、一种青霉酸单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体是能特异性地与青霉酸结合的IgG1型单克隆抗体，所述单克隆抗体是完全抗原PA-BSA免疫小鼠脾脏所得脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合得到的杂交瘤细胞产生的。
2、根据权利要求1所述的一种青霉酸单克隆抗体，其特征在于，所述的小鼠脾脏是用完全抗原PA-BSA免疫Balb/c小鼠，免疫四次后采血检测血效价，选择抗血清效价高、竞争抑制强的小鼠脾脏；所述的杂交瘤细胞是将免疫3天后脾细胞与SP2/0细胞按10：1的比例在50％PH8.0的PEG作用下进行细胞融合；然后进行选择性培养，用已建立好的间接ELISA进行阳性克隆的筛选，筛选出的阳性克隆细胞采用有限稀释法进行3次连续克隆，直到阳性率达100％获得的；所述杂交瘤细胞的染色体数目为95-108条，平均98条。
3、根据权利要求1所述一种青霉酸单克隆抗体，其特征在于所得到的单克隆抗体与黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、T-2毒素和伏马毒素均无交叉反应率。
4、一种制备权利要求1所述青霉酸单克隆抗体的方法，其特征在于包括以下步骤：将青霉酸分别与载体蛋白偶联获得完全抗原，免疫小鼠，选择抗血清效价高、竞争抑制强的小鼠脾脏进行免疫，然后采用杂交瘤技术，把骨髓瘤细胞和免疫的小鼠脾细胞融合、克隆筛选、扩大培养和动物体内诱生腹水法获得单克隆抗体。
5、根据权利要求4所述青霉酸单克隆抗体的方法，其特征在于，首先合成完全抗原PA-BSA，然后用完全抗原PA-BSA免疫Balb/c小鼠，免疫四次后采血检测血效价；选择抗血清效价高、竞争抑制强的小鼠脾脏进行第五次免疫，不加佐剂；免疫3天后取脾细胞与清SP2/0细胞按10∶1的比例在50％PH8.0分子量1450的PEG作用下进行细胞融合；然后用HAT和HT培养基进行选择性培养，用已建立好的间接ELISA进行阳性克隆的筛选，筛选出的阳性克隆细胞采用有限稀释法进行3次连续克隆，直到阳性率达100％；再取阳性杂交瘤细胞注射到BALB/c小鼠腹腔内，每只0.5-1×106个细胞，10天后当小鼠腹部明显增大时收集腹水，离心去油脂和沉淀后，取上清液，采用饱和硫酸铵和辛酸-硫酸铵沉淀法提纯，获得单克隆抗体。
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