JP2006282548A - クロチアニジンおよびジノテフランのハプテン化合物、抗体、ハイブリドーマおよびその測定手段、測定キットまたは測定方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 クロチアニジンやジノテフランに対して高感度、かつ選択性の高い抗体を作製するためのハプテン化合物、クロチアニジンおよびジノテフランに対する抗体、ならびに当該抗体を用いた高感度かつ定量性に優れたクロチアニジンあるいはジノテフランおよびその類似化合物の免疫学的測定手段、測定キットおよび免疫学的測定方法を提供すること。
【解決手段】 下記式（１）：
【化１】

（式中、Ａは硫黄原子、酸素原子および−ＮＨ−を、Ｌはカルボキシル基、アミノ基、アルデヒド基およびヒドロキシル基を、ｎは１から１０の整数を表す。）
で表わされる構造を有する化合物。
【選択図】 なし

Description

本発明は、クロチアニジンおよびジノテフランのハプテン化合物、抗体、抗体を産出するハイブリドーマおよびその測定手段、測定キットまたは測定方法に関する。

クロチアニジン（化学名：（Ｅ）−１−（２−クロロ−１，３−チアゾール−５−イルメチル）−３−メチル−２−ニトログアニジン）は、以下の式（２）：

で表される構造を有するネオニコチノイド系殺虫剤である。ウンカ・ヨコバイ類，アブラムシ類，コナジラミ類，カメムシ類，コナカイガラムシ類，ツノロウムシ類等の半翅目害虫，ミナミキイロアザミウマ，チャノキイロアザミウマ等のアザミウマ目害虫，イネミズゾウムシ，イネドロオイムシ，ゴマダラカミキリ，コガネムシ類等の甲虫目害虫，シンクイムシ類，チャノホソガ，キンモンホソガ，ギンモンハモグリガ，モモハモグリガ，ミカンハモグリガ等の鱗翅目害虫，更にはマメハモグリバエ等の双翅目害虫などの幅広い害虫に低薬量で卓効を示し、作物に対して安全性の高い化合物であり、薬剤施用方法も散布，育苗箱処理，植穴処理，株元処理，種子処理など多様な処理方法が可能である。

一方、ジノテフラン（化学名：（ＲＳ）−１−メチル−２−ニトロ−３−（テトラヒドロ−３−フリルメチル）グアニジン）は、以下の式（３）：

で表される構造を有するネオニコチノイド系の殺虫剤である。イネ、園芸作物、防疫用など広い範囲の害虫に有効であり、有機りん剤やカーバメート剤に替わる殺虫剤として利用されている。

近年、土壌、水、大気等の環境中での残留農薬や、最近特に増加してきた輸入農産物の農薬等の残留に大きな社会的関心が寄せられている。クロチアニジンについては、環境庁長官個別設定の農薬登録保留基準値が、例えば、米（０．５ｐｐｍ）、みかん（１ｐｐｍ）、みかん以外のかんきつ類（２ｐｐｍ）、大粒果実類（０．５ｐｐｍ）、小粒果実類（５ｐｐｍ）、第２果菜類（２ｐｐｍ）、いも類（０．１ｐｐｍ）、茶（５０ｐｐｍ）などと定められている。

一方、ジノテフランについては、環境庁長官個別設定の農薬登録保留基準値が、例えば、米（０．５ｐｐｍ）、みかん（１ｐｐｍ）、みかん以外のかんきつ類（２ｐｐｍ）、第１大粒果実類（１ｐｐｍ）、第２大粒果実類（２ｐｐｍ）、小粒果実類（１０ｐｐｍ）、第２果菜類（２ｐｐｍ）、第１葉菜類（１ｐｐｍ）、第２葉菜類（０．５ｐｐｍ）、根・茎類（０．２ｐｐｍ）などと定められている。

従って、環境や食品に関する安全確保のためには、上記の農作物に含有されるクロチアニジンあるいはジノテフランの量を迅速かつ正確に測定することが必要である。

従来、例えば農作物中のクロチアニジンあるいはジノテフランの残留量は、米、果実、野菜、いも類等から抽出し、精製した後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により分析されてきた。即ち、試料をアセトニトリルで抽出し、多孔性ケイソウ土カラムクロマトグラフィー、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製後、ＨＰＬＣで測定する方法が採用されている。

一方、免疫学的測定法は、抗原抗体反応を利用して抗原の測定を行うもので、測定精度が優れているばかりでなく、迅速、簡便かつ経済的な測定法である。従来、免疫学的測定法は、臨床診断の分野で患者の病態解析法の一つとして大きな役割を担ってきたが、環境負荷化学物質の測定への適用が進んでいる。具体的には、免疫原性キャリアータンパク質にコンジュゲートされたネオニコチノイドハプテンで動物を免疫化することによって産生されたポリクローナル抗体を用いたネオニコチノイド系殺虫剤の測定が試みられている（例えば特許文献１参照）。
特表２００３−５１６４２３号公報

しかしながら、上記ＨＰＬＣで測定する方法は、試料の調製が煩雑で多大の手順と時間を必要とし、分析に熟練を要すること、並びに、測定装置や設備等に高額の費用を必要とする等の問題点がある。クロチアニジンやジノテフランの測定は短時間で膨大な数の試料の分析結果を出す必要があり、精度面だけでなく、簡便性、迅速性及び経済性をも具備した新規測定方法が要求されてきている。

また、免疫学的測定法においても、上記の抗体は、反応性において十分な性能を持つが、クロチアニジンやジノテフランについては、その反応性を検討するに至っておらず、実用化の要請が強まっている。

本発明の目的は、クロチアニジンやジノテフランに対して高感度、かつ選択性の高い抗体を作製するためのハプテン化合物、クロチアニジンおよびジノテフランに対する抗体、ならびに当該抗体を用いた高感度かつ定量性に優れたクロチアニジンあるいはジノテフランおよびその類似化合物の免疫学的測定手段、測定キットおよび免疫学的測定方法を提供することにある。

本発明者らは、前記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、以下に示すクロチアニジンおよびジノテフランのハプテン化合物およびその類似化合物、抗体、および測定手段、測定キットまたは測定方法により前記目的を達成することができることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明の対象となる化合物は、下記式（１）：

（式中、Ａは硫黄原子、酸素原子および−ＮＨ−を、Ｌはカルボキシル基、アミノ基、アルデヒド基およびヒドロキシル基を、ｎは１から１０の整数を表す。）
で表わされる構造を有する。

前記式（１）で表される化合物において、Ａが硫黄原子、Ｌがカルボキシル基、ｎが２であることが好ましい。

本発明者は、上記化合物１が、クロチアニジンおよびジノテフランのハプテンとして好適に用いることが可能であることを案出したもので、高感度、かつ選択性の高い抗体を作製するが可能であり、当該抗体を用いた高感度かつ定量性に優れたクロチアニジンあるいはジノテフランの免疫学的測定手段および免疫学的測定方法を提供することができる。

本発明は、上記化合物をハプテンとし、当該ハプテンと高分子化合物との複合体を抗原として用いることにより得られるクロチアニジンおよびジノテフランに対する抗体またはそのフラグメントである。

本発明においては、上記ハプテンと高分子化合物との複合体を抗原として用いることにより、動物においてクロチアニジンおよびジノテフランに対する免疫応答を良好に惹起することができ、特異的かつ高感度な抗クロチアニジンおよび抗ジノテフラン抗体を得ることができる。また、本発明にはＦａｂフラグメントやＦ（ａｂ’）２フラグメントなどのように抗原結合性を有する抗体の一部も包含される。

本発明においては、前記抗体がモノクローナル抗体またはそのフラグメントであることが好ましい。

一般に抗体には、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体が包含され、これら抗体の中でも、本発明ではクロチアニジンおよびジノテフランに対してモノクローナル抗体が高感度であり、しかも選択性が高いことを見出した。

本発明は、上記抗体を産生するハイブリドーマである。

本発明に係るハイブリドーマによって、前記モノクローナル抗体を安定して産生することができるとともに、当該ハイブリドーマを培養することにより、大量のモノクローナル抗体を製造することができる。
具体的には、本発明においては、前記ハイブリドーマがＣＴＮ−１６Ａ３−１３であることが好ましい。

こうしたハイブリドーマによって、クロチアニジンまたはジノテフランに対する高感度かつ選択性が高い抗体を安定的に産出することができることを見出したもので、クロチアニジンまたはジノテフランの免疫学的測定に好適に用いることができる。

本発明は、上記いずれかの抗体またはそのフラグメントを含んでなるクロチアニジンまたはジノテフランの測定手段である。

本発明の測定手段は、本発明のモノクローナル抗体を含むことにより、クロチアニジンまたはジノテフランの免疫学的測定方法に好適に用いられ、クロチアニジンまたはジノテフランを特異的、高感度および簡便に測定することのできる手段を提供することができる。本発明の測定手段が前記式（１）とは異なる構造を有する化合物を含有する固相化抗原をさらに含む場合、より高感度に測定することができる手段を提供することもできる。

本発明は、上記いずれかの抗体またはそのフラグメントを含んでなるクロチアニジンまたはジノテフランの測定キットである。

上記測定手段のうち、測定キットとした場合には、特に現場でのクロチアニジンまたはジノテフランの免疫学的測定作業などに好適に用いられ、クロチアニジンまたはジノテフランを特異的、高感度および簡便に測定することのできる手段を提供することができる。

本発明は、上記いずれかの抗体またはそのフラグメントを含んでなるクロチアニジンまたはジノテフランの測定方法である。

本発明のモノクローナル抗体または測定手段を用いることにより感度、特異性および操作の簡便性にすぐれた効果を奏する測定方法が可能である。

本発明の化合物は、クロチアニジンおよびジノテフランのハプテンとして好適に用いられるものである。当該ハプテン化合物と高分子化合物との複合体を抗原として用いることにより、動物においてクロチアニジンおよびジノテフランに対する免疫応答を良好に惹起することができ、特異的かつ高感度な抗クロチアニジンおよび抗ジノテフラン抗体を得ることができる。前記式（１）で表される化合物において、Ｌはカルボキシル基、ｎは２の場合、クロチアニジンおよびジノテフランのハプテンとして特に優れた効果を奏する。

本発明の抗体がモノクローナル抗体である場合、クロチアニジンおよびジノテフランに対して高感度であり、しかも他の類似化合物に対する交差反応性が認められず、クロチアニジンおよびジノテフランを特異的に検出することができる。本発明のハイブリドーマは、前記モノクローナル抗体を安定して産生することができ、当該ハイブリドーマを培養または由来の動物の腹腔内に投与し腹水を作らせることにより、大量のモノクローナル抗体を製造することができる。本発明の測定手段は、本発明のモノクローナル抗体を含むことにより、クロチアニジンまたはジノテフランの免疫学的測定方法に好適に用いられ、クロチアニジンまたはジノテフランを特異的、高感度および簡便に測定することができる。さらに、測定キットとした場合には、特に現場でのクロチアニジンまたはジノテフランの免疫学的測定作業などに好適に用いることができる。本発明のクロチアニジンまたはジノテフランの測定方法は、本発明のモノクローナル抗体または測定手段を用いることにより感度、特異性および操作の簡便性にすぐれた効果を奏する。

本発明は、下記式（１）：

（式中、Ａは硫黄原子、酸素原子および−ＮＨ−を、Ｌはカルボキシル基、アミノ基、アルデヒド基およびヒドロキシル基を、ｎは１から１０の整数を表す）で表わされる構造を有する化合物を提供する。該化合物は、クロチアニジンおよびジノテフランのハプテン化合物として好適に使用される。

上記式（１）で表される化合物において、Ａ−（ＣＨ_２）ｎ−Ｌはクロチアニジン構造の一部分に導入したスペーサーアームを表し、ｎは１〜１０の整数である。クロチアニジンと結合対象の高分子化合物との間に適度なスペースを有するためには、ｎは２〜５が好ましい。

上記式（１）で表される化合物において、Ｌが対象高分子と共有結合することにより、複合体を形成する。

ハプテン化合物として用いる上記式（１）で表される化合物の製造は、公知の合成方法により行うことができ、特に限定されるものではないが、例えば式（１）で表される化合物のＬがカルボキシル基のものは、下記反応式：

（式中ｎは前述と同じ意味を表す）で示す方法は、各工程において高収率で化合物を得ることから好適に用いられる。

具体的には、前記反応式において、
（１）工程１
出発原料として１、５−ジメチル−２−ニトロイミノヘキサヒドロ−１、３、５−トリアジン（ａ）および２−ブロモ−５−ブロモメチルチアゾールを用い、塩基の存在下に反応させて１−（２−ブロモチアゾール−５−イルメチル）−２−ニトロイミノ−３、５−ジメチルヘキサヒドロ−１、３、５−トリアジン（ｂ）を得る。
この反応で塩基としては特に限定されないが、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどの水酸化アルカリ金属類、水素化ナトリウム、水素化カリウムなどの水素化アルカリ金属類、ナトリウムメチラート、ナトリウムエチラートなどのアルカリ金属アルコラート類、炭酸カリウム、炭酸ナトリウムなどの炭酸塩類、トリエチルアミン、ピリジン、ＤＢＵなどの有機塩基類などを使用することができる。溶媒としては、例えばメタノール、エタノールなどのアルコール類、ベンゼン、トルエンなどの芳香族炭化水素類、ジエチルエーテル、ジプロピルエーテル、テトラヒドロフランなどのエーテル類、アセトン、メチルエチルケトンなどのケトン類、アセトニトリル、プロピオニトリルなどのニトリル類、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミドなどの酸アミド類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、水およびそれらの混合溶媒などを挙げることができる。反応温度は通常室温から溶媒の沸点の温度で、３０分から１０時間程度行う。

（２）工程２
得られた化合物を塩基の存在下、３−メルカプトアルキルカルボン酸と反応させて１−（２−カルボキシエチアルキルチオチアゾール−５−イルメチル）−２−ニトロイミノ−３，５−ジメチルヘキサヒドロ−１，３，５−トリアジン（ｃ）を得る。

本反応で用いられる塩基、溶媒については工程１と同様のものを用いることができる。反応温度は通常０℃から溶媒の沸点の温度で、反応時間は３０分から３０時間程度行う。

（３）工程３
得られた化合物を酸の存在下、必要により触媒の存在下反応させることにより１−［２−（２−カルボキシアルキルチオ）−５−イルメチル］−２−メチル−３−ニトログアニジン（ｄ）を得る。

本反応で用いられる酸または触媒としては塩酸、硫酸、リン酸等の鉱酸類、ｐ−トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸等のスルホン酸類等を使用することができる。また溶媒については工程１と同様のものを用いることができる。反応温度は通常０℃から溶媒の沸点の温度で、反応時間は３０分から１０時間程度行う。

上記各工程における詳細な合成方法は、実施例に記載する。

このようにして得られたクロチアニジンおよびジノテフランのハプテン化合物は、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、ウサギ血清アルブミン（ＲＳＡ）、オボアルブミン（ＯＶＡ） 、スカシ貝ヘモシアニン（ＫＬＨ） 、チログロブリン（ＴＧ）、免疫グロブリン等の高分子化合物（タンパク質）との複合体を形成させた後、抗原として用いる。

複合体の形成方法は、公知の方法により行うことができ、特に限定されるものではない。例えば、混合酸無水物法または活性エステル法等によって、クロチアニジンおよびジノテフランのハプテン化合物のカルボキシ基と前記高分子化合物の官能基とを反応させて、複合体を形成することができる。

本発明は、上記ハプテン化合物と高分子化合物との複合体を抗原として用いることにより得られるクロチアニジンおよびジノテフランに対する抗体を提供する。当該抗体は、クロチアニジンおよびジノテフランに対する特異性を有する抗体である。

抗体には、一般に免疫したウサギやヤギなどから血液を採取後その中に含まれる抗体を分離・精製するいわゆるポリクローナル抗体や、抗体産生能を持つクローン化ハイブリドーマの分泌する抗体を分離・精製するいわゆるモノクローナル抗体がある。本発明においては、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体が抱合される。モノクローナル抗体が有する高感度性および高選択性、さらには、複数のモノクローナル抗体の組み合わせによる複数成分との分離可能な反応性など適用の汎用性の広さから、特にモノクローナル抗体が好ましい。

前記モノクローナル抗体は、クロチアニジンおよびジノテフランに対する特異性と他の物質に対する交差反応性とを明確にするため、下記のようなＩＣ５０値を有することが好ましい。ここでＩＣ５０値とは、間接競合ＥＬＩＳＡまたは直接競合ＥＬＩＳＡにより標準阻害曲線を求めて、５０％阻害を示す検体の濃度をいう。

すなわち、本抗体は、クロチアニジンまたはジノテフランを測定対象とする場合は、直接競合ＥＬＩＳＡによるクロチアニジンまたはジノテフランに対するＩＣ５０が５００ｎｇ／ｍＬ以下であることが好ましく、５０ｎｇ／ｍＬ以下がより好ましい。

前記抗体は、通常の製造方法に従って製造することができる（Current Protocol in Molecular Biology、Chapter 11.12〜11.13（2000））。具体的には、本発明の抗体がポリクローナル抗体の場合には、常法に従ってクロチアニジンおよびジノテフランのハプテン化合物と高分子化合物との複合体を形成させた後、当該複合体を家兎等の非ヒト動物に免疫し、該免疫動物の血清から常法に従って得ることが可能である。一方、モノクローナル抗体の場合には、前記複合体を常法に従ってマウス等の非ヒト動物に免疫し、得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させて調製したハイブリドーマ細胞をスクリーニングし、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを培養することにより得ることができる（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubelet al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.4 〜11.11 ）。

抗体の調製は、限外ろ過、硫安分画、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニテイークロマトグラフィーなどの濃縮・精製法を適宜組み合わせて行うことができる。

また、本発明は、前記モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを提供する。以下、マウスでのハイブリドーマの作製方法についてより詳細に説明する。
前記のように調製した抗原を２ｍｇ／ｍＬ程度になるように生理的リン酸緩衝液に溶解し、アジュバントと等量混合した後、ＢａＬｂ／ｃマウスの腹腔内に投与する。その後、約２週間毎に追加免疫する。尾血管から採取した血液の血清中の抗体力価が高くなった前記マウスの脾臓を摘出し、無血清ＤＭＥＭ培地（ダルベッコ改変イーグル培地）中で、組織片等を取り除いた後に新しい培地中に移し、脾細胞を完全に培地中に浮遊させる。遠心、上清除去を数回繰り返し、細胞を洗った後、マウスのミエローマ細胞（Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３）と細胞数の比５：１〜１０：１（脾細胞：ミエローマ）で混合する。細胞を沈殿させ上清を取り除いたあと、攪拌しながら５０％ポリエチレングリコール（分子量１５００）をゆっくり加え細胞融合を行う。細胞融合後、遠心分離によって集めた細胞に、細胞数が５×１０^５個／ｍＬになるようにＨＡＴ培地を加えて懸濁し、細胞懸濁液を９６穴プラスチックプレートに２５０μＬ／ウェルの量で分注して、３７℃、５％炭酸ガス、加湿条件下のインキュベーター中で培養する。１週間後、ウェル中の培地の半量をＨＡＴ培地で置換して、１０日から１４日間培養する。培養液中の抗体の活性をＥＬＩＳＡで調べ、目的とする抗体を産生しているウェルの細胞について、限界希釈法によりハイブリドーマのクローニングを行う。クローニングにより、抗クロチアニジンおよび抗ジノテフラン抗体を産生している安定なハイブリドーマ株を得る。

本発明では、前記方法によりハイブリドーマを作製しＣＴＮ−１６Ａ３−１３について、寄託番号ＦＥＲＭ−ＡＰ−２０３８３の下、２００５年２月１日に独立行政法人製品評価技術基盤機構、特許生物寄託センターに寄託した。

本発明のハイブリドーマは、培地（例えば、１０％牛胎児血清を含むＤＭＥＭ）を用いて培養し、その培養液の遠心上清をモノクローナル抗体溶液とすることができる。また、本ハイブリドーマを由来する動物の腹腔に注入することにより、腹水を生成させ、得られた腹水をモノクローナル抗体溶液とすることができる。これらの抗体溶液は、さらに上述のように精製・濃縮することができる。

また、本発明においては、クロチアニジンおよびジノテフランに特異的に結合する抗体を含むことにより、クロチアニジンまたはジノテフランを簡便に測定することができ、測定手段としての測定キットおよび後述するクロチアニジンまたはジノテフランの測定方法に好適に使用することができる。前記キットは、さらに、測定法に応じて、標識された二次抗体もしくは標識されたクロチアニジンおよびジノテフランのハプテン化合物、緩衝液、検出試薬および／またはクロチアニジンあるいはジノテフランの標準溶液等を含む。好ましいキットは、ＥＬＩＳＡ法に用いられうるものであり、下記直接競合ＥＬＩＳＡ法に用いる場合、固相化されたクロチアニジンおよびジノテフランに対する抗体、固相化抗体を保持する担体、酵素標識された抗原および検出試薬などを含む。

さらに、本発明は、前記抗体または測定手段を用いることを特徴とするクロチアニジンまたはジノテフランの測定方法に関する。測定方法としては、通常の抗原−抗体反応を利用する方法であれば特に制限されず、放射性同位元素免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、蛍光もしくは発光測定法、凝集法、イムノブロット法、イムノクロマト法等(Meth. Enzymol., 92, 147-523 (1983), Antibodies Vol.II IRL Press Oxford (1989))が挙げられるが、感度や簡便性等の点からＥＬＩＳＡが好ましい。ＥＬＩＳＡに用いる酵素としては、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ等が挙げられる。

ＥＬＩＳＡによる測定法は、間接競合ＥＬＩＳＡまたは直接競合ＥＬＩＳＡなどが挙げられる。例えば以下に述べるような本発明のモノクローナル抗体を用いた直接競合ＥＬＩＳＡによって行うことができる。

（１）本発明のモノクローナル抗体を、担体に固相化する
用いる担体は、９６穴、４８穴、１９２穴等のマイクロタイタープレートが好ましい。固相化は、例えば、固相化用抗体を含む緩衝液を担体上に載せ、インキュベーションすればよい。緩衝液中の抗体の濃度は、通常０．０１μｇ／ｍＬから１００μｇ／ｍＬ程度である。緩衝液としては、検出手段に応じて公知のものを使用することができる。

（２）担体の固相表面へのタンパク質の非特異的吸着を防止するため、固相化用抗体が吸着していない固相表面部分を、抗体と無関係なタンパク質等によりブロッキングする。ブロッキング剤としては、ＢＳＡもしくはスキムミルク溶液、または市販のブロックエース（大日本製薬社製）等を使用することができる。ブロッキングは、前記ブロッキング剤を担体に添加し、例えば、約４℃で一晩インキュベーションした後、洗浄液で洗浄することにより行われる。洗浄液としては特に制限はないが、前記（１）と同じ緩衝液を使用することができる。

（３）各種濃度のクロチアニジンまたはジノテフランを含む試料に、クロチアニジンおよびジノテフランのハプテン化合物と酵素を結合させた酵素結合ハプテンを加えた混合物を調製する。

酵素結合ハプテンの調製は、クロチアニジンおよびジノテフランのハプテン化合物を酵素に結合する方法であれば特に制限なく、いかなる方法で行ってもよい。

（４）工程（３）の混合物を工程（２）で得られた抗体固相化担体と反応させる
クロチアニジンまたはジノテフランと酵素結合ハプテンとの競合阻害反応により、これらと固相化担体との複合体が生成する。反応は例えば、約２５℃で約１時間行う。反応終了後、緩衝液で担体を洗浄し、固相化抗体と結合しなかった酵素結合ハプテンを除去する。

固相化抗体−酵素結合ハプテン複合体の量を測定することにより、予め作成した検量線から試料中のクロチアニジンまたはジノテフランの量を決定する。

（５）担体に結合した標識酵素と反応する発色基質溶液を加え、吸光度を測定することによって検量線からクロチアニジンまたはジノテフランの量を算出することができる
標識酵素としてペルオキシダーゼを使用する場合には、例えば、過酸化水素と、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンまたはｏ−フェニレンジアミンを含む発色基質溶液を使用することができる。通常、発色基質溶液を加えて室温で約１０分程度反応させた後、硫酸を加えることにより酵素反応を停止させる。３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンを使用する場合、４５０ｎｍの吸光度を測定する。ｏ−フェニレンジアミンを使用する場合、４９２ｎｍの吸光度を測定する。なお、バックグランド値を補正するため、６３０ｎｍの吸光度も同時に測定することが望ましい。

標識酵素としてアルカリホスファターゼを使用する場合には、例えばｐ−ニトロフェニルリン酸を基質として発色させ、ＮａＯＨ溶液を加えて酵素反応を止め、４１５ｎｍでの吸光度を測定する方法があげられる。

クロチアニジンまたはジノテフランを添加しない反応溶液の吸光度に対して、クロチアニジンまたはジノテフランを添加して抗体と反応させた溶液の吸光度の減少率を阻害率として計算する。既知の濃度のクロチアニジンまたはジノテフランを添加した反応液の阻害率により予め作成しておいた検量線を用いて、試料中のクロチアニジンの濃度またはジノテフランの濃度を算出することができる。

別の態様としてクロチアニジンまたはジノテフランの測定は以下のような手順により間接競合ＥＬＩＳＡによって行うことができる。

（１）固相化抗原を担体に固相化する
用いる担体は、通常のＥＬＩＳＡに用いる担体であれば特に制限されないが、９６穴等のマイクロタイタープレートが好ましい。固相化は、例えば、固相化用抗原を含む緩衝液を担体上に載せ、インキュベーションすればよい。緩衝液中の抗原の濃度は、通常０.０１μｇ／ｍＬから１００μｇ／ｍＬ程度である。緩衝液としては、検出手段に応じて公知のものを使用することができる。

（２）担体の固相表面へのタンパク質の非特異的吸着を防止するため、固相化用抗原が吸着していない固相表面部分を、抗原と無関係なタンパク質等によりブロッキングする。ブロッキング剤としては、ＢＳＡもしくはスキムミルク溶液、または市販のブロックエース（大日本製薬社製）等を使用することができる。ブロッキングは、前記ブロッキング剤を担体に添加し、例えば、約４℃で一晩インキュベーションした後、洗浄液で洗浄することにより行われる。洗浄液としては特に制限はないが、前記（１）と同じ緩衝液を使用することができる。

（３）前記（１）および（２）で処理された固相表面に各種濃度のクロチアニジンまたはジノテフランを含む試料および本発明のモノクローナル抗体溶液を加え、該抗体を前記固相化抗原およびクロチアニジンまたはジノテフランに競合的に反応させて、固相化抗原−抗体複合体およびクロチアニジンまたはジノテフランに対する抗体複合体を生成させる。
反応は、通常室温、１〜２時間程度で行うことができる。
クロチアニジンまたはジノテフランは、水に不溶性であるため、反応溶液中には各種有機溶媒を含有することができる。前記有機溶媒としては、クロチアニジンまたはジノテフランを溶解させ、かつ抗原−抗体反応を阻害しない範囲で有機溶媒およびその含有量を選択すればよい。具体的には、メタノール、ジメチルスルホキシドなどがあげられ、含有量は、５〜５０重量％程度である。

（４）固相化抗原−抗体複合体の量を測定することにより、予め作成した検量線から試料中のクロチアニジンまたはジノテフランの量を決定することができる。
固相化抗原−抗体複合体の量は、酵素標識した二次抗体（マウス抗体を認識する抗体）を添加して測定することができる。例えばクロチアニジンおよびジノテフランに対する抗体としてマウスモノクローナル抗体を用いる場合、酵素標識（例えば、ペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ等）した抗マウス−ヤギ抗体を用いて、担体に結合したクロチアニジンおよびジノテフランに対する抗体と反応させるのが望ましい。反応は、前記（３）と同様の条件下で行えばよい。反応後、緩衝液で洗浄する。

（５）担体に結合した二次抗体の標識酵素と反応する発色基質溶液を加え、酵素結合ハプテンの酵素に反応する発色基質溶液を前述の直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法と同様に加え、吸光度を測定することにより検量線からクロチアニジンまたはジノテフランの量を算出することができる。

前記本発明の測定方法においては、測定対象物に応じた前処理をして試料とした後、前記直接競合ＥＬＩＳＡの工程（３）または間接競合ＥＬＩＳＡに供することができる。例えば 測定対象物が土壌または食品の場合、クロチアニジンまたはジノテフランが抽出できる全ての方法を用いることができる。抽出物は、メタノールに転溶させて緩衝液で希釈後、測定試料にする。簡便法として、メタノールで抽出し緩衝液で希釈したものをそのまま試料とすることも可能である。具体的には、例えば試料５ｇに、メタノール５ｍＬを加えて２０分間振とうする。室温で３０分間静置した後、抽出物の上層２ｍＬを２５００ｒｐｍで１０分間遠心分離する。上清を蒸留水で１：４に希釈し、これを前記工程（３）に供する。

また、測定対象物が環境水の場合、抽出工程を必要とせず、直接測定試料とすることが可能である。

以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の技術的範囲を限定するためのものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾、変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。

＜実施例１＞
（１）１−（２−ブロモチアゾール−５−イルメチル）−２−ニトロイミノ−３，５−ジメチルヘキサヒドロ−１，３，５−トリアジンの合成
１，５−ジメチル−２−ニトロイミノヘキサヒドロ−１，３，５−トリアジン３．４ｇ （１９．７ｍｍｏｌ）をアセトニトリル６５ｍＬに溶解し、炭酸カリウム３．０ｇ（２１．７ｍｍｏｌ）、２−ブロモ−５−ブロモメチルチアゾール５．６ｇ（２１．７ｍｍｏｌ）を加え、３時間加熱還流させた。反応液を濃縮し、残渣にメタノールを加えろ過した。ろ液をさらに濃縮し、メタノールを加えろ過した。ろ液を濃縮して褐色の液体として、１−（２−ブロモチアゾール−５−イルメチル）−２−ニトロイミノ−３，５−ジメチルヘキサヒドロ−１，３，５−トリアジン１．８ｇ（収率２６．２％）を得た。

^１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤ_３ＯＤ） δ ２．０６（３Ｈ，ｓ，ＣＨ_３），２．８４（３Ｈ，ｓ，ＣＨ_３），４．３４（２Ｈ，ｓ，ＣＨ_２），４．３９（２Ｈ，ｓ，ＣＨ_２），４．７０（２Ｈ，ｓ，ＣＨ_２），７．６５（１Ｈ，ｓ，ＣＨ）

（２）１−（２−カルボキシエチルチオチアゾール−５−イルメチル）−２−ニトロイミノ−３，５−ジメチルヘキサヒドロ−１，３，５−トリアジンの合成
エタノール１０ｍＬに１−（２−ブロモチアゾール−５−イルメチル）−２−ニトロイミノ−３，５−ジメチルヘキサヒドロ−１，３，５−トリアジン１．２ｇ（３．４ｍｍｏｌ）を溶解し、３−メルカプトプロピオン酸０．４３ｇ（４．１ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム１．１ｇ （７．９ｍｍｏｌ）を加え、４５℃で１時間、８０℃で４時間反応させ、その後１０．５時間加熱還流を行った。反応液を濃縮し、残渣に水を加えて１Ｎ塩酸でｐＨ３にし、酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル層を無水硫酸マグネシウムで脱水、ろ過、濃縮して粗１−（２−カルボキシエチルチオチアゾール−５−イルメチル）−２−ニトロイミノ−３，５−ジメチルヘキサヒドロ−１，３，５−トリアジン０．６９ｇ（収率６８．３％）を得た。

（３）１−［２−（２−カルボキシエチルチオ）−５−イルメチル］−２−メチル−３−ニトログアニジン（クロチアニジンハプテン）の合成
１−（２−カルボキシエチルチオチアゾール−５−イルメチル）−２−ニトロイミノ−３，５−ジメチルヘキサヒドロ−１，３，５−トリアジン０．４５ｇ（１．１２ｍｍｏｌ）をエタノール １０ｍＬに溶解し、１Ｎ塩酸６．０ｍＬを加え、４０℃で５時間反応した。反応液を濃縮し、残渣をシリカゲルカラム（酢酸エチル：メタノール＝９５：５）で精製し、油状黄色液体の１−［２−（２−カルボキシエチルチオ）−５−イルメチル］−２−メチル−３−ニトログアニジン０．１９ｇ（収率５４．５％）を得た。

^１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤ_３ＯＤ） δ ２．７６（２Ｈ，ｔ，ＣＨ_２），２．９０（３Ｈ，ｓ，ＣＨ_３），３．３９（２Ｈ，ｔ， ＣＨ_２），４．６１（２Ｈ，ｓ，ＣＨ_２）， ７．５８（１Ｈ，ｓ，ＣＨ）

＜実施例２＞（免疫原の調製）
免疫原としてスカシ貝へモシアニン（ＫＬＨ）と本発明クロチアニジンハプテンとの結合体を、活性エステル法を用いて作製した。

実施例１で製造した１−［２−（２−カルボキシエチルチオ）−５−イルメチル］−２−メチル−３−ニトログアニジン（クロチアニジンハプテン）１．５ｍｇ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド１．２ｍｇおよび１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロビル）−カルボジイミド塩酸塩１．９ｍｇを、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド２００μＬに溶解し、この溶液を２５℃の暗所に１．５時間放置しクロチアニジンハプテン溶液とした。

別途、０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）１ｍＬにＫＬＨを１０ｍｇ加え、一晩攪拌することにより、ＫＬＨ溶液を得た。

このＫＬＨ溶液に、先に調製したクロチアニジンハプテン溶液を徐々に滴下し、暗所にて室温で１．５時間攪拌した。反応終了後、４℃で２日間生理的リン酸緩衝液（ＰＢＳ、１０ｍＭリン酸緩衝液、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）に対して透析した後、−４０℃で貯蔵した。このようにして得られたクロチアニジンハプテンとＫＬＨとの結合体を免疫原として使用した。

＜実施例３＞（固相化抗原の調製）
固相化抗原としてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）とクロチアニジンハプテンとの結合体を、活性エステル法を用いて作製した。

クロチアニジンハプテン１．５ｍｇ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド１．２ｍｇおよび１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロビル）−カルボジイミド塩酸塩１．９ｍｇを、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド２００μＬに溶解し、この溶液を２５℃の暗所に１．５時間放置しクロチアニジンハプテン溶液とした。

別途、０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）１ｍＬにＢＳＡを１０ｍｇ加え、一晩攪拌することにより、ＢＳＡ溶液を得た。

このＢＳＡ溶液に、先に調製したクロチアニジンハプテン溶液を徐々に滴下し、暗所にて室温で１．５時間攪拌した。反応終了後、４℃で一晩生理的リン酸緩衝液（ＰＢＳ、１０ｍＭリン酸緩衝液、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）に対して透析した後、３０℃で貯蔵した。このようにして得られたクロチアニジンハプテンとＢＳＡとの結合体を固相化抗原として使用した。

＜実施例４＞（モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの作製）
実施例２で調製した免疫源を２ｍｇ／ｍＬとなるようにＰＢＦに溶解し、これに等量の完全アジュバント（商品名：フロイント完全アジュバント；ＦＣＡ）を等量混合しエマルジョン化し、その１００μＬを６〜７週齢のメスのＢＡＬＢ／Ｃマウスに腹腔投与した。これと同様の手順で、不完全アジュバント（商品名：フロイント不完全アジュバント；ＦＩＣＡ）を等量混合した０．５ｍｇ／ｍＬの免疫原１００μＬを２週間毎に追加免疫した。４回の免疫後、眼底から採血し、血清中の抗体力価を間接競合法で確認した。十分に力価が高くなったことを確認し、１週間後に最終免疫として免疫原１０μｇ／１００μＬ・ＰＢＳを尾静脈から投与した。その３日後に当該マウスから脾臓を摘出し細胞融合に供した。

摘出した脾臓を無血清ＤＭＥＭ培地（ダルベッコ改変イーグル培地）中で余分な組織片を切除したあと、脾臓から完全に細胞を取り出し、培地中に浮遊させた。浮遊している大きな組織片を沈降させるために５分間静置、細胞浮遊液を遠沈管に集め、１５００ｒｐｍで遠心し、上清を吸引除去して、新しい無血清ＤＭＥＭを添加して細胞を浮遊させた。この操作を２回繰り返した。

あらかじめ培養してあったミエローマ細胞（Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３）を回収し、遠沈、上清除去、無血清ＤＭＥＭ培地で再浮遊を２回繰り返した。

それぞれの細胞数を計数して脾細胞とミエローマ細胞との比率が１０：１〜７．５：１になるように混合し、１５００ｒｐｍで５分間遠心して，上清を吸引除去した。

遠沈管を激しく攪拌しながら５０％ポリエチレングリコール（分子量１５００）溶液２ｍＬを約６０秒かけて添加した。次いで約１０ｍＬの無血清ＤＭＥＭを攪拌しながら３〜４分かけて添加した。

遠沈管を１０００ｒｐｍ，５分で遠心して上清を完全に吸引除去し、脾細胞が２．５×１０^６個／ｍＬになるようにＨＴ培地（ヒポキサンチン、チミジン、１０％牛胎児血清入ＤＭＥＭ培地）に浮遊させ、９６穴培養プレートに１００μＬ／ウェル分注し、３７℃、８％炭酸ガス、加湿条件下で培養を開始した。

翌日に約４０μＬ／ウェルのＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、チミジン、アミノプテリン、１０％牛胎児血清入ＤＭＥＭ培地）を添加し、ミエローマ細胞が死滅し、ハイブリドーマ細胞のコロニーが形成されるまで観察を続け、以後は細胞の状態を見ながらＨＴ培地を添加した。

培養開始から１０日後に培養液を採取し、間接競合阻害法でクロチアニジンおよびジノテフランに対する抗体を産生しているウェルを選別し、９６ウェル、４８ウェル、２４ウェルと順次培養スケールを上げた。

２４ウェルの段階で限界希釈法によるクローニングを行ない、クロチアニジンおよびジノテフランに対するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株 [ＣＴＮ−１６Ａ３−１３]を得た。

＜実施例５＞（モノクローナル抗体の作製）
実施例４で得られたハイブリドーマ株を１０％牛胎児血清入りＤＭＥＭで培養し、
約２×１０^６個の細胞をＢＡＬＢ／Ｃ メスＲｅｔｉｒｅ マウスの腹腔内に注射し、腹水液を採取した。得られた腹水はプロテインＧ カラムによりＩｇＧ精製を行った。

＜実施例６＞（クロチアニジンハプテンと西洋ワサビペルオキシダーゼとの結合体の調製）
直接競合ＥＬＩＳＡにおいてトレーサーとして用いるため、活性エステル法によりクロチアニジンハプテンと西洋ワサビペルオキシダーゼとの結合体を調製した。 クロチアニジンハプテン１．５ｍｇ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド１．２ｍｇおよび１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩１．９ｍｇを、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド２００μＬに溶解し、この溶液を２５℃の暗所に１．５時間放置しクロチアニジンハプテン溶液とした。

別途、０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）１ｍＬにＢＳＡを１０ｍｇ加え、一晩攪拌することにより、ＢＳＡ溶液を得た。
このＢＳＡ溶液に、先に調製したクロチアニジンハプテン溶液を徐々に滴下し、暗所にて室温で１．５時間攪拌した。反応終了後、４℃で一晩生理的リン酸緩衝液（ＰＢＳ、１０ｍＭリン酸緩衝液、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）に対して透析した後、３０℃で貯蔵した。ゲル濾過で精製を行い、濃度の測定はＤＣプロテインアッセイで行った。

＜実施例７＞（直接競合ＥＬＩＳＡ法によるクロチアニジンまたはジノテフランの測定）
（１）抗マウスＩｇＧヤギ抗体をＰＢＳ緩衝液（１０ｍＭ ＮａＰＢ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）で１０μｇ／ｍＬに希釈し、９６穴マイクロプレートに１００μｇ／ウェルづつ分注し、４℃で一晩放置することにより固相化した。次に液を吸引除去後、ＰＢＳ緩衝液（０．４％ＢＳＡ、１０ｍＭ ＮａＰＢ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）を３００μｇ／ウェル分注し、４℃で一晩静置することによりブロッキングを行った後、ブロッキング液を吸引除去した。

（２）実施例５で得られたモノクローナル抗体ＣＴＮ−１６Ａ３−１３をＰＢＳ緩衝液（０．２％ＢＳＡ、１０ｍＭリン酸緩衝液、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）で２．０μｇ／ｍＬに希釈し、（１）で作製した抗マウスＩｇＧヤギ抗体固相化プレートに１００μｇ／ウェルづつ分注した、２０℃で１時間静置した後、ＰＢＳで洗浄し抗体固相化プレートとした。

（３）ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）とクロチアニジンハプテンの結合体をＰＢＳ緩衝液（０．４％ＢＳＡ、１０ｍＭリン酸緩衝液、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）で０．２５μｇ／ｍＬに希釈しＨＲＰ希釈液とした。

（４）上記ＨＲＰ希釈液と１０％メタノール溶液に溶解したクロチアニジンの標準溶液（０．１、０．３、１．０、３．０、１０、３０および１００μｇ／ｍＬ）またはジノテフラン標準液（０．０２、０．１、０．５、２．０、１０、５０、２００μｇ／ｍＬ）を等量混合し、その混合液の１００μｇ／ウェルを（２）で得られたＣＴＮ−１６Ａ３−１３抗体固相化プレートに加え、２０℃で１時間静置した後、ＰＢＳで洗浄した。

（５）ＨＲＰ基質溶液（１００μｇ／ｍＬの３，３’，５，５’−テトラメチルベンチジンおよび０．００６％過酸化水素を添加した０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５））１００μＬをウェルに加え、２５℃で１０分間インキュベーションした後、１Ｎ硫酸１００μＬをウェルに加えて酵素反応を止め、４５０の吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。

モノクローナル抗体ＣＴＮ−１６Ａ３−１３溶液についての直接競合阻害法によるクロチアニジンおよびジノテフランの標準阻害曲線を図１および図２に示す。モノクローナル抗体ＣＴＮ−１６Ａ３−１３溶液を用いた直接競合ＥＬＩＳＡ法によるクロチアニジンの測定可能な範囲は１ｎｇ／ｍＬ〜１０ｎｇ／ｍＬであり、５０％阻害を示す値（ＩＣ５０値）は４．５ｎｇ／ｍＬであった。また、ジノテフランの測定可能な範囲は２ｎｇ／ｍＬ〜１２ｎｇ／ｍＬであり、５０％阻害を示す値（ＩＣ５０値）は６．０ｎｇ／ｍＬであった。

以上の結果から、本発明のクロチアニジン誘導体を用いて得られるモノクローナル抗体を使用する直接競合ＥＬＩＳＡ法により、クロチアニジンおよびジノテフラン分析の大幅な簡略化および測定時間の短縮が可能となり、多数の検体を迅速、簡便且つ低コストで測定できることがわかる。

＜実施例８＞（抗体のクロチアニジン構造類似化合物に対する交差反応性）
クロチアニジンと化学構造が類似している農薬について抗体ＮＰＲ−１Ｈ１２−１５の交差反応性を調べた。交差反応性は、実施例６に記載の方法と同様にして試験化合物のＩＣ５０値を求め、次式により計算し交差反応率を算出した。

交差反応率（％）＝（クロチアニジンのＩＣ５０値／試験化合物のＩＣ５０値）×１００
その結果、殺虫剤ジノテフランに対しては交差反応率７５％の高い値を示したのに対し、殺虫剤のアセタミプリド、イミダクロプリド、ニテンピラム、チアクロプリド、チアメトキサム、硫酸ニコチンおよび殺菌剤のピリフェノックスに対しいずれも交差反応性は０．１％以下であり、抗体ＮＰＲ−１Ｈ１２−１５はクロチアニジンおよびジノテフランに特異的な抗体であった。

抗体ＣＴＮ−１６Ａ３−１３を用いた直接競合ＥＬＩＳＡ法におけるクロチアニジンに対する阻害曲線を示す。 抗体ＣＴＮ−１６Ａ３−１３を用いた直接競合ＥＬＩＳＡ法におけるジノテフランに対する阻害曲線を示す。

Claims (9)

1. 下記式（１）：
   

   

   （式中、Ａは硫黄原子、酸素原子および−ＮＨ−を、Ｌはカルボキシル基、アミノ基、アルデヒド基およびヒドロキシル基を、ｎは１から１０の整数を表す。）
   で表わされる構造を有する化合物。
2. Ａが硫黄原子、Ｌがカルボキシル基、ｎが２である請求項１記載の化合物。
3. 請求項１または２記載の化合物をハプテンとし、当該ハプテンと高分子化合物との複合体を抗原として用いることにより得られるクロチアニジンおよびジノテフランに対する抗体またはそのフラグメント。
4. 前記抗体がモノクローナル抗体またはそのフラグメントであることを特徴とする請求項３または４記載の抗体またはそのフラグメント。
5. 請求項３〜４のいずれかに記載の抗体を産生するハイブリドーマ。
6. 前記ハイブリドーマがＣＴＮ−１６Ａ３−１３である請求項５記載のハイブリドーマ。
7. 請求項３または４記載の抗体またはそのフラグメントを含んでなるクロチアニジンまたはジノテフランの測定手段。
8. 請求項３または４記載の抗体またはそのフラグメントを含んでなるクロチアニジンまたはジノテフランの測定キット。
9. 請求項３または４記載の抗体、請求項７記載の測定手段または請求項８記載の測定キットを用いることを特徴とするクロチアニジンまたはジノテフランの測定方法。

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