CN105400742A - 杂交瘤细胞株imi-g12及其产生的新烟碱类农药通用单克隆抗体和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种杂交瘤细胞株IMI-G12，其保藏编号为CCTCC？NO:C2015179。本发明还同时公开了一种抗6种新烟碱类农药的通用单克隆抗体，它由保藏编号为CCTCC？NO:C2015179的杂交瘤细胞株IMI-G12分泌产生，抗体亚型为重链IgG1和轻链lambda。本发明还同时公开了上述通用单克隆抗体在对吡虫啉、氯噻啉、噻虫胺、啶虫脒、噻虫啉和烯啶虫胺这6种氯代烟碱类农药的多残留快速筛查中的应用。

Description

杂交瘤细胞株IMI-G12及其产生的新烟碱类农药通用单克隆抗体和应用

技术领域

本发明属于小分子化合物的免疫分析快速检测领域，具体涉及一种杂交瘤细胞株IMI-G12及其产生的抗6种新烟碱类农药的通用单克隆抗体，可用于吡虫啉、氯噻啉、噻虫胺、噻虫啉、啶虫脒和烯啶虫胺这6种氯代烟碱类农药的多残留快速筛查。

背景技术

新烟碱类农药是在烟碱结构研究的基础上，于20世纪80年代起开发、筛选和合成出来的一类新型杀虫剂。它作为激动剂，能选择性作用于昆虫烟碱型乙酰胆碱受体，阻断昆虫中枢神经系统的正常传导，从而致使害虫出现麻痹进而死亡。其不仅具有高效、广谱及良好的根部内吸性、触杀和胃毒作用，而且对哺乳动物毒性较低，对环境相容性较好。此外，由于这类杀虫剂的作用靶标和方式与以往的有机磷、氨基甲酸酯和拟除虫菊酯类等杀虫剂不同，它们之间不存在靶标交互抗性。因此，新烟碱类农药在杀虫剂市场所占的比例日趋增长，目前已商品化的有吡虫啉、啶虫脒、噻虫啉、烯啶虫胺、噻虫嗪、噻虫胺、呋虫胺和由我国自主研发的氯噻啉共8个品种(图1)。然而，近年来有研究报道了新烟碱类农药对传粉昆虫、鸟类生殖系统和老鼠呼吸系统等方面的负面影响，特别是欧美等国调查发现该类农药对蜜蜂存在巨大的潜在危害。欧盟已于2013年发布报告并建议新烟碱类农药禁止用于由蜜蜂进行授粉的作物。所以，建立新烟碱类农药多残留的快速分析方法尤为重要。

常规的新烟碱类农药残留检测方法有气相、液相色谱及质谱联用等仪器分析法，其灵敏度高、准确性好，但设备条件要求高、前处理复杂，难以满足大批量样品现场快速检测的需求。近些年发展起来的免疫化学分析技术克服了上述不足之处，具有高灵敏度、高特异性、对环境污染小、适于快速检测等优点。迄今，国内外公开报道有关新烟碱类农药的免疫分析方法如酶联免疫分析法都只是针对一个或两个品种，这主要因为采用的是高特异性抗体，即该抗体只能识别一个靶标分析物或者只与其结构高度类似物有部分交叉识别(如氯噻啉抗体对吡虫啉的识别能力最为接近)。若要同时筛查8种新烟碱类农药，则必须进行7-8轮免疫分析测定，这大大增加了检测时间和成本。因此，为实现新烟碱类农药多残留的快速检测，需要获得该类农药的通用抗体来建立合适的新烟碱类农药多残留免疫分析方法。目前国内外有关研制单个新烟碱类农药高特异性抗体的报道已有不少，但有关新烟碱类农药通用抗体及其通用ELISA检测方法尚未见公开报道。

由于免疫细胞库的多样性，淋巴细胞分泌的单抗也是高丰富度的，因此筛选出能同时识别几个结构类似化合物的通用单克隆抗体是可行的。目前有关农药类特异性通用单抗的报道，主要集中在有机磷类、拟除虫菊酯类和三嗪类农药，关于新烟碱类农药的通用抗体制备尚未见公开报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种灵敏度高、类选择性强的可同时检测6种新烟碱类农药的通用单克隆抗体，用于建立灵敏度高、类选择性强的新烟碱类农药多残留免疫分析方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种杂交瘤细胞株IMI-G12，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCCNO:C2015179，保藏时间2015年10月28号。

该细胞株IMI-G12能分泌产生抗6种新烟碱类农药的通用单克隆抗体，抗体亚型为重链IgG1和轻链lambda。据此建立的间接竞争ELISA法能用于吡虫啉、氯噻啉、噻虫胺、啶虫脒、噻虫啉和烯啶虫胺这6种氯代烟碱类农药的多残留快速筛查(同时筛查)。

在发明过程中，通过分析图1所示的8种新烟碱类农药的化学结构，根据药效团可以分为N-硝基胍基团类(吡虫啉、氯噻啉、噻虫嗪、噻虫胺和呋虫胺)、N-氰基脒类(啶虫脒和噻虫啉)和硝基甲撑(烯啶虫胺)。因此，在筛选杂交瘤细胞株的时候，可以采用多靶标物测试的筛选方式，如优先选择吡虫啉和啶虫脒两个最具代表性的农药(使用也最广泛)进行同时测试，以期望获得能识别多种新烟碱类农药的通用型单抗。

具体如下：

本发明提供的杂交瘤细胞株IMI-G12是通过三步ELISA法并结合多靶标物测试的筛选方式所获得的：第一步，采用基于吡虫啉-OVA包被的间接非竞争ELISA法筛选出能识别吡虫啉半抗原、而不识别载体蛋白BSA的阳性细胞孔；第二步，采用间接竞争ELISA法对第一步获得的阳性细胞孔上清进行鉴定，同时以吡虫啉和啶虫脒两种农药为竞争物，挑选出受两者抑制反应明显(大于50％)并且非竞争对照孔吸光值高(OD>1)的有效细胞孔；第三步，将第二步获得的细胞孔扩大培养后的上清进行再次鉴定，同时以氯噻啉、噻虫胺、噻虫啉、烯啶虫胺、呋虫胺和噻虫嗪其它6种新烟碱类农药作为竞争原，通过间接竞争ELISA法筛选出识别农药种类最多、受抑制程度明显的细胞孔。然后，将此细胞孔经3-4次有限稀释亚克隆化，采用上述第二步的间接竞争ELISA法进行鉴定，获得能稳定分泌新烟碱类农药通用单抗的细胞株IMI-G12。该通用单抗的大批量制备可通过细胞株扩大培养并传代、收集上清并浓缩得到，或者通过细胞株注射小鼠腹腔制备腹水的方式获得。

用吡虫啉抗原包被的间接非竞争酶联免疫吸附分析方法(ELISA)测定IMI-G12的小鼠腹水抗体效价达到了32,000；进一步利用此新烟碱类农药通用抗体和吡虫啉包被抗原建立并优化了间接竞争ELISA法，对氯噻啉、吡虫啉、噻虫胺、噻虫啉、啶虫脒和烯啶虫胺的检测灵敏度IC₅₀(50％抑制浓度)为0.34-3.64ng/mL，平均IC₅₀为1.72ng/mL，是目前公开报道的识别谱最宽泛的新烟碱类农药通用ELISA法。

综上所述，本发明获得了能分泌抗多种新烟碱类农药通用抗体的杂交瘤细胞株，且相应建立了6种新烟碱类农药通用ELISA检测技术。采用本发明的新烟碱类农药通用抗体所建立的ELISA方法，可用于吡虫啉、氯噻啉、噻虫胺、噻虫啉、啶虫脒和烯啶虫胺这6种氯代烟碱类农药的多残留快速检测，具有灵敏度高、类选择性好、检测通量高、实用性强等优点。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为八种新烟碱类农药的化学结构；

图2为间接竞争ELISA法对六种农药的标准曲线。

具体实施方式

实施例1：杂交瘤细胞株IMI-G12的制备

1.新烟碱类农药人工抗原的制备与动物免疫

选用新烟碱类农药的最具代表性品种吡虫啉作为半抗原的起始原料，根据Wanatabe等人(Developmentofcompetitiveenzyme-linkedimmunosorbentassays(ELISAs)basedonmonoclonalantibodiesforchloronicotinoidinsecticidesimidaclopridandacetamiprid.AnalChimActa,2001,427(2):211-219)建立的方法获得吡虫啉的半抗原，并利用活化酯法制备出吡虫啉-BSA偶联物作为免疫抗原，同时利用混合酸酐法制备出吡虫啉-OVA偶联物作为ELISA检测抗原。

取6-8周龄的Balb/C雌性小鼠3只，将制备的免疫原吡虫啉-BSA与等体积的弗氏完全佐剂进行预处理(油包水乳化)，皮下多点免疫小鼠(100μg/只)，三周后使用弗氏不完全佐剂进行加强免疫，然后每隔两周一次加免，小鼠腹腔注射(100μg/只)。每次加免后第8天，小鼠尾巴静脉采血监测效价，采用10μg/mL包被酶标板(100μL/孔)，间接非竞争ELISA法测定。第3次加免后，3只小鼠的血清效价(即OD值接近1.0时的抗血清稀释倍数)均达到了16,000以上，同时采用吡虫啉和啶虫脒作为目标分析物进行间接竞争ELISA法测试，选择效价较高且对上述两种农药识别性能都较高的抗血清对应小鼠优先进行末免。末免时不加佐剂，直接以生理盐水稀释免疫原吡虫啉-BSA，免疫剂量同上。

2.细胞融合与杂交瘤筛选

末免后第4天，采用经典的杂交瘤技术将小鼠骨髓瘤细胞SP2/0和免疫脾细胞按1:5的比例在50％PEG1450条件下进行细胞融合。当细胞集落长到96孔板底的1/3-1/2面积大小(细胞融合后第12天左右)，首先第一步筛选，采用基于10μg/mL吡虫啉-OVA包被的间接非竞争ELISA法筛选出能识别吡虫啉半抗原、而不识别载体蛋白BSA的阳性细胞孔(OD_450nm>1)；第二步，采用5μg/mL吡虫啉-OVA包被的间接竞争ELISA法对上述获得的阳性细胞孔上清进行鉴定，同时以吡虫啉和啶虫脒两种农药(浓度为500ng/mL)为竞争物，挑选出受两者抑制反应均明显(大于50％)并且非竞争对照孔吸光值较高(OD_450nm>0.5)的有效细胞孔；第三步，将第二步获得的细胞孔扩大培养后的上清进行再次鉴定，同时以氯噻啉、噻虫胺、噻虫啉、烯啶虫胺、呋虫胺和噻虫嗪其它6种新烟碱类农药作为竞争物，通过5μg/mL吡虫啉-OVA包被的间接竞争ELISA法筛选出识别农药种类最多、受抑制程度明显的细胞孔。然后，将此细胞孔经3-4次有限稀释亚克隆化，采用上述第二步的间接竞争ELISA法进行鉴定，从而获得能稳定分泌新烟碱类农药通用单抗的细胞株IMI-G12，扩大培养并冻存。

该杂交瘤细胞株IMI-G12，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCCNO:C2015179，保藏时间2015年10月28号。

实施例2：新烟碱类农药通用单克隆抗体的制备与鉴定(利用杂交瘤细胞株IMI-G12)

1.单抗大批量制备与纯化

将一定数量的杂交瘤细胞(约为1×10⁶)接种在75cm²的细胞培养瓶中进行扩大培养，加入25mL含有10％胎牛血清、1％双抗(10000U/mL的青霉素和10000μg/ml链霉素)的DMEM基础培养液，待4-5天后将瓶内细胞重悬液转移至50mL离心管中，800rpm离心后转移上清至储存容器中，再取约为1×10⁶的杂交瘤细胞进行下一轮的扩大培养、收集上清。

细胞上清浓缩液制备：多次收集最终稳定株的杂交瘤细胞上清液，3000rpm离心(10min)、过0.22μm滤膜除杂、再用30K蛋白超滤管5000rpm离心多次，最终得到浓缩上清液，-20℃保存。

腹水制备：选用F1代小鼠，先用降植烷(500μL/只)进行腹腔注射。1周后，将筛选获得的稳定杂交瘤细胞株IMI-G12(约2×10⁶/500μL/只)接种至小鼠腹腔。7-10天后，收集小鼠腹水，辛酸-硫酸铵沉淀法纯化抗体。

2.抗体亚型鉴定、效价和亲合力测定

采用美国Thermo公司的Pierce快速ELISA鼠抗亚型鉴定试剂盒鉴定抗体的重链(IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgA或IgM)和轻链(κ或λ)，结果发现细胞株IMI-G12分泌的单抗亚型为重链IgG1和轻链lambda；采用以吡虫啉-OVA(5μg/mL)做包被原，间接非竞争ELISA法测得细胞上清浓缩液的效价约为4000，小鼠腹水的效价约为32,000；利用fortibioOctetRed96测试该抗体与吡虫啉抗原的亲合力K_D达到了10^-9M级别。

实施例3：基于通用单抗IMI-G12的新烟碱类农药多残留ELISA方法的建立与评价

1.免疫试剂工作浓度的优化

采用吡虫啉-OVA包被的间接非竞争ELISA法，进行棋盘滴度法测试，挑选出几组适宜的抗原-抗体工作浓度(OD_450nm接近1)，再采用间接竞争ELISA法进行标准曲线的建立，即设置一系列梯度的标样浓度，以不加农药为对照，测定不同浓度的吡虫啉和啶虫脒农药对固相包被原与抗体的结合反应抑制率，考察目标分析物与抗体的亲和反应能力。最终选择出抗原-抗体用量较少、对吡虫啉和啶虫脒灵敏度都较高的抗原-抗体工作浓度组合为：0.5μg/mL吡虫啉-OVA和1.0μg/mL抗体。

2.间接竞争ELISA法

其步骤如下：将吡虫啉-OVA(0.5μg/mL)用碳酸盐缓冲液(CBS,0.05M,pH9.6)稀释后包被于96孔聚苯乙烯板上(100μL/孔)，37℃温育2h后，PBST洗涤3次；然后用2％脱脂奶粉-PBS封闭(300μL/孔)，37℃温育30min后，PBST洗涤2次；加入预先稀释好的1.0μg/mL抗体和一系列浓度的各种农药标样(以1％甲醇-PBS配制，同时设溶剂空白对照)各50μL/孔，振荡混匀(37℃温育1h，PBST洗3次)；加入2％脱脂奶粉-PBS稀释的羊抗鼠IgG-HRP(100μL/孔，37℃温育1h，PBST洗3次)；加入3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)底物溶液(100μL/孔，37℃温育15min)；最后加终止液(2mol/LH₂SO₄溶液，50μL/孔)，酶标仪测定各孔OD_450nm。

3.方法灵敏度和选择性的评价

以抑制率为纵坐标，农药浓度为横坐标，使用Origin8.5软件建立四参数logistic曲线(图2)，得到抑制20％、50％和80％所需农药浓度(IC₂₀、IC₅₀和IC₈₀)，即获得方法的检测灵敏度和线性范围。

以吡虫啉的IC₅₀作为参照，计算交叉反应率(CR)，公式如下：CR％＝(吡虫啉IC₅₀)/(其他农药IC₅₀)×100％。结果如表1所示，该ic-ELISA方法对6种农药都有较强的识别性能，IC₅₀为0.34-3.64ng/mL，平均IC₅₀为1.72ng/mL，其中对吡虫啉、氯噻琳、噻虫胺的灵敏度较高，而对啶虫脒、噻虫啉和烯啶虫胺的交叉反应率也都大于10％，因此可判定该单抗属于类特异性抗体。

表1间接竞争ELISA法对各种新烟碱类农药的交叉反应情况

注：^a.“—”表示未拟合出曲线；^b.“NC”表示无交叉反应。

目前其他公开报道的各种新烟碱类农药的抗体大多数特异性较强，也有部分报道是与其他新烟碱类农药有不同程度的交叉识别，但最多与一种或两种其他农药有明显的交叉反应(WatanabeE.,etal,2013.ReviewofEnzyme-LinkedImmunosorbentAssays(ELISAs)forAnalysesofNeonicotinoidInsecticidesinAgro-environments.JAgrFoodChem61(51):12459-12472)。此综述列举了当前国内外各种新烟碱类农药抗体的灵敏度和交叉反应情况：其中，交叉反应最明显的是一种吡虫啉ELISA试剂盒对啶虫脒和噻虫啉的交叉反应率分别为24％和81％；再者，也有发现基于吡虫啉单抗的直接竞争ELISA法对啶虫脒和烯啶虫胺的交叉率均为0.3％；也有一种吡虫啉ELISA试剂盒只对噻虫胺有11.9％的交叉反应率；还有一种基于吡虫啉单抗的间接竞争ELISA法对啶虫脒和噻虫胺的交叉反应率分别为0.6％和3.6％，但对噻虫嗪和呋虫胺没有交叉反应。此外，其他文献报道的基于吡虫啉抗原所获得各种抗体与其他结构类似的烟碱类农药均无明显的交叉反应，显示了较强的特异性(李刚，等，抗吡虫啉单克隆抗体的制备及鉴定，生物工程学报，2011第6期:943-951)。

综上所述，相比于目前其他公开报道的各种新烟碱类农药抗体，本发明获得的抗体识别谱最广，具有对6种新烟碱类农药高识别性的特点(即交叉反应率均超过10％)。所建立的间接竞争ELISA的方法可以用于该类农药的多残留快速筛查，并为开发各种快速、高通量、高灵敏度的新烟碱类农药多残留免疫检测产品提供了技术依据。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (3)

1.杂交瘤细胞株IMI-G12，其特征是：保藏编号为CCTCCNO:C2015179。

2.抗6种新烟碱类农药的通用单克隆抗体，其特征在于：它由保藏编号为CCTCCNO:C2015179的杂交瘤细胞株IMI-G12分泌产生，抗体亚型为重链IgG1和轻链lambda。

3.根据权利要求2所述的通用单克隆抗体在对吡虫啉、氯噻啉、噻虫胺、啶虫脒、噻虫啉和烯啶虫胺这6种氯代烟碱类农药的多残留快速筛查中的应用。