CN112062852A - 一种抗噻虫胺和呋虫胺宽谱抗体的可变区序列及其重组完整抗体的制备 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗噻虫胺和呋虫胺宽谱抗体的可变区序列，重链可变区编码基因的氨基酸序列为SEQ ID NO:2所示。本发明还公开了一种抗噻虫胺和呋虫胺宽谱重组完整抗体，包括重链恒定区、重链可变区、轻链恒定区和轻链可变区，重链可变区编码基因的氨基酸序列为如SEQ ID NO:2所示。将本发明得到的序列基因分别连接到包含了重链恒定区基因和轻链恒定区基因的表达载体，采用双质粒系统的哺乳动物细胞表达获得了重组完整抗体，保证了鼠源亲本抗体的识别活性，并使得抗噻虫胺和呋虫胺宽谱抗体可大批量稳定生产，为同步检测噻虫胺和呋虫胺的各种免疫分析方法提供了可靠的核心试剂。

Description

一种抗噻虫胺和呋虫胺宽谱抗体的可变区序列及其重组完整 抗体的制备

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其是涉及一种抗噻虫胺和呋虫胺宽谱重组完整抗体的制备和应用。

背景技术

噻虫胺是一种第二代新烟碱类杀虫剂，因具有一个噻唑环基，其性能与传统烟碱类杀虫剂相比更为优异，作为一种高效广谱的新烟碱类杀虫剂，在过去几年一直是世界性的大型杀虫剂品种，其使用量和销售每年都保持在很高的水平，噻虫胺对非靶标生物毒性以及对生态环境的安全性影响的研究引起了人们的广泛关注。近两年来，全球多个国家推出限制噻虫胺使用的政策，欧盟现已禁止噻虫胺在室外环境下使用。在欧盟标准中，不同的食品中噻虫胺的最大残留限量(MRLs)为0.01-1.5mg/kg，在中国，噻虫胺的MRLs设定为0.02-2mg/kg。

呋虫胺作为第三代新烟碱类杀虫剂，与其他常见新烟碱类杀虫剂的化学结构区别较大，以四氢呋喃基取代了以前的氯代吡啶基、氯代噻唑基，且不含卤族元素。同时，在性能方面也有所不同，杀虫谱更广、药效持久、对传统新烟碱类药剂已经产生抗性的害虫，防治效果更好。鉴于有些国家和地区对多种新烟碱类农药如吡虫啉、噻虫嗪、噻虫胺、噻虫啉等农药品种实施了禁限用政策，呋虫胺日渐成为多种新烟碱类农药杀虫剂的主要代替品，在欧盟标准中，不同的食品中呋虫胺的最大残留限量(MRLs)为0.02-8mg/kg，在中国，呋虫胺的MRLs设定为0.02-7mg/kg。

为防止消费者和有益生物受到噻虫胺和呋虫胺残留的危害以及潜在影响，对环境和农产品中的噻虫胺和呋虫胺的监测具有重要的意义。目前，针对噻虫胺和呋虫胺的检测方法主要有仪器分析方法和免疫分析的检测方法。仪器分析方法如高效液相色谱、超高效液相色谱-串联质谱等，虽然这些方法灵敏可靠，但需要精密仪器、专业人员、高成本和复杂的制备步骤，因此无法实现大规模的快速现场分析。而基于抗原抗体反应的免疫分析检测方法无需专业的仪器和操作人员即可实现农药残留的快速检测，特别适用于农药残留现场大规模快速筛选和检测，可作为仪器分析方法的辅助或代替的方法，在农药残留分析中应用前景广阔。

抗体是免疫分析方法中的关键反应元件，其质量的好坏直接影响了免疫分析方法的建立。从现有报道来看，国内外农药抗体的研究仍主要集中在传统抗体包括多克隆抗体和单克隆抗体以及重组片段抗体，其在免疫分析上的应用上具有一定的局限性。如多克隆抗体存在免疫动物处死放血后，需要重新免疫，且抗体的均一性较差等问题；单克隆抗体的制备需要长期依赖杂交瘤细胞，若杂交瘤细胞发生抗体基因突变或细胞株丢失，则需重新研制、周期较长。随着基因工程技术的发展，第三代重组抗体的产生使得抗体的制备摆脱了对动物的依赖，确保不同批次制备的同一抗体具有高度的稳定性和一致性。另一方面，在获得抗体可变区基因序列的基础上，可实现抗体“永生”的目的。尽管针对农药的重组抗体研究早已报道，但多数是基于重组片段抗体单链抗体、抗原结合片段Fab等研究，其在生物活性等方面不能完全媲美于传统抗体，如重组片段抗体因其分子结构不同于天然抗体的“Y”型结构会出现不利于与胶体金、量子点等标记物偶联形成具有稳定识别活性的免疫探针等现象。因此，亟需开发具有可重现生产、稳定推广的新型重组抗体，这对于农药残留免疫速测技术及其的产品的开发与应用具有重要意义。

基于哺乳动物细胞表达的重组完整抗体是以杂交瘤细胞、外周血淋巴细胞或动物脾细胞等中抗体重链和轻链基因序列为材料，通过基因工程技术制备的一种具有完整抗体结构的重组抗体，包括了重链可变区及其恒定区氨基酸序列和轻链可变区及其恒定区氨基酸序列，且抗体能够正确折叠和修饰，其抗体的生物活性接近天然抗体。由于抗体的恒定区基因较为保守，同一种属的同一类别的抗体恒定区序列基本恒定的，且序列是已知公开的，因此在构建重组完整抗体时，只需准确扩增出抗体可变区基因，利用分子克隆技术将可变区基因和恒定区基因拼接在一起，即可获得抗体的完整基因序列。与重组片段抗体相比，重组完整抗体的优势在于，结构与天然抗体最接近，可同时结合两个相邻的抗原表位或分子，与靶分子有高特异性和高亲和力，因此可以考虑代替传统亲本抗体的应用。目前已报道的重组完整抗体，多为人源抗体，应用于医疗领域，针对农药等小分子污染物的重组完整抗体还鲜有报道。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明提供一种具有可复制性、可稳定推广的、高灵敏的、可同时识别农药小分子噻虫胺和呋虫胺的宽谱重组完整抗体稳定生产和制备方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种抗噻虫胺和呋虫胺宽谱抗体的可变区序列，重链可变区编码基因的氨基酸序列为SEQ ID NO:2所示。

作为优选，重链可变区编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

作为优选，轻链可变区编码基因的氨基酸序列为SEQ ID NO:4所示。

作为优选，轻链可变区编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

本发明还公开了一种抗噻虫胺和呋虫胺宽谱重组完整抗体，包括重链恒定区、重链可变区、轻链恒定区和轻链可变区，所述重链可变区编码基因的氨基酸序列为如SEQ IDNO:2所示。

作为优选，所述重链可变区编码基因的核苷酸序列为如SEQ ID NO:1所示。

作为优选，所述轻链可变区编码基因的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

作为优选，所述轻链可变区编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

本发明又公开了一种抗体表达质粒，含有上述任一项所述的重链可变区和小鼠重链IgG1恒定区的核苷酸序列，可以表达抗噻虫胺和呋虫胺宽谱重组完整抗体的重链蛋白；或者，含有如权利要求3-4中任一项所述的轻链可变区和小鼠轻链Kappa恒定区的核苷酸序列，可以表达抗噻虫胺和呋虫胺宽谱重组完整抗体的轻链蛋白。

本发明从一株能稳定分泌同时识别噻虫胺和呋虫胺的高灵敏单克隆抗体的杂交瘤细胞株出发，利用5’RACE技术扩增出其抗体重链和轻链可变区基因成功，借助同源重组技术分别构建了重链和轻链表达载体，利用脂质体介导共转染至HEK293F细胞中，通过哺乳动物细胞瞬时表达体系，制备出能同时识别噻虫胺和呋虫胺的重组完整抗体。经ELISA和SPR验证，该重组完整抗体对噻虫胺和呋虫胺有较高的灵敏度和亲和力以及对其他结构类似物无明显交叉反应，可应用于同时检测噻虫胺和呋虫胺两种新烟碱类农药免疫分析方法的建立。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：首先，本发明率先研制了一种可同时识别噻虫胺和呋虫胺的重组完整抗体，其抗体性能和亲本单克隆抗体相同。不同于亲本腹水单克隆抗体，其制备不需要依赖将杂交瘤细胞注射小鼠腹部等流程来制备腹水抗体。其次，其抗体纯度高于腹水抗体。再次，该抗体的制备过程获得了抗体基因序列，可利用哺乳动物细胞表达系统源源不断地表达重组完整抗体，避免了杂交瘤细胞突变和死亡等问题。最后，不同于已报道的针对农药的重组片段抗体，该重组完整抗体具有完整的“Y”型结构，可像天然抗体一样，便于进行修饰和标记，可用于开发稳定的免疫分析快速检测方法。

附图说明

图1为本发明以5’race技术反转录获得的cDNA为模板，抗体重链可变区基因、轻链可变区基因PCR扩增琼脂糖凝胶电泳结果。

图2为本发明SDS-PAGE验证重组完整抗体在哺乳动物细胞HEK293F中的表达。

图3为本发明抗噻虫胺和呋虫胺重组完整抗体对噻虫胺和呋虫胺的ELISA竞争曲线(浓度从低到高依次为0.20、0.39、0.78、1.56、3.13、6.25、12.5、25、50、100ng/mL)。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好的理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围，如无特殊说明，实施例中的实验方法均为常规方法。

本发明的抗噻虫胺和呋虫胺重组完整抗体包括重链恒定区、重链可变区、轻链恒定区和轻链可变区，其重链恒定区序列为小鼠IgG1的重链恒定区序列，该抗体的轻链恒定区序列为小鼠κ抗体轻链恒定区序列。

小鼠抗噻虫胺和呋虫胺重组完整抗体的制备

1)抗噻虫胺和呋虫胺单克隆抗体可变区基因扩增

以一株能分泌同时识别噻虫胺和呋虫胺抗体的杂交瘤细胞株G4为材料，其分泌的抗体经鉴定为IgG1型重链，Kappa型轻链。采用Trizol法提取该该杂交瘤细胞株的总RNA，通过5’RACE技术进行5’末端cDNA扩增，利用接头引物和亚型特异性引物，获得抗体的重轻链可变区基因，其中，重链和轻链上游引物为试剂盒中自带的接头引物，重链下游特异性引物为CTCAATTTTCTTGTCCACCTTGGT，轻链下游特异性引物为CTCATTCCTGTTGAAGCTCTTGACAATGGG和CTCATTCCTGTTGAAGCTCTTGACGACGGG。

PCR扩增的程序为：

PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果参见图1，扩增出含有VH和VL基因片段的条带。用凝胶提取试剂盒纯化，将纯化后的产物克隆到pEASY-Blunt载体上，转化、测序，序列经NCBI数据库Blast比对后，鉴定出序列完整、亚型相符和正确表达框的VH和VL基因。

G4重链可变区序列为：

CAGGTGCAGCTGAAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCATCACTTGCACTATCTCTGGGTTTTCATTAACCAACTATGGTGTTCACTGGGTTCGCCAGCCTCCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTGATATGGGCTGGTGGAAACACAAATTATAATTCGGCTCTCATGTCCAGACTGAGCATCAGCAAAGACAACTCCAAGACCCAAGTTTTCTTGAGAATGAACAGTCTGCAAACTGATGATACAGCCATGTACTACTGTGCCAGCCCTTTACGGCCGCCGCGATATTACTATGGTTTGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTGTCCTCA(SEQ IDNO:1)

功能性重链可变区全长为363个碱基，结构域从第1位碱基开始，编码121个氨基酸。该有功能的重链属于IGHV2-9*02，V区匹配率为96.9％。

以IMGT法定义结构域，具体结构域划分为：

结构域	FR1	CDR1	FR2	CDR2	FR3	CDR3	FR4
								碱基序列	1-75	76-99	100-150	151-171	172-285	286-330	331-363

G4重链可变区氨基酸序列:

QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTISGFSLTNYGVHWVRQPPGKGLEWLGVIWAGGNTNYNSALMSRLSISKDNSKTQVFLRMNSLQTDDTAMYYCASPLRPPRYYYGLDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO:2)

G4轻链可变区氨基酸序列

GATGTTTTGATGACCCAAAGTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCATTGTTCATAGTAATGGAAACACCTATTTAGAATGGTACCTGCAGAAACCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTATAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCATACTCAAGATCAGTAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTACTGCTTTCAAGGCTCACATGTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA(SEQ ID NO:3)

功能性轻链可变区全长为个336个碱基，结构域从第1位碱基开始，编码112个氨基酸，该有功能的轻链属于IGKV1-117*01，V区匹配率为98.0％。

以IMGT法定义结构域，具体结构域划分为：

结构域	FR1	CDR1	FR2	CDR2	FR3	CDR3	FR4
								碱基序列	1-78	79-111	112-162	163-171	172-279	280-306	307-336

G4轻链可变区氨基酸序列

DVLMTQSPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFILKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPYTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:4)

2)表达载体的构建

采用同源重组法分别将重链和轻链可变区基因连接到线性化的表达载体pCDNA3.4-Mouse-IgG1和pCDNA3.4-Mouse-Kappa上。其中，pCDNA3.4-Mouse-IgG1上面含有小鼠IgG1重链恒定区域基因，pCDNA3.4-Mouse-Kappa上面含有小鼠Kappa轻链恒定区域基因。分别将重链/轻链表达载体转化至T1感受态、摇菌培养并测序。

3)重组完整抗体的表达

将测序正确的质粒对应的菌液大体积培养扩增，使用去内毒素质粒提取试剂盒，分别提取重/轻链表达在质粒。在转染前期，复苏HEK293F细胞，并于120rpm，8％CO₂，37℃环境下悬浮培养至密度为3×10⁶个/mL，进行第一次传代，传代的密度为0.3×10⁶个/mL。当第一次传代的细胞的密度增殖到3×10⁶个/mL时，进行第二次传代，传代的密度为0.3×10⁶个/mL。培养至细胞密度约为3×10⁶个/mL时，准备转染表达。在转染前，将细胞接种到新的培养瓶中，接种密度为1.5×10⁶个/mL。并将重链质粒和轻链质粒以及脂质体转染试剂提前用培养液混匀，37℃，静置15min。将上述转染液逐滴加入到悬浮细胞培养液中，边加边摇匀。转染后的细胞继续悬浮培养5d收集上清。采用Protein A亲和层析柱纯化细胞上清中重组完整抗体，纯化过程中液体流速均为1mL/min。纯化后的抗体用0.01M PBS溶液进行透析过夜，透析结束后，测定抗体浓度为3mg/mL，采用SDS-PAGE(图2)进行了验证。

重组完整抗体的性能鉴定

1)重组完整抗体异源间接竞争ELISA法建立

在前期制备亲本腹水单克隆抗体时，比较了同源间接竞争ELISA(包被原为噻虫胺和OVA)和异源间接ELISA(包被原为噻虫啉-OVA和氯噻啉-OVA)方法的灵敏度差异，研究结果发现，当使用噻虫啉-OVA作为异源包被时，ELISA法的灵敏度最高。故本发明中采用以噻虫啉-OVA为包被原的异源间接竞争ELISA评价抗噻虫胺和呋虫胺重组完整抗体的灵敏度和特异性。将噻虫啉-OVA作为异源包被原包被96孔板，然后用兔抗鼠IgG-HRP作为检测抗体，TMB作为反应底物，噻虫胺和呋虫胺以及其他结构类似物农药标准品作为检测物，进行ELISA检测。

1)重组完整抗体的灵敏度(IC₅₀)

根据抑制率和噻虫胺以及呋虫胺浓度作图建立标准曲线(图3)，并分别计算噻虫胺和呋虫胺的抑制中浓度(IC₅₀)以及线性范围(IC₂₀～IC₈₀)。其中噻虫胺对该重组完整抗体的IC₅₀为5.22ng/mL，线性范围为1.08-15.06ng/mL；呋虫胺对该重组抗体的IC₅₀为10.66ng/mL，线性范围为3.78-30.03ng/mL。

2)重组完整抗体的特异性

本发明中通过检测与8种常见的新烟碱类杀虫剂的交叉反应来评价抗体的特异性。异源间接竞争ELISA数据显示本发明中制备的重组完整抗除能特异性识别噻虫胺和呋虫胺以外，对吡虫啉、噻虫啉、啶虫脒、氯噻啉、噻虫嗪和烯啶虫胺无明显交叉反应(IC₅₀>1000ng/mL，交叉反应率均<0.5％)，所制备的重组完整抗体可用于噻虫胺和呋虫胺特异性分析。

3)重组完整抗体动力学表面等离子共振(SPR)表征

本发明中，用BiacoreT200检测重组完整抗体对目标分析物的亲和力。

动力学测定分析了重组完整抗体在一系列分析物浓度下对噻虫胺或呋虫胺的亲和力。结果，显示该重组完整抗体对噻虫胺的亲和力为7.96×10^-9M和对呋虫胺的亲和力为7.56×10^-9M，从而可知，本发明中制备的重组完整抗体对噻虫胺和呋虫胺均有很高的亲和力。

Claims (9)

1.一种抗噻虫胺和呋虫胺宽谱抗体的可变区序列，其特征在于：重链可变区编码基因的氨基酸序列为SEQID NO:2所示。

2.根据权利要求1所述的抗噻虫胺和呋虫胺宽谱抗体的可变区序列，其特征在于：重链可变区编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

3.根据权利要求1或2所述的抗噻虫胺和呋虫胺宽谱抗体的可变区序列，其特征在于：轻链可变区编码基因的氨基酸序列为SEQ ID NO:4所示。

4.根据权利要求3所述的抗噻虫胺和呋虫胺宽谱抗体的可变区序列，其特征在于：轻链可变区编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

5.一种抗噻虫胺和呋虫胺宽谱重组完整抗体，包括重链恒定区、重链可变区、轻链恒定区和轻链可变区，其特征在于：所述重链可变区编码基因的氨基酸序列为如SEQ ID NO:2所示。

6.根据权利要求5所述的抗噻虫胺和呋虫胺宽谱重组完整抗体，其特征在于：所述重链可变区编码基因的核苷酸序列为如SEQ ID NO:1所示。

7.根据权利要求6所述的抗噻虫胺和呋虫胺宽谱重组完整抗体，其特征在于：所述轻链可变区编码基因的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

8.根据权利要求7所述的抗噻虫胺和呋虫胺宽谱重组完整抗体，其特征在于：所述轻链可变区编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

9.一种抗体表达质粒，其特征在于：含有如权利要求1-2中任一项所述的重链可变区和小鼠重链IgG1恒定区的核苷酸序列，可以表达抗噻虫胺和呋虫胺宽谱重组完整抗体的重链蛋白；或者，含有如权利要求3-4中任一项所述的轻链可变区和小鼠轻链Kappa恒定区的核苷酸序列，可以表达抗噻虫胺和呋虫胺抗体宽谱重组完整抗体的轻链蛋白。

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