CN104974255A

CN104974255A - 噻虫啉单克隆抗体的制备及elisa检测方法

Info

Publication number: CN104974255A
Application number: CN201410134725.XA
Authority: CN
Inventors: 相兴伟
Original assignee: Zhejiang Marine Development Research Institute
Current assignee: Zhejiang Marine Development Research Institute
Priority date: 2014-04-04
Filing date: 2014-04-04
Publication date: 2015-10-14

Abstract

本发明公开了一种噻虫啉单克隆抗体的制备，该制备方法包括合成噻虫啉半抗原，将噻虫啉半抗原与牛血清蛋白偶联制备免疫抗原免疫BALB/c小鼠，再用免疫鼠的脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合，经筛选克隆获得持续稳定分泌噻虫啉单克隆抗体的杂交瘤株。本发明的噻虫啉单克隆抗体对对噻虫啉有高亲和力，且该抗体特异性强，与啶虫脒、吡虫啉等结构类似烟碱类杀虫剂无交叉反应。

Description

噻虫啉单克隆抗体的制备及ELISA检测方法

技术领域：

本发明属于免疫学的技术领域，更具体地是涉及噻虫啉单克隆抗体的制备及其检测方法。

背景技术：

噻虫啉是一种新型氯代烟碱类杀虫剂，由德国拜耳农化公司和日本拜耳农化公司合作开发的，对刺吸式和咀嚼式口器害虫有特效。作用机理与其它传统杀虫剂有所不同，它主要作用于昆虫神经接合后膜，通过与烟碱乙酰胆碱受体结合，干扰昆虫神经系统正常传导，引起神经通道的阻塞，造成乙酰胆碱的大量积累，从而使昆虫异常兴奋，全身痉挛、麻痹而死。具有较强的触杀、胃毒和内吸作用，噻虫啉与常规杀虫剂没有交互抗性，因而可用于抗性治理，广泛应用于那些对有机磷类、氨基甲酸酯类、除虫菊酯类已产生抗性的农林业害虫的防治。作为新型仿生物农药，噻虫啉具有高效低毒，安全环保，对环境、林木和果实的影响很小等特点。主要用于水稻、水果、蔬菜、棉花防除大多数害虫。

目前，有关噻虫啉残留检测方法主要是高效液相色谱法（HPLC），刘丽丹等人建立土壤和稻谷中噻虫啉的分析方法，研究噻虫啉在土壤和稻谷中的残留情况；韩振泰等建立了反相高效液相色谱法，用来测定土壤及树干中噻虫啉残留量。由于常规仪器分析方法样品制备繁琐，检测费用较高并且耗时，不适合大量样品快速检测的需求。酶联免疫分析技术完全能满足上述要求。目前，已有很多烟碱类杀虫剂的酶联免疫分析报道，但是对噻虫啉的免疫分析方法尚未见报道。

发明内容：

本发明的目的之一在于通过对噻虫啉分子进行修饰，合成噻虫啉半抗原，制备出了对噻虫啉有高亲和力的抗体。

一种噻虫啉单克隆抗体的制备，所述方法包括合成噻虫啉半抗原，将噻虫啉半抗原与牛血清蛋白偶联制备免疫抗原免疫BALB/c小鼠，再用免疫鼠的脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合，经筛选克隆获得持续稳定分泌噻虫啉单克隆抗体的杂交瘤株，得到所需的产物。

作为该技术方案的更进一步，所述噻虫啉半抗原的合成方法为：

（1）将噻虫啉、β-巯基丙酸和KOH以摩尔比为1：1：2，溶解于DMSO中，同时将温度缓慢升到90-100℃，保持此温度搅拌反应；

（2）待反应结束后，加入水使反应混合物冷却到室温，用2M的盐酸调节pH为3.0，并用二氯甲烷萃取，有机相水洗，无水硫酸钠干燥和减压浓缩后，再经硅胶柱层析，获得白色粉末。

作为该技术方案的更进一步，所述免疫抗原的制备方法为：

（1）将噻虫啉半抗原与N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）以摩尔比为1：3溶解在N，N-二甲基甲酰胺（DMF）中，在室温下搅拌反应；

（2）反应完后，向上述反应液中加入N，N-二甲基甲酰胺（DMF）摩尔量的1/2的二环已基碳二亚胺（DCC），室温下反应过夜，离心后取上清液，缓慢加入到牛血清蛋白（BSA）的CBS（0.1M，pH9.6）中，半个小时加完，磁力搅拌下反应4h；

（3）待反应完成后，装入透析袋，先用蒸馏水透析2次（间隔2-3h），然后用PBS（0.01M，pH7.4）溶液透析3天，每天换液3-5次，透析完成后即得免疫抗原，将免疫抗原分装保存于-20℃的冰箱中。

作为本发明的另一目的，一种噻虫啉单克隆抗体的间接非竞争ELISA检测方法，将噻虫啉半抗原与卵清蛋白（OVA）偶联物为包被抗原。

作为该技术方案的更进一步，所述包被抗原的具体制备方法为：

（1）将噻虫啉半抗原溶解在N，N-二甲基甲酰胺（DMF）中，边搅拌边在溶液中各加入正丁胺和氯甲酸异丁酯，室温下反应；

（2）取上述反应液缓慢加入到卵清蛋白（OVA）的CBS（0.1M，pH9.6）中，磁力搅拌下反应；

（3）待反应完成后，装入透析袋，先用蒸馏水透析2次（间隔2h），然后用PBS（0.01M，pH7.4）透析3天，每天换液3-5次，即得所需产品，将产品分装保存于-20℃的冰箱中。

作为该技术方案的优选，选择甲醇含量为15%、Na⁺浓度为0.1M且pH=7.5的PBS溶液作为缓冲液。

有益效果：本发明的噻虫啉单克隆抗体对对噻虫啉有高亲和力，且该抗体特异性强，与啶虫脒、吡虫啉等结构类似烟碱类杀虫剂无交叉反应。

附图说明：

图1为缓冲液中不同甲醇含量对ELISA的影响结果。

图2为缓冲液中不同Na⁺浓度对ELISA的影响结果。

图3为缓冲液的不同pH值对ELISA的影响结果。

具体实施方式：

下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

一、半抗原的合成

将1.12g(4mmol)噻虫啉，0.42g(4mmol)β-巯基丙酸和0.45g(8mmol)KOH溶解于20mlDMSO中，同时温度缓慢升到100℃，保持此温度搅拌反应2h；待反应结束后，加入50mL水使反应混合物冷却到室温，用2M的盐酸调节pH=3.0并用二氯甲烷萃取（3×30mL），有机相水洗（3×30mL），无水硫酸钠干燥和减压浓缩，经硅胶柱层析，获得白色粉末。

二、人工抗原的制备

免疫抗原的制备：

将噻虫啉半抗原采用活泼酯法与牛血清蛋白（BSA）偶联制备免疫抗原，具体操作方法：将0.2mmol噻虫啉半抗原溶解在1mL的N，N-二甲基甲酰胺（DMF）中，然后在溶液中加入0.6mmol的N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），室温下搅拌反应15min；加入0.3mmol的二环已基碳二亚胺（DCC），室温下反应过夜，离心后取上清液0.5mL，缓慢加入到12mL浓度为10mg/mL的牛血清蛋白（BSA）的CBS（0.1M，pH9.6）中，半个小时加完，磁力搅拌下反应4h，待反应完成后，装入透析袋，先用蒸馏水透析2次（间隔2-3h），然后用PBS（0.01M，pH7.4）溶液透析3天，每天换液3-5次，分装保存于-20℃的冰箱中。

包被抗原的制备：

将噻虫啉半抗原采用混合酸酐法与卵清蛋白（OVA）偶联制备得到包被抗原，具体操作方法：将0.375mmol半抗原溶解在1mL的N，N-二甲基甲酰胺（DMF）中，边搅拌边在溶液中各加入90L正丁胺和45L氯甲酸异丁酯，室温下反应1h，取1mL缓慢加入到24mL浓度为10mg/mL的卵清蛋白（OVA）的CBS（0.1M，pH9.6）中，磁力搅拌下反应2h，待反应完成后，装入透析袋，先用蒸馏水透析2次（间隔2h），然后用PBS（0.01M，pH7.4）透析3天，每天换液3-5次，分装保存于-20℃的冰箱中。

偶联物的测试方法：

采用紫外分光光度法测定偶联物的吸光度并计算结合比。分别将半抗原、载体蛋白质和偶联物配成合适的甲醇或PBS溶液，进行紫外（200nm～400nm）扫描，观察三者吸收峰的变化，若发生明显变化，说明偶联成功。

根据三者在选定波长（280nm）的摩尔吸光系数（ε）估算半抗原与载体蛋白的结合比：

结合比=（ε偶联物-ε载体蛋白）/ε半抗原。

三、单克隆抗体的制备：

具体的操作步骤为：

1、小鼠的免疫及免疫方案

取6-8周龄雌性BALB/c小鼠，将制备的免疫原用PBS缓冲液配置与等体积弗氏完全佐剂混合，充分乳化后，采用腹腔注射的方法进行免疫，抗原免疫用量为200μL/只(以蛋白浓度计)；3周后同样剂量加强免疫，佐剂为弗氏不完全佐剂，共加强免疫四次，融合前3d对小鼠注射与首次免疫等剂量的免疫原（不含任何佐剂）。

2、融合小鼠的选择

BALB/c小鼠从第三次免疫开始，免疫后7天小鼠尾静脉采血，另取未经免疫的BALB/c小鼠作为阴性血清对照。用ELISA法测抗血清的效价，确定是否有针对噻虫啉半抗原的抗体生成。

ELISA法测抗血清的效价：

用间接非竞争ELISA法测定抗体效价，方阵滴定法确定抗体及包被抗原的最佳浓度。当OD值为1.0时，抗体抗原用量较少的浓度组合，即为抗体-抗原的工作浓度。

间接非竞争ELISA法步骤如下：

（1）包被：CBS（0.05M，pH9.6）将包被抗原倍比稀释，100μL/孔，4℃过夜包被；

（2）洗板：用洗涤液PBST洗涤5次，吸水纸拍干；

（3）封闭：每孔加1%OVA的PBS（0.01M，pH7.4）封闭液200μL，37℃温育1h；

（4）洗板：同（2）；

（5）加入一抗：将抗体倍比稀释为100×2n（n=2，3，4，5，6，7）分别加到酶标板中，100μL/孔，空白对照加入100μL/孔PBS溶液，37℃孵育1h。

（6）洗板：同（2）；

（7）加酶标二抗体：用PBST把辣根过氧化物酶-羊抗鼠抗体稀释20000×，100μL/孔，37℃孵育1h；

（8）洗板：同（2）；

（9）显色：每孔加入100μL新鲜配制的显色液，37℃温箱孵育15min；

（10）终止：每孔加50μL2M的H2SO4溶液；

（11）吸光度测定：用酶标仪测定490nm波长处的吸光值。

当包被抗原的浓度为4mg/L时，用间接非竞争酶联免疫吸附测定法（ELISA）测定噻虫啉抗体的效价达到4.2×10⁶。

3、杂交瘤细胞的制备

Sp2/0骨髓瘤细胞的准备：

快速取出液氮罐中的Sp2/0，放入40℃水中，不停摇动冻存管，使其尽快融化，1000rpm离心5min后弃上清，用含20%胎牛血清的DMEM培养基重悬，转入细胞瓶中，37℃、5%CO₂、饱和湿度培养箱中培养。待细胞活力较好的时候，用含有8-AG的20%胎牛血清的DMEM培养基培养一周，杀死其中的突变细胞株，然后扩大培养，冻存。

融合前20d复苏Sp2/0细胞，融合当天取细胞形态均一、边界清晰、生长状态良好的Sp2/0细胞，弃去营养液，用无血清DMEM营养液洗涤后重新悬浮，细胞计数板计数，将细胞稀释为106个/mL，体积为10mL左右，放置37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中融合备用。

饲养细胞的准备：

融合前1d，选择未免疫的8周龄BALB/c雌性小鼠1只，颈椎脱臼处死，75%酒精浸泡消毒5min后，取出小鼠，腹部朝上，将四肢固定于解剖板上，在无菌条件下剪开腹部皮肤，充分暴露腹部；用镊子拎起腹膜，用注射器向腹腔中注入8-10mLDMEM培养液，用酒精棉球轻轻按压腹部，最后用注射器将腹腔内的培养液吸出，悬浮细胞，细胞计数板计数，用HAT液重悬调节细胞数至5×105个/mL，100μL/孔加入96孔培养板，置37℃、5%CO₂、饱和湿度培养箱中过夜，观察是否污染。

脾细胞的制备：

3d后，小鼠眼球采血，将血液在37℃放置0.5h，4℃放置1h，4000rpm离心5min，分离后的血清作为阳性血清。处死小鼠，75%酒精浸泡消毒5min后，取出小鼠，将四肢固定于超净台解剖板上。在无菌的条件下，依次剪开腹部皮肤、腹膜，充分暴露腹腔，在小鼠腹腔左侧用一套无菌的剪刀和镊子取出脾脏，置于含有少量无血清DMEM的无菌玻璃培养皿中的滤网上，剪去脾脏上的筋膜，并将脾脏剪成3-5块，用玻璃针筒研磨。冲下的脾细胞用无血清DMEM培养液洗涤2次（1000rpm，10min），再次悬浮细胞后计数，以无血清DMEM培养液调整细胞浓度为1×10⁷个/mL，获得约10mL细胞悬液。

细胞融合：

（1）将准备好的Sp2/0骨髓瘤细胞和免疫脾细胞以1：10的比例混和，置于50ml离心管内，用无血清DMEM培养液洗涤3次，1000rpm离心10min，最后一次离心后尽可能弃去上清，用手指轻击离心管底部，使细胞松散。

（2）将离心管置于37℃水浴中，用1mL吸管吸取1mLPEG加入离心管，边加边轻轻搅拌，PEG平均在45s内加完，加完后轻轻搅拌1min。

（3）缓慢加入10mL无血清DMEM，前30s，每2s一滴，后30s每1s一滴，缓慢加入其余。

（4）37℃静置10min，1000rpm离心5min，弃去上清。

（5）HAT营养液重悬融合细胞，动作轻柔，防止将刚融合上的细胞吹散，加入30mLHAT营养液，开始铺96孔板，每铺一板后，则加入10mLHAT稀释细胞悬液，可铺5-6块。

（6）将细胞板置于37℃、5%CO2、饱和湿度温箱中培养，融合后4d用HAT培养液半量换液，融合后1周更换为HT培养液。

4、杂交瘤细胞的筛选

融合后3d观察是否融合上，融合后第4d用HAT培养液半量换液，第7d左右改用HT培养液，待杂交瘤细胞长满孔底1/4时，于换液2d后即可取同一孔杂交瘤细胞培养上清液，同时将Sp2/0细胞培养上清液作为阴性对照，阳性小鼠血清做为阳性对照，取2次检测均为阳性的杂交瘤细胞株进行下一次亚克隆。

5、阳性杂交瘤细胞的单克隆化

按制备饲养细胞，用HT营养液冲洗小鼠腹腔后获得的饲养细胞铺96孔板，100μL/孔，96孔板置于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中过夜培养。将已检测为阳性的杂交瘤细胞孔中的细胞吹起混匀，取10μL细胞，10倍比稀释后细胞计数，经计算从相应孔中取50个细胞加入5mLHT培养液中，接种于铺有饲养细胞的96孔细胞培养板，100μL/孔，即每孔约1个细胞。将细胞板置于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养。3d后观察每孔克隆数，7-10d细胞长到1/4孔底时，进行ELISA检测，取2次检测均为阳性的单克隆孔进行再次亚克隆。一般需经2-3次亚克隆化，直至所有克隆化细胞孔检测阳性率为100%时，筛选及细胞亚克隆，获得1株能稳定分泌抗噻虫啉农药抗体的杂交瘤细胞株。

6、杂交瘤细胞的冻存与复苏

将获得的杂交瘤细胞株在显微镜下观察为单个克隆孔进行扩大培养，将孔内细胞吹散转入6孔板中，待6孔板中的细胞长满后将细胞转入100mL细胞瓶中生长。细胞长满后传代培养，同时冻存杂交瘤细胞株，每株冻存4-6管。取生长对数期，状态良好的细胞，吹散混匀，1000rpm离心10min，弃上清，用冻存液重悬细胞，使细胞数达到106个/mL，转入冻存管中，1mL/管，加入异丙醇放于-70℃过夜，于第二天转入液氮罐中长期保存。二月后复苏杂交瘤细胞株（复苏同SP2/0骨髓瘤细胞），并用ELISA法检测上清中的抗体。

7、小鼠腹水的制备

取10周龄Balb/c小鼠，腹腔内注入0.5mL液体石蜡。7d后，每只小鼠腹腔接种1-5×10⁶个杂交瘤细胞。接种前，用无血清的DMEM培养液将杂交瘤细胞洗涤两次，尽量洗去杂蛋白，然后用无血清的DMEM培养液配成浓度为1×10⁷个/mL的细胞悬液。接种时，取0.5mL细胞悬液，于无菌条件下注入腹腔，杂交瘤细胞以腹水瘤形式在小鼠腹腔内大量繁殖。1周后，小鼠腹部胀大，触之有波动感即腹腔内出现腹水，此时即可收集腹水。收集腹水时抓住小鼠颈部及尾巴，用10mL注射器针头如腹腔注射般插入小鼠腹腔，抽取腹水。一般2-3d后，小鼠腹部再胀大，可再次收集腹水。一般可收集1-3次。将收集的腹水3000rmp离心5min，取上清，注意不要吸到离心管最上层的油状物，56℃水浴30min以使补体和蛋白水解酶灭活，置室温待其冷却，冻存于-20℃。

8、单克隆抗体的纯化。

将腹水单克隆抗体用BindingBuffer平衡proteinG至基线平稳，收集流穿液，然后将流穿液再次上柱，平衡至基线平稳。加入ElutingBuffer洗脱，收集洗脱峰，即为纯化的腹水单克隆抗体。

四、标准曲线的建立

用ic-ELISA测定单克隆抗体对噻虫啉的敏感度。首先对测试条件进行优化：

（1）甲醇含量

用不同甲醇含量（5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%）的PBS缓冲溶液配制噻虫啉标准溶液，考察甲醇含量对反应体系的影响。

图1为缓冲液中不同含量的甲醇对ELISA法影响的结果。当甲醇浓度在5%和15%时有较低的IC₅₀。为了保证噻虫啉的溶解性，选择15%甲醇作进一步研究。

（2）离子强度

用不同Na+浓度（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8M）的PBS缓冲液稀释单克隆抗体，考察不同的离子强度对反应体系的影响。

缓冲液中不同浓度的Na+对ELISA法的影响如图2。Na+强度变化对IC₅₀值有很大影响，Na+强度在0.1M时IC₅₀值较低，随着离子强度的增加，灵敏度有轻微的改变，综合考虑选择IC₅₀最低的Na+为0.1M作为优化后的条件。

（3）pH值

用不同pH值（4.5、5.5、6.5、7.4、8.5、9.5）的PBS缓冲液稀释抗体，测定pH对反应体系的影响。

pH值对ELISA的影响结果见图3。由图3知，pH在3.5-10.5之间时，IC₅₀变化不大，对ELISA影响较小，其中PH为7.5时IC₅₀相对较低，综合选择IC₅₀最低的pH=7.5时作为优化后的条件。

在最优化的条件下，用ic-ELISA测定单克隆抗体对噻虫啉的敏感度，配置系列浓度的噻虫啉甲醇PBS标准溶液（0.00001、0.0001、0.001、0.01、0.1、1、10和100mg/L）。

用四参数方程拟合标准曲线为：y=(A-D)/[1+(x/C)B]+D

其中y为结合率；x为标准液或分析物的浓度，A和D分别为0标准液的吸光值和空白对照的吸光值，C为ED₅₀点的浓度，B为ED₅₀点处的斜率。

五、交叉反应率的测定

在上述最优化的条件下，配制系列浓度的噻虫啉和结构类似烟碱类杀虫剂的标准溶液，采用ic-ELISA测定结构类似化合物的标准曲线和抑制中浓度(IC₅₀)，计算交叉反应率CR%。

CR%=[IC₅₀(噻虫啉)/IC₅₀(类似化合物)]×100，交叉反应率越低，抗体反应的特异性越强，对噻虫啉的干扰就越小。

化合物名称	IC50(mg/L)	CR(%)
			噻虫啉	0.005	100
啶虫脒	2.25	0.22
			吡虫啉	4.86	0.10
烯啶虫胺	10.23	<0.01
			呋虫胺	32.81	<0.01
噻虫胺	>1000	<0.01
			噻虫嗪	>1000	<0.01
氯噻啉	>1000	<0.01

可见，该抗体的特异性较强，与啶虫脒、吡虫啉等结构类似烟碱类杀虫剂无交叉反应。

Claims

1.一种噻虫啉单克隆抗体的制备，其特征在于，所述方法包括合成噻虫啉半抗原，将噻虫啉半抗原与牛血清蛋白偶联制备免疫抗原免疫BALB/c小鼠，再用免疫鼠的脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合，经筛选克隆获得持续稳定分泌噻虫啉单克隆抗体的杂交瘤株，得到所需的产物。

2.根据权利要求1所述的一种噻虫啉单克隆抗体的制备，其特征在于，所述噻虫啉半抗原的合成方法为：

3.根据权利要求1所述的一种噻虫啉单克隆抗体的制备，其特征在于，所述免疫抗原的制备方法为：

4.根据权利要求1-3任意一项所述的一种噻虫啉单克隆抗体的间接非竞争ELISA检测方法，其特征在于，将噻虫啉半抗原与卵清蛋白（OVA）偶联物为包被抗原。

5.根据权利要求4所述的一种噻虫啉单克隆抗体的间接非竞争ELISA检测方法，其特征在于，所述包被抗原的具体制备方法为：

6.根据权利要求4所述的一种噻虫啉单克隆抗体的间接非竞争ELISA检测方法，其特征在于，PBS溶液中甲醇含量为15%、Na⁺浓度为0.1M、pH=7.5为最优测试条件。