CN107652365A - 一种制备四种氯化烟碱类杀虫剂通用抗原的方法 - Google Patents
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Abstract
一种制备四种氯化烟碱类杀虫剂通用抗原的方法,属于生物化工技术领域。本发明以含有啶虫脒、吡虫啉、噻虫啉和烯啶虫胺共同母核结构的啶虫脒为半抗原,合成了以上四种氯化烟碱类杀虫剂通用人工完全抗原,将啶虫脒侧链的氰基还原为氨基,再通过戊二醛法将啶虫脒上还原后的氨基与载体蛋白的氨基进行偶联,制备出完全抗原。此方法步骤简单,通过酶联免疫实验分析具有较高的效价,并且对四种氯化烟碱类杀虫剂具有良好的竞争抑制效果,证实了通过用人工抗原的成功合成,此类方法为氯化烟碱类杀虫剂通用抗体的制备提供了重要的研究价值。
Description
技术领域
本发明属于生物化工技术领域,具体涉及一种制备四种氯化烟碱类杀虫剂通用抗原的方法。
背景技术
氯化烟碱类杀虫剂是20世纪80年代末发展起来的一类新型农药,这种农药具有广谱杀虫活性,能有效防治作物、蔬菜、果树上多种害虫,同时具有触杀和胃毒作用,并且作用机制独特,对目前的多抗性害虫显示了优良的防效,对哺乳动物毒性较低。氯化烟碱类杀虫剂除了具有直接的杀虫效果外,还影响害虫摄食、交尾、产卵、引起生育不良、产卵量减少等生理作用。因此,氯化烟碱类杀虫剂广泛应用于棉花、水稻、小麦、蔬菜及各种果树上害虫的防治,这也就导致了这类杀虫剂在农作物中的残留,许多国家对其在动植物食品中的残留均有所限制。
目前,应用于该类农药的分析方法主要有固相萃取-高效液相色谱法、液相色谱-质谱联用法、固相萃取-毛细管电泳法、高效液相色谱法等,虽然这种方法可以实现氯化烟碱类杀虫剂的检测,但是所需仪器价格昂贵,样本前处理复杂,并且需要专业的操作人员,从而限制了此类方法的广泛应用。随着检测需求的提高,现场快速高通量检测方法成为了检测方法的趋势,酶联免疫方法不仅操作简单方便,不需要专业的操作人员,同时还可以进行现场快速高通量检测,从而可以满足现在的检测需求。酶联免疫方法的实现依赖高效的抗体,而免疫原的成功制备是获得高效抗体的前提。
发明内容
要解决的技术问题:目前的氯化烟碱类杀虫剂检测方法主要是基于仪器的检测方法,此类方法所需仪器价格昂贵,并且样品前处理复杂,检测周期长,并且需要专业的操作人员,从而限制了此类方法的普遍应用。
技术方案:本发明公开了一种制备四种氯化烟碱类杀虫剂通用抗原的方法,其中氯化烟碱类杀虫剂为啶虫脒、吡虫啉、噻虫啉和烯啶虫胺,包括如下步骤:
(1)Ni-Al2O3催化剂的合成
在烧杯中加入200mL去离子水,置于加热反应器上加热至80℃,然后将浓度均为1M的100mL硝酸镍溶液和100mL碳酸钠溶液同时加入到烧杯中,在机械搅拌状态下反应1~2h,然后将溶液的pH调整到8.5,随后加入5g氧化铝粉,继续加热搅拌反应50min,将溶液抽滤并用水洗4次,然后将滤饼放入烘箱中120℃条件下过夜烘干,研磨过筛;再将研磨过筛的粉末置于管式还原器中500℃下煅烧3h,再通入氮气、氢气反应3h后关闭加热使其自然降温,将制得的固体催化剂密封保存。
(2)氯化烟碱类杀虫剂通用人工半抗原的合成
称取20mg啶虫脒于100mL反应瓶中,加入5mL甲醇将其溶解,再加入5mg步骤(1)制备的催化剂,然后抽真空,通入氨气和氢气,使得体系的反应压力在0.5MPa,于室温下反应2~4h后,将反应液进行离心分离出上清液体,再在35℃条件下用旋转蒸发仪将溶剂旋干,旋干后的固体即为氯化烟碱类杀虫剂通用人工半抗原。
(3)氯化烟碱类杀虫剂通用人工完全抗原的合成
将步骤(2)制备的半抗原用1mL甲醇溶解,然后再加入5mL 0.01M pH7.2的PBS缓冲液,置于磁力搅拌器上进行搅拌,在搅拌的状态下加入0.5~1mL稀释10倍的25%戊二醛溶液,室温搅拌反应20min,将其逐滴加入到10mL 0.01M pH7.2的PBS缓冲液溶解的50~100mg牛血清蛋白BSA中,室温反应3h后将反应液在PBS缓冲液中透析3次,透析后的溶液即为氯化烟碱类杀虫剂通用人工完全抗原。
(4)氯化烟碱类杀虫剂通用人工完全抗原的鉴定
用10%的SDS-PAGE凝胶电泳和紫外吸收光谱对合成的完全人工抗原进行鉴定。
本发明所述的氯化烟碱类杀虫剂通用人工抗原的制备方法的步骤(1)中反应体系的机械搅拌反应时间为1.5h。
本发明所述的氯化烟碱类杀虫剂通用人工抗原的制备方法的步骤(2)中合成半抗原的反应时间为3h。
本发明所述的氯化烟碱类杀虫剂通用人工抗原的制备方法的步骤(3)中戊二醛的添加量为0.7mL。
本发明所述的氯化烟碱类杀虫剂通用人工抗原的制备方法的步骤(3)中BSA的添加量为80mg。
一种使用步骤(3)合成的人工完全抗原制备啶虫脒、吡虫啉、噻虫啉和烯啶虫胺四种氯化烟碱类杀虫剂抗体。
将合成的四种氯化烟碱类杀虫剂通用抗原免疫BALB/c雄性小鼠,经过四次免疫后得到四种氯化烟碱类杀虫剂的通用抗体。
有益效果:本发明根据啶虫脒、吡虫啉、噻虫啉和烯啶虫胺的通用母核结构,以啶虫脒为半抗原合成了以上四种氯化烟碱类杀虫剂通用人工完全抗原,借助啶虫脒侧链的氰基,在催化剂的条件下将氰基还原为氨基,通过戊二醛法将啶虫脒上还原后的氨基和载体蛋白的氨基进行偶联,制备完全抗原。这种制备方法不仅保留了半抗原上完整的环状结构,同时仅保留了四种氯化烟碱类杀虫剂的共同母核结构,从而实现用此方法合成的抗原所制备的抗体能够同时识别四种氯化烟碱类杀虫剂的效果。
附图说明
图1 通用人工抗原的合成流程图。
图2啶虫脒-BSA、BSA的SDS-PAGE图。
图3 啶虫脒、啶虫脒-BSA、BSA的紫外吸收光谱图。
具体实施方式
实施例1
一种制备四种氯化烟碱类杀虫剂通用抗原的方法,其中氯化烟碱类杀虫剂为啶虫脒、吡虫啉、噻虫啉和烯啶虫胺,包括如下步骤:
(1)Ni-Al2O3催化剂的合成
在烧杯中加入200mL去离子水,置于加热反应器上加热至80℃,然后将浓度均为1M的100mL硝酸镍溶液和100mL碳酸钠溶液同时加入到烧杯中,在机械搅拌状态下反应1.5h,然后将溶液的pH调整到8.5,随后加入5g氧化铝粉,继续加热搅拌反应50min,将溶液抽滤并用水洗4次,然后将滤饼放入烘箱中120℃条件下过夜烘干,研磨过筛;再将研磨过筛的粉末置于管式还原器中500℃下煅烧3h,再通入氮气、氢气反应3h后关闭加热使其自然降温,将制得的固体催化剂密封保存。
(2)氯化烟碱类杀虫剂通用人工半抗原的合成
称取20mg啶虫脒于100mL反应瓶中,加入5mL甲醇将其溶解,再加入5mg步骤(1)制备的催化剂,然后抽真空,通入氨气和氢气,使得体系的反应压力在0.5MPa,于室温下反应3h后,将反应液进行离心分离出上清液体,再在35℃条件下用旋转蒸发仪将溶剂旋干,旋干后的固体即为氯化烟碱类杀虫剂通用人工半抗原。
(3)氯化烟碱类杀虫剂通用人工完全抗原的合成
将步骤(2)制备的半抗原用1mL甲醇溶解,然后再加入5mL 0.01M pH7.2的PBS缓冲液,置于磁力搅拌器上进行搅拌,在搅拌的状态下加入0.7mL稀释10倍的25%戊二醛溶液,室温搅拌反应20min,将其逐滴加入到10mL 0.01M pH7.2的PBS缓冲液溶解的80mg牛血清蛋白BSA中,室温反应3h后将反应液在PBS缓冲液中透析3次,透析后的溶液即为氯化烟碱类杀虫剂通用人工完全抗原。
(4)氯化烟碱类杀虫剂通用人工完全抗原的鉴定
用10%的SDS-PAGE凝胶电泳和紫外吸收光谱对合成的完全人工抗原进行鉴定。从电泳图上得出,啶虫脒-BSA偶联物的电泳条带比BSA的电泳条带滞后,说明BSA分子成功偶联了小分子啶虫脒从而增大了BSA的分子量,从而出现啶虫脒-BSA偶联物条带滞后的现象。同时啶虫脒-BSA的紫外吸收光谱与啶虫脒和BSA相比都有所偏移,从而进一步验证了啶虫脒与BSA的成功偶联。
(1)抗体效价鉴定
将用同种方法合成的啶虫脒-OVA偶联物作为包被原,用0.01M pH9.6的碳酸盐缓冲液进行溶解,并配成浓度为4μg/mL、2μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL、0.25μg/mL的包被浓度进行包被,置于37℃烘箱中孵育2h,然后用含0.5%Tween-20的0.01M pH7.4的PBS洗液洗涤三次,再用1%的明胶在37℃封闭2h,取出洗涤三次甩干;将抗血清稀释三万倍,加入到五种包被浓度的酶标板孔中,每个孔加100μL,37℃孵育30min后洗涤干净,再加入3000倍稀释的羊抗鼠二抗100μL/孔,37℃孵育30min后洗涤干净,再加入100μL/孔的TMB显色液显色15min,最后加入50μL/孔的终止液,用酶标仪测定480nm处的吸光值。下表为不同包被浓度下的OD值,从表中可以得出,在系列梯度稀释的包被原浓度下,OD值较高,说明半抗原与载体蛋白进行了成功偶联。
。
(2)间接ELISA鉴定
将包被原啶虫脒-OVA偶联物稀释到0.5μg/mL,并进行酶标板包被,封闭步骤完成后,将浓度分别为0ppb、0.5ppb、1ppb、2ppb、5ppb、10ppb、20ppb的啶虫脒、吡虫啉、噻虫啉和烯啶虫胺标准品进行间接ELISA测定,同时添加两万倍稀释的抗体,检测完成后,测定480nm处的吸光值如下表所示。从表中得出,所制备的抗体对啶虫脒、吡虫啉、噻虫啉和烯啶虫胺四种氯化烟碱杀虫剂具有较好的抑制效果,可以实现这四种氯化烟碱杀虫剂的同时检测。
。
Claims (5)
1.一种制备四种氯化烟碱类杀虫剂通用抗原的方法,其中氯化烟碱类杀虫剂为啶虫脒、吡虫啉、噻虫啉和烯啶虫胺,其特征在于包括如下步骤:
(1)Ni-Al2O3催化剂的合成
在烧杯中加入200mL去离子水,置于加热反应器上加热至80℃,然后将浓度均为1M的100mL硝酸镍溶液和100mL碳酸钠溶液同时加入到烧杯中,在机械搅拌状态下反应1~2h,然后将溶液的pH调整到8.5,随后加入5g氧化铝粉,继续加热搅拌反应50min,将溶液抽滤并用水洗4次,然后将滤饼放入烘箱中120℃条件下过夜烘干,研磨过筛;再将研磨过筛的粉末置于管式还原器中500℃下煅烧3h,再通入氮气、氢气反应3h后关闭加热使其自然降温,将制得的固体催化剂密封保存;
(2)氯化烟碱类杀虫剂通用人工半抗原的合成
称取20mg啶虫脒于100mL反应瓶中,加入5mL甲醇将其溶解,再加入5mg步骤(1)制备的催化剂,然后抽真空,通入氨气和氢气,使得体系的反应压力在0.5MPa,于室温下反应2~4h后,将反应液进行离心分离出上清液体,再在35℃条件下用旋转蒸发仪将溶剂旋干,旋干后的固体即为氯化烟碱类杀虫剂通用人工半抗原;
(3)氯化烟碱类杀虫剂通用人工完全抗原的合成
将步骤(2)制备的半抗原用1mL甲醇溶解,然后再加入5mL 0.01M pH7.2的PBS缓冲液,置于磁力搅拌器上进行搅拌,在搅拌的状态下加入0.5~1mL稀释10倍的25%戊二醛溶液,室温搅拌反应20min,将其逐滴加入到10mL 0.01M pH7.2的PBS缓冲液溶解的50~100mg牛血清蛋白BSA中,室温反应3h后将反应液在PBS缓冲液中透析3次,透析后的溶液即为氯化烟碱类杀虫剂通用人工完全抗原;
(4)氯化烟碱类杀虫剂通用人工完全抗原的鉴定
用10%的SDS-PAGE凝胶电泳和紫外吸收光谱对合成的完全人工抗原进行鉴定。
2.根据权利要求1 所述的一种制备四种氯化烟碱类杀虫剂通用抗原的方法,其特征在于所述的步骤(1)中反应体系的机械搅拌反应时间为1.5h。
3.根据权利要求1 所述的一种制备四种氯化烟碱类杀虫剂通用抗原的方法,其特征在于所述的步骤(2)中合成半抗原的反应时间为3h。
4.根据权利要求1 所述的一种制备四种氯化烟碱类杀虫剂通用抗原的方法,其特征在于所述的步骤(3)中戊二醛的添加量为0.7mL。
5.根据权利要求1 所述的一种制备四种氯化烟碱类杀虫剂通用抗原的方法,其特征在于所述的步骤(3)中BSA的添加量为80mg。
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