JP2001255324A - フサライドの抗体及び測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 いもち病専用の防除剤であるフサライドの免
疫化学的測定方法の提供。 【解決手段】 以下の式（１）： ［式（１）中、ｎは１−１０の整数である。］で表され
る構造を有する化合物と高分子化合物を結合させること
により抗原を作製し、当該抗原を用いることにより、以
下の式（２）： で表される構造を有する化合物、すなわちフサライドに
反応性を示す抗体を製造することを特徴とする、式
（２）で表される構造を有する化合物に反応性を示す抗
体又はそのフラグメントの製造方法。上記抗体又はフラ
グメントを用いるフサライドの免疫化学的測定方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、４，５，６，７−
テトラクロロフタリド（以下、本明細書中「フサライ
ド」と言う）のハプテン化合物、抗原、抗体及びそのフ
ラグメントに関する。

【０００２】本発明はさらに、前記抗原、抗体及びその
フラグメントを用いた免疫化学的測定方法に関する。

【０００３】

【従来の技術】フサライドは、以下の式（２）：

【０００４】

【化３】

【０００５】で表される構造を有する殺菌剤である。詳
細には、フサライドはいもち病専用の防除剤で、予防効
果があり、残効の長い特徴がある。作用機構としては、
ｉｎ ｖｉｔｒｏの抗菌力はなく、ｉｎ ｖｉｖｏでイ
ネいもち病菌付着器の稲体への侵入能を特異的に阻害す
る。この作用はメラニン生合成系の阻害に基づくことが
最近明らかにされた。耐雨性があり、予防効果並びに浸
透移行性も認められている（農薬ハンドブック 第２４
６頁−第２４７頁及び第６６６頁 １９９８年版
（社）日本植物防疫協会）。

【０００６】近年、土壌、水、大気等の環境中での残留
農薬や、最近特に増加してきた輸入農産物のポストハー
ベスト農薬等の残留に大きな社会的関心が寄せられてい
る。フサライドについては、農薬登録保留基準が、米で
１ｐｐｍと定められている。また、水に関する基準につ
いても、公共用水域等に関する基準値が０．１ｍｇ／ｍ
ｌと定められている（最新 農薬の規制・基準値便覧、
１９９５年版、第２９８頁、（社）日本植物防疫協
会）。よって、環境や食品に関する安全確保のために
は、これらに含有される、フサライドの量を迅速かつ正
確に測定することが必要である。

【０００７】従来、例えば農作物中のフサライドは米か
ら抽出し、精製した後、ガスクロマトグラフィー（Ｇ
Ｃ）により分析されてきた。即ち、例えば、試料をアセ
トンで抽出し、多孔性ケイソウ土カラムクロマトグラフ
ィー（ＣＣ）で精製後、ヘキサン−アセトニトリル分配
してアセトニトリル層を濃縮乾固し、さらにシリカゲル
ＣＣで精製後、ＧＣで測定する方法等が採用されている
（「最新 農薬の残留分析法」 第３３４頁−第２３５
頁、中央法規出版 １９９５年４月１日発行））。これ
らの方法は、試料の調製が煩雑で多大の手順と時間を必
要とし、分析に熟練を要すること、並びに、測定装置や
設備等に高額の費用を必要とする等の問題点がある。フ
サライドの測定は短時間で膨大な数の試料の分析結果を
出す必要があり、精度面だけでなく、簡便性、迅速性及
び経済性をも具備した新規測定方法が要求されてきてい
る。

【０００８】免疫化学的測定方法は、抗体が抗原を特異
的に認識する抗原抗体反応に基づいて抗原や抗体の検出
を行う方法であり、その優れた精度、簡便性、迅速性、
経済性から近年注目を集めてきている。免疫化学的測定
方法においては検出方法として非常に多種の標識、例え
ば、酵素、放射性トレーサー、化学発光あるいは蛍光物
質、金属原子、ゾル、ラテックス及びバクテリオファー
ジが適用されてきた。

【０００９】免疫化学的測定方法の中でも、酵素を使用
する酵素免疫測定法（ＥＩＡ）は経済性・利便性から特
に優れたものとして広く使用されるに至っている。酵素
免疫測定法についての優れた論評が、Ｔｉｊｓｓｅｎ
Ｐ，“Ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｎｄ ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ
ｅｎｚｙｍｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ” ｉｎＬ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ａｍｓｔｅｒ
ｄａｍ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｏｘｆｏｒｄ ＩＳＢＮ
０−７２０４−４２００−１（１９９０）に記載され
ている。

【００１０】一般に、分子量が大きな分子については、
それ以上修飾することなく動物に接種することにより、
適当な免疫反応を惹起し、抗原を認識する抗体を産生さ
せることができる。しかし、フサライドのような低分子
化合物は通常動物に接種したとき免疫応答を引き出すこ
とができない。これらの分子は免疫原性を有する高分子
化合物（タンパク質や多糖類など）に結合させることに
よって初めて一団のエピトープとして行動し、Ｔ細胞受
容体の存在下で免疫応答を起こし、その結果、一群のＢ
リンパ球により抗体が産生される。このように高分子化
合物と結合させて初めて免疫原性を生じる分子を総称し
て「ハプテン」と言う。

【００１１】しかし、低分子化合物を高分子化合物と結
合させたものを抗原としても、得られた抗体は望む分子
を認識しないか、あるいはごく低い親和性しかもたない
場合がしばしばある。そのため、一般に低分子化合物そ
のものではなく、結合に利用できる官能基と共にスペー
サーアーム（結合手）を導入したものをハプテンとして
使用する必要がある。しかしその場合に、結合手／官能
基の配置、結合手の大きさ等の全ての問題を考慮して導
入が適切に行われたものを使用しないと、好ましい抗体
は得られない。適切な導入は個々の分子に応じて工夫し
なければならない。

【００１２】フサライドについては、その必要性が非常
に高かったにもかかわらず、適切な抗体はもとより、そ
のような抗体を作製するためのハプテンも本発明前には
得られていなかった。

【００１３】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、フサライド
に反応する新規な抗体若しくはそのフラグメント、及び
その作製方法を提供することを目的とする。尚、本明細
書において抗体の「フラグメント」とは、抗原と結合可
能な抗体の一部分、例えばＦ_ab断片等を意味する。

【００１４】本発明はその一態様において、フサライド
に反応性を有するモノクローナル抗体を提供する。

【００１５】本発明は、また、フサライドに反応性を有
する新規な抗体を作製するための抗原を構成するハプテ
ン化合物（フサライドハプテン）を提供することを目的
とする。

【００１６】本発明は、さらに、フサライドハプテンと
高分子化合物との結合体を提供することを目的とする。

【００１７】本発明は、さらにまた、前記抗体又はその
フラグメントを産生するハイブリドーマを提供すること
を目的とする。

【００１８】本発明は、さらに、前記抗体若しくはその
フラグメント及び／又は前記フサライドハプテンと高分
子化合物若しくは標識物質との結合体を使用することを
含む、フサライドの免疫化学的測定方法を提供すること
を目的とする。

【００１９】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、鋭意研究
を重ねた結果、フサライド又はその部分にスペーサーア
ーム及び高分子化合物との結合に利用できる官能基を導
入した、フサライドの誘導体をハプテンとして使用する
ことにより、前記化合物に反応性を有する抗体を得るこ
とに成功し、本発明の完成に至った。

【００２０】本発明の対象となるフサライドは、以下の
式（２）：

【００２１】

【化４】

【００２２】で表される構造を有する化合物である。本
発明の抗体は、例えば、フサライドの一部分にスペーサ
ーアーム及び結合に利用できる官能基を導入した誘導体
をハプテンとして適当な高分子化合物と結合させたもの
を抗原として用いることによって得ることができる。例
えば、以下の式（１）：

【００２３】

【化５】

【００２４】［式（１）中、ｎは１−１０の整数であ
る］で表される構造を有する化合物を、抗体作製のため
のハプテンとして使用する。

【００２５】式（１）中、好ましくは、ｎは５である。
なお、式（１）のハプテン化合物において窒素原子を含
む５員の複素環は２個の酸素で置換されているが、対象
化合物のフサライドと同様に１個の酸素で置換されてい
てもよい。

【００２６】本発明は、前記ハプテン化合物、ハプテン
化合物と高分子化合物との結合体、フサライドに反応す
る抗体及びその作製方法、並びに該ハプテン化合物又は
該抗体を用いるフサライドの免疫化学的測定方法に関す
る。

【００２７】フサライドハプテンの作製 式（１）で表されるフサライドハプテンは、公知の方法
に従って製造することができる。限定するわけではない
が、例えば以下のような方法を用いることができる。

【００２８】例えば、以下の式（Ｘ１）：

【００２９】

【化６】

【００３０】で表される構造を有する無水テトラクロロ
フタール酸に、以下の式（Ｘ２）：

【００３１】

【化７】

【００３２】［式（Ｘ２）中、ｎは１−１０の整数であ
る］で表される構造を有するアミノカルボン酸を反応さ
せて、式（１）の化合物を得ることができる。

【００３３】反応は、０℃から溶媒の沸点の温度、好ま
しくは５０℃から１５０℃で、５分から１５時間、好ま
しく３０分から４時間行う。反応は通常無溶媒で行う
が、トルエン、キシレン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミ
ド等の不活性溶媒中で行ってもよい。

【００３４】なお、式（Ｘ１）の化合物は市販されてい
るものを使用することができる。あるいは、公知の方法
を用いて市販の化合物より合成することも可能である。

【００３５】上述したような製造方法によって得られた
化合物を、必要に応じシリカゲルクロマトグラフィー又
は再結晶操作等を行うことにより、さらに高純度の精製
品とすることができる。

【００３６】以下、本発明の抗原、抗体の作製、及び免
疫化学的測定法について説明する。尚、これらの調製は
公知の方法、例えば続生化学実験講座、免疫生化学研究
法（日本生化学会編）等に記載の方法に従って行うこと
ができる。

【００３７】フサライドハプテンと高分子化合物との結
合体の作製 上述のように合成されたフサライドハプテンを適当な高
分子化合物に結合させてから免疫用抗原若しくは固相化
用抗原として使用する。

【００３８】好ましい高分子化合物の例としては、スカ
シガイへモシアニン（以下、「ＫＬＨ」と言う）、卵白
アルブミン（以下、「ＯＶＡ」と言う）、ウシ血清アル
ブミン（以下、「ＢＳＡ」と言う）、ウサギ血清アルブ
ミン（以下、「ＲＳＡ」と言う）などがある。ＫＬＨ及
びＢＳＡが好ましい。

【００３９】フサライドハプテンと高分子化合物との結
合は、例えば、混合酸無水物法（Ｂ．Ｆ．Ｅｒｌａｎｇ
ｅｒ ｅｔ ａｌ．：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３４
１０９０‐１０９４（１９５４））、又は活性化エス
テル法（Ａ．Ｅ．ＫＡＲＵｅｔ ａｌ．：Ｊ．Ａｇｒｉ
ｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．４２ ３０１−３０９（１９
９４））等の公知の方法によって行うことができる。

【００４０】混合酸無水物法において用いられる酸無水
物は、通常のショッテン−バウマン反応により得られ、
これを高分子化合物と反応させることにより目的とする
ハプテン−高分子化合物結合体が製造される。ショッテ
ン−バウマン反応は塩基性化合物の存在下に行われる。
塩基性化合物としては、ショッテン−バウマン反応に慣
用の化合物を使用することができ、例えば、トリブチル
アミン、トリエチルアミン、トリメチルアミン、Ｎ−メ
チルモルホリン、ピリジン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリ
ン、ＤＢＮ、ＤＢＵ、ＤＡＢＣＯ等の有機塩基、炭酸カ
リウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素
ナトリウム等の無機塩基等が挙げられる。該反応は、通
常マイナス２０℃から１５０℃、好ましくは０℃から１
００℃において行われ、反応時間は５分から１０時間、
好ましくは５分から２時間である。得られた混合酸無水
物と高分子化合物との反応は、通常マイナス２０℃から
１００℃、好ましくは０℃から５０℃において行われ、
反応時間は５分から１０時間、好ましくは５分から５時
間である。混合酸無水物法は一般に溶媒中で行われる。
溶媒としては、混合酸無水物法に慣用されているいずれ
の溶媒も使用可能であり、具体的にはジオキサン、ジエ
チルエーテル、テトラヒドロフラン、ジメトキシエタン
等のエーテル類、ジクロロメタン、クロロホルム、ジク
ロロエタン等のハロゲン化炭化水素類、ベンゼン、トル
エン、キシレン等の芳香族炭化水素類、酢酸メチル、酢
酸エチル等のエステル類、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミ
ド、ジメチルスルホキシド、ヘキサメチルリン酸トリア
ミド等の非プロトン性極性溶媒等が挙げられる。混合酸
無水物法において使用されるハロ蟻酸エステルとして
は、例えばクロロ蟻酸メチル、ブロモ蟻酸メチル、クロ
ロ蟻酸エチル、ブロモ蟻酸エチル、クロロ蟻酸イソブチ
ル等が挙げられる。当該方法におけるハプテンとハロ蟻
酸エステルと高分子化合物の使用割合は、広い範囲から
適宜選択され得る。

【００４１】一方、活性化エステル法は、一般に以下の
ように行うことができる。まず、ハプテン化合物を有機
溶媒に溶解し、カップリング剤の存在下にてＮ−ヒドロ
キシこはく酸イミドと反応させ、Ｎ−ヒドロキシこはく
酸イミド活性化エステルを生成させる。

【００４２】カップリング剤としては、縮合反応に慣用
されている通常のカップリング剤を使用でき、例えば、
ジシクロヘキシルカルボジイミド、カルボニルジイミダ
ゾール、水溶性カルボジイミド等が含まれる。有機溶媒
としては、例えば、ジメチルスルホキシド（以下、「Ｄ
ＭＳＯ」と言う）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（以
下、「ＤＭＦ」と言う）、ジオキサン等が使用できる。
反応に使用するハプテン化合物とＮ−ヒドロキシこはく
酸イミドのモル比は好ましくは１：１０から１０：１、
より好ましくは１：１から１：１０、最も好ましくは
１：１である。反応温度は、０℃から１００℃、好まし
くは５℃から５０℃、より好ましくは２２℃から２７℃
で、反応時間は５分から２４時間、好ましくは３０分か
ら６時間、より好ましくは１時間から２時間である。

【００４３】カップリング反応後、反応液を高分子化合
物を溶解した溶液に加え反応させると、例えば高分子化
合物が遊離のアミノ基を有する場合、当該アミノ基とハ
プテン化合物のカルボキシル基の間に酸アミド結合が生
成される。反応温度は、０℃から６０℃、好ましくは５
℃から４０℃、より好ましくは２２℃から２７℃で、反
応時間は５分から２４時間、好ましくは１時間から１６
時間、より好ましくは１時間から２時間である。反応物
を、透析、脱塩カラム等によって精製して、フサライド
ハプテンと高分子化合物との結合体を得ることができ
る。

【００４４】また、上記と同様の方法により、酵素等の
標識物質をフサライドハプテンに結合させたものを、免
疫化学的測定方法において使用することができる。標識
物質としては、西洋わさびペルオキシダーゼ（以下「Ｈ
ＲＰ」と言う）、アルカリフォスファターゼ等の酵素、
フルオレセインイソシアネート、ローダミン等の蛍光物
質、³²Ｐ、¹²⁵Ｉ等の放射性物質、化学発光物質などが
ある。

【００４５】ポリクローナル抗体の作製 フサライドハプテンと高分子化合物との結合体を使用し
て、常法により本発明のポリクローナル抗体を作製する
ことができる。例えば、フサライドハプテンとＫＬＨと
の結合体をリン酸ナトリウム緩衝液（以下、「ＰＢＳ」
と言う）に溶解し、フロイント完全アジュバント又は不
完全アジュバント、あるいはミョウバン等の補助剤と混
合したものを、免疫用抗原として動物に免疫することに
よって得ることができる。免疫される動物としては当該
分野で常用されるものをいずれも使用できるが、例え
ば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ等を挙げるこ
とができる。ただし、ヒトは含まれない。

【００４６】免疫の際の投与法は、皮下注射、腹腔内注
射、静脈内注射、皮内注射、筋肉内注射のいずれでもよ
いが、皮下注射又は腹腔内注射が好ましい。免疫は１回
又は適当な間隔で、好ましくは１週間ないし５週間の問
隔で複数回行うことができる。

【００４７】免疫した動物から血液を採取し、そこから
分離した血清を用い、フサライドと反応するポリクロー
ナル抗体の存在を評価することができる。

【００４８】モノクローナル抗体の作製 フサライドハプテンと高分子化合物との結合体を使用し
て、公知の方法により本発明のモノクローナル抗体を作
製することができる。

【００４９】モノクローナル抗体の製造にあたっては、
少なくとも下記のような作業工程が必要である。 （ａ）免疫用抗原として使用するフサライドハプテンと
高分子化合物との結合体の作製 （ｂ）動物への免疫 （ｃ）血液の採取、アッセイ、及び抗体産生細胞の調製 （ｄ）ミエローマ細胞の調製 （ｅ）抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合とハ
イブリドーマの選択的培養 （ｆ）目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスク
リーニングと細胞クローニング （ｇ）ハイブリドーマの培養又は動物へのハイブリドー
マの移植によるモノクローナル抗体の調製 （ｈ）調製されたモノクローナル抗体の反応性の測定等 モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作製す
るための常法は、例えば、ハイブリドーマ テクニック
ス（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ），コ
ールド スプリング ハーバー ラボラトリーズ（Ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ，１９８０年版）、細胞組織化学（山下修二ら、日
本組織細胞化学会編；学際企画、１９８６年）に記載さ
れている。

【００５０】以下、本発明のフサライドに対するモノク
ローナル抗体の作製方法を説明するが、これに制限され
ないことは当業者によって明らかであろう。

【００５１】（ａ）−（ｂ）の工程は、ポリクローナル
抗体に関して記述した方法とほぼ同様の方法によって行
うことができる。

【００５２】（ｃ）の工程における抗体産生細胞はリン
パ球であり、これは一般には脾臓、胸腺、リンパ節、末
梢血液又はこれらの組み合わせから得ることができるが
脾細胞が最も一般的に用いられる。従って、最終免疫
後、抗体産生が確認されたマウスより抗体産生細胞が存
在する部位、例えば脾臓を摘出し、脾細胞を調製する。

【００５３】（ｄ）の工程に用いることのできるミエロ
ーマ細胞としては、例えば、Ｂａｌｂ／ｃマウス由来骨
髄腫細胞株のＰ３／Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）（Ｎａｔ
ｕｒｅ，２５６，４９５−４９７（１９７５））、Ｐ３
／Ｘ６３−Ａｇ８．Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）（Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｔｏｐｉｃｓ．ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎ
ｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８１， １−７（１９８
７））、Ｐ３／ＮＳＩ−１−Ａｇ ４−１（ＮＳ−１）
（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６，５１１−５１９
（１９７６））、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４（Ｓｐ２／０）
（Ｎａｔｕｒｅ， ２７６，２６９−２７０（１９７
８））、ＦＯ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ．Ｍｅｔｈ．，３５，
１−２１（１９８０））、ＭＰＣ−１１、Ｘ６３．６
５３、Ｓ１９４等の骨髄腫株化細胞、あるいはラット由
来の２１０．ＲＣＹ３．Ａｇ １．２．３．（Ｙ３）
（Ｎａｔｕｒｅ， ２７７，１３１−１３３，（１９７
９））等を使用できる。

【００５４】上述したミエローマ細胞をウシ胎児血清を
含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）又はイス
コフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）で継代培養し、融
合当日に約１×１０⁶以上の細胞数を確保する。

【００５５】（ｅ）の工程の細胞融合は公知の方法、例
えばミルスタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）らの方法（Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，７３，３
（１９８１））等に準じて行うことができる。現在最も
一般的に行われているのはポリエチレングリコール（Ｐ
ＥＧ）を用いる方法である。ＰＥＧ法については、例え
ば、細胞組織化学、山下修二ら（上述）に記載されてい
る。別の融合方法としては、電気処理（電気融合）によ
る方法を採用することもできる（大河内悦子ら、実験医
学 ５．１３１５−１９、１９８７）。その他の方法を
適宜採用することもできる。また、細胞の使用比率も公
知の方法と同様でよく、例えばミエローマ細胞に対して
脾細胞を３倍から１０倍程度用いればよい。

【００５６】脾細胞とミエローマ細胞とが融合し、抗体
分泌能及び増殖能を獲得したハイブリドーマ群の選択
は、例えば、ミエローマ細胞株としてヒポキサンチング
アニンホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損株を使用
した場合、例えば上述のＤＭＥＭやＩＭＤＭにヒポキサ
ンチン・アミノプテリン・チミジンを添加して調製した
ＨＡＴ培地の使用により行うことができる。

【００５７】（ｆ）の工程では、選択されたハイブリド
ーマ群を含む培養上清の一部をとり、例えば後述するＥ
ＬＩＳＡ法により、フサライドに対する抗体活性を測定
する。

【００５８】さらに、測定によりフサライドに反応する
抗体を産生することが判明したハイブリドーマの細胞ク
ローニングを行う。この細胞クローニング法としては、
限界希釈により１ウェルに１個のハイブリドーマが含ま
れるように希釈する方法「限界希釈法」；軟寒天培地上
に撒きコロニーをとる方法；マイクロマニピュレーター
によって１個の細胞を取り出す方法；セルソーターによ
って１個の細胞を分離する「ソータークローン法」等が
挙げられる。限界希釈法が簡単であり、よく用いられ
る。

【００５９】抗体価の認められたウェルについて、例え
ば限界希釈法によりクローニングを１−４回繰り返して
安定して抗体価の得られたものを、抗フサライドモノク
ローナル抗体産生ハイブリドーマ株として選択する。ハ
イブリドーマを培養する培地としては、例えば、ウシ胎
児血清（ＦＣＳ）を含むＤＭＥＭ又はＩＭＤＭ等が用い
られる。ハイブリドーマの培養は、例えば二酸化炭素濃
度５−７％程度及び３７℃（１００％湿度の恒温器中）
で培養するのが好ましい。

【００６０】（ｇ）の工程で抗体を調製するための大量
培養は、フォローファイバー型の培養装置等によって行
われる。又は、同系統のマウス（例えば、上述のＢａｌ
ｂ／ｃ）あるいはＮｕ／Ｎｕマウスの腹腔内でハイブリ
ドーマを増殖させ、腹水液より抗体を調製することも可
能である。

【００６１】これらにより得られた培養上清液あるいは
腹水液を抗フサライドモノクローナル抗体として使用す
ることできるが、さらに透析、硫酸アンモニウムによる
塩析、ゲル濾過、凍結乾燥等を行い、抗体画分を集め精
製することにより抗フサライドモノクローナル抗体を得
ることができる。さらに、精製が必要な場合には、イオ
ン交換カラムクロマトグラフィー、アフィニティークロ
マトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬ
Ｃ）などの慣用されている方法を組合わせることにより
実施できる。

【００６２】以上のようにして得られた抗フサライドモ
ノクローナル抗体は、例えばＥＬＩＳＡ法などの公知の
方法を使用して、サブクラス、抗体価等を決定すること
ができる。

【００６３】抗体によるフサライドの測定 本発明で使用する抗体によるフサライドの測定法として
は、放射性同位元素免疫測定法（ＲＩＡ法）、ＥＬＩＳ
Ａ法（Ｅｎｇｖａｌｌ，Ｅ．，Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ Ｅ
ｎｚｙｍｏｌ．，７０，４１９−４３９（１９８
０））、蛍光抗体法、プラーク法、スポット法、凝集
法、オクタロニー（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）等の一般
に抗原の検出に使用されている種々の方法（「ハイブリ
ドーマ法とモノクローナル抗体」、株式会社Ｒ＆Ｄプラ
ニング発行、第３０頁−第５３頁、昭和５７年３月５
日）が挙げられる。感度、簡便性等の観点からＥＬＩＳ
Ａ法が汎用されている。

【００６４】フサライドの測定は、各種ＥＬＩＳＡ法の
うち例えば間接競合ＥＬＩＳＡ法により、以下のような
手順により行うことができる。

【００６５】（ａ）まず、固相化用抗原であるフサライ
ドハプテンと高分子化合物との結合体を担体に固相化す
る。

【００６６】（ｂ）固相化用抗原が吸着していない固相
表面を抗原と無関係な物質、例えばタンパク質によりブ
ロッキングする。

【００６７】（ｃ）これに各種濃度のフサライドを含む
試料及び抗体を加え、該抗体を前記固相化抗原及びフサ
ライドに競合的に反応させて、固相化抗原−抗体複合体
及び、フサライド−抗体複合体を生成させる。

【００６８】（ｄ）固相化抗原−抗体複合体の量を測定
することにより、予め作成した検量線から試料中のフサ
ライドの量を決定することができる。

【００６９】（ａ）工程において、固相化用抗原を固相
化する担体としては、特別な制限はなく、ＥＬＩＳＡ法
において常用されるものをいずれも使用することができ
る。例えば、ポリスチレン製の９６ウェルのマイクロタ
イタープレートが挙げられる。

【００７０】固相化用抗原を担体に固相化させるには、
例えば、固相化用抗原を含む緩衝液を担体上に載せ、イ
ンキュベーションすればよい。緩衝液としては公知のも
のが使用でき、例えば、リン酸緩衝液を挙げることがで
きる。緩衝液中の抗原の濃度は広い範囲から選択できる
が、通常０．０１μｇ／ｍｌから１００μｇ／ｍｌ程
度、好ましくは０．０５μｇ／ｍｌから５μｇ／ｍｌが
適している。また、担体として９６ウェルのマイクロタ
イタープレートを使用する場合には、３００μｌ／ウェ
ル以下で２０μｌ／ウェルから１５０μｌ／ウェル程度
が望ましい。更に、インキュベーションの条件にも特に
制限はないが、通常４℃程度で一晩インキュベーション
が適している。

【００７１】なお、担体に固相化させる抗原としては、
抗体を作製したフサライドハプテンと高分子化合物との
結合体自体のみならず、式（１）で表される他のハプテ
ンと高分子化合物との結合体を固相化抗原として使用す
ることも可能である。例えば、式（１）においてｎが抗
体作製用と相違する化合物を、固相化抗原として使用す
ることもできる。さらに、式（１）に含まれない他のフ
サライドを固相化抗原として使用することも可能であ
る。

【００７２】（ｂ）工程のブロッキングは、抗原（フサ
ライドハプテンと高分子化合物との結合体）を固相化し
た担体において、フサライドハプテン部分以外に後で添
加する抗体が吸着され得る部分が存在する場合があり、
もっぱらそれを防ぐ目的で行われる。ブロッキング剤と
して、例えば、ＢＳＡやスキムミルク溶液を使用でき
る。あるいは、ブロックエース（「Ｂｌｏｃｋ‐Ａｃ
ｅ」、雪印乳業社製、コードＮｏ．ＵＫ−２５Ｂ）等の
ブロッキング剤として市販されているものを使用するこ
ともできる。具体的には、限定されるわけではないが、
例えば抗原を固相化した部分にブロッキング剤を含む緩
衝液［例えば、１％ＢＳＡと６０ｍＭ ＮａＣｌを添加
した８５ｍＭ ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）］を適量加
え、約４℃で、１時間ないし５時間インキュベーション
した後、洗浄液で洗浄することにより行われる。洗浄液
としては特に制限はないが、例えば、ＰＢＳを用いるこ
とができる。

【００７３】次いで（ｃ）工程において、フサライドを
含む試料と抗体を固相化抗原と接触させ、抗体を固相化
抗原及びフサライドと反応させることにより、固相化抗
原−抗体複合体及びフサライド−抗体複合体が生成す
る。

【００７４】この際、抗体としては、第一抗体として本
願発明のフサライドに対する抗体を加え、更に第二抗体
として標識酵素を結合した第一抗体に対する抗体を順次
加えて反応させる。

【００７５】第一抗体は緩衝液に溶解して添加する。限
定されるわけではないが、反応は、１０℃から４０℃、
好ましくは約２５℃で約１時間行えばよい。反応終了
後、緩衝液で担体を洗浄し、固相化抗原に結合しなかっ
た第一抗体を除去する。洗浄液としては、例えば、ＰＢ
Ｓを用いることができる。

【００７６】次いで第二抗体を添加する。例えば第一抗
体としてマウスモノクローナル抗体を用いる場合、酵素
（例えば、ペルオキシダーゼ又はアルカリホスファター
ゼ等）を結合したマウス抗体に対する抗体を用いるのが
適当である。担体に結合した第一抗体に好ましくは最終
吸光度が４以下、より好ましくは０．５−３．０となる
ように希釈した第二抗体を反応させるのが望ましい。希
釈には緩衝液を用いる。限定されるわけではないが、反
応は室温で約１時間行い、反応後、緩衝液で洗浄する。
以上の反応により、第二抗体が第一抗体に結合する。ま
た、標識した第一抗体を用いてもよく、その場合、第二
抗体は不要である。

【００７７】次いで（ｄ）工程において担体に結合した
第二抗体の標識物質と反応する発色基質溶液を加え、吸
光度を測定することによって検量線からフサライドの量
を算出することができる。

【００７８】第二抗体に結合する酵素としてペルオキシ
ダーゼを使用する場合には、例えば、過酸化水素、並び
に３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン又はｏ
−フェニレンジアミン（以下、「ＯＰＤ」と言う）を含
む発色基質溶液を使用することができる。限定されるわ
けではないが、発色基質溶液を加え室温で約１０分間反
応させた後、１Ｎの硫酸を加えることにより酵素反応を
停止させる。３，３’，５，５’−テトラメチルベンジ
ジンを使用する場合、４５０ｎｍの吸光度を測定する。
ＯＰＤを使用する場合、４９２ｎｍの吸光度を測定す
る。一方、第二抗体に結合する酵素としてアルカリホス
ファターゼを使用する場合には、例えばｐ−ニトロフェ
ニルリン酸を基質として発色させ、２ＮのＮａＯＨ溶液
を加えて酵素反応を止め、４１５ｎｍでの吸光度を測定
する方法が適している。

【００７９】フサライドを添加しない反応溶液の吸光度
に対して、それらを添加して抗体と反応させた溶液の吸
光度の減少率を阻害率として計算する。既知の濃度のフ
サライドを添加した反応液の阻害率により予め作成して
おいた検量線を用いて、試料中のフサライドの濃度を算
出できる。

【００８０】あるいはフサライドの測定は、例えば以下
に述べるような本発明のモノクローナル抗体を用いた直
接競合ＥＬＩＳＡ法によって行うこともできる。

【００８１】（ａ）まず、本発明のモノクローナル抗体
を、担体に固相化する。 （ｂ）抗体が固相化されていない担体表面を抗原と無関
係な物質、例えばタンパク質により、ブロッキングす
る。

【００８２】（ｃ）上記工程とは別に、各種濃度のフサ
ライドを含む試料に、フサライドハプテンと酵素を結合
させた酵素結合ハプテンを加えた混合物を調製する。

【００８３】（ｄ）上記混合物を上記抗体固相化担体と
反応させる。 （ｅ）固相化抗体−酵素結合ハプテン複合体の量を測定
することにより、あらかじめ作成した検量線から試料中
のフサライドの量を決定する。

【００８４】（ａ）工程においてモノクローナル抗体を
固相化する担体としては、特別な制限はなくＥＬＩＳＡ
法において常用されるものを用いることができ、例えば
９６ウェルのマイクロタイタープレートが挙げられる。
モノクローナル抗体の固相化は、例えばモノクローナル
抗体を含む緩衝液を担体上にのせ、インキュベートする
ことによって行える。緩衝液の組成・濃度は前述の間接
競合ＥＬＩＳＡ法と同様のものを採用できる。

【００８５】（ｂ）工程のブロッキングは、抗体を固相
化した担体において、後に添加する試料中のフサライド
並びに酵素結合ハプテンが、抗原抗体反応とは無関係に
吸着される部分が存在する場合があるので、それを防ぐ
目的で行う。ブロッキング剤及びその方法は、前述の間
接競合ＥＬＩＳＡ法と同様のものを使用できる。

【００８６】（ｃ）工程において用いる酵素結合ハプテ
ンの調製は、フサライドハプテンを酵素に結合する方法
であれば特に制限なく、いかなる方法で行ってもよい。
例えば、前述した活性化エステル法を採用することがで
きる。調製した酵素結合ハプテンは、フサライドを含む
試料と混合する。

【００８７】なお、酵素等の標識物質に結合させるハプ
テンとしては、間接競合ＥＬＩＳＡ法における固相化抗
原の場合と同様に、抗体作製に使用したフサライドハプ
テン自体のみならず、式（１）で表される他のハプテン
と高分子化合物との結合体を標識用抗原として使用する
ことも可能である。例えば、式（１）においてｎが抗体
作製用と相違する化合物を、標識用抗原として使用する
こともできる。さらに、式（１）に含まれない他のフサ
ライドも、標識用抗原として使用可能である。

【００８８】（ｄ）工程においてフサライドを含む試料
及び酵素結合ハプテンを抗体固相化担体に接触させ、フ
サライドと酵素結合ハプテンとの競合阻害反応により、
これらと固相化抗体との複合体が生成する。フサライド
を含む試料は適当な緩衝液で希釈して使用する。限定さ
れるわけではないが、反応は例えば、室温でおよそ１時
間行う。反応終了後、緩衝液で担体を洗浄し、固相化抗
体と結合しなかった酵素結合ハプテンを除去する。洗浄
液は例えばＰＢＳを使用することができる。

【００８９】さらに、（ｅ）工程において酵素結合ハプ
テンの酵素に反応する発色基質溶液を前述の間接競合Ｅ
ＬＩＳＡ法と同様に加え、吸光度を測定することにより
検量線からフサライドの量を算出することができる。

【００９０】本発明のモノクロ−ナル抗体ＦＬＤ１Ｆ９
は、直接競合ＥＬＩＳＡ法で約０．５ｎｇ／ｍｌないし
約１０００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは約１．０ｎｇ／ｍｌ
ないし約１００ｎｇ／ｍｌの濃度範囲でフサライドと反
応する。さらに、約１．０ｎｇ／ｍｌないし約１０００
ｎｇ／ｍｌ、好ましくは約１．０ｎｇ／ｍｌないし約１
００ｎｇ／ｍｌの濃度範囲でクロロタロニルとも反応す
る。（実施例８、図１）。

【００９１】さらに前述したように直接競合ＥＬＩＳＡ
法において抗体作製用と異なるハプテンを標識用抗原と
して使用でき、その組み合わせによって直接競合ＥＬＩ
ＳＡ法において固有の反応性を示す。

【００９２】本発明の抗体の交差反応性 上述した直接競合ＥＬＩＳＡ法又は間接競合ＥＬＩＳＡ
法により、本発明のモノクローナル抗体の交差反応性を
調べることができる。

【００９３】例えば、モノクローナル抗体ＦＬＤ１Ｆ９
は他のフサライド類似化合物のクロロタロニルに約２７
％の交差反応性を有し、他のキントゼン、ＣＮＰには反
応性を示さない。よって、フサライド並びにクロロタロ
ニルに対して高い特異性を有する。（実施例９、図
２）。

【００９４】以下、実施例によって本発明を具体的に説
明するが、これらは本発明の技術的範囲を制限するため
のものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容
易に本発明に修飾、変更を加えることができ、それらは
本発明の技術的範囲に含まれる。

【００９５】

【実施例】実施例１ フサライドハプテンの合成

【００９６】

【化８】

【００９７】６−（３、４、５、６−テトラクロロフタ
ールイミド）ヘキサン酸（２）の合成 無水テトラクロロフタール酸（１）１．４ｇ（５．０ｍ
ｍｏｌ）と６−アミノヘキサン酸０．７２ｇ（５．５ｍ
ｍｏｌ）の混合物を７０℃で３時間撹拌した。反応混合
物を加温下で３０ｍｌの酢酸に溶かし、濾過した。濾液
を室温まで冷やし、析出した固体を濾取した。固体をエ
タノールで再結晶化し１．１ｇ（収率５５％）の目的化
合物（２）を得た。融点：２４１−２４２℃上記フサラ
イドハプテン（２）の¹Ｈ−ＮＭＲによる物性データ
（ケミカルシフトδ）を以下に示す。

【００９８】

【表１】¹ Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−Ｄ₆，４００ＭＨｚ）δ １．２９（２Ｈ，ｍ，ＣＨ₃）， １．５５（４Ｈ，
ｍ，２ＣＨ₂），２．１９（２Ｈ，ｔ，ＣＨ₂）， ３．
５５（２Ｈ，ｔ，ＣＨ₂），１１．９９（１Ｈ，ｓ，Ｃ
ＯＯＨ）実施例２ 免疫用抗原の作製 免疫用抗原としてフサライドハプテンとＫＬＨとの結合
体を以下のように混合酸無水物法を用いて作製した。

【００９９】実施例１で作製したフサライドハプテンの
７ｍｇを無水ジオキサン０．７ｍｌに溶解し、１０℃な
いし１２℃に冷却した後、トリ−Ｎ−ブチルアミン４μ
ｌおよびクロロ蟻酸イソブチル２４μｌを添加し、１０
〜１２℃にて３０分間撹拌した（以下これを「Ａ液」と
いう）。

【０１００】一方、蒸留水１ｍｌにＫＬＨを２０ｍｇ溶
解し、０．５％ ＮａＨＣＯ₃ ｐＨ９．４を外液とし
て一晩透析した。透析後３０００ｒｐｍ、３０分間遠心
し得られた上清１．５ｍｌにＡ液をゆっくり添加した。
４℃にて２時間反応させた後、スパーテル１杯のグリシ
ンを添加してさらに４℃にて３０分間撹拌することによ
り反応を終了させた。この反応液を１４５ｍＭ ＮａＣ
ｌ−１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で１週間透析
し、フサライドハプテンとＫＬＨとの結合体（以下、
「フサライドハプテン／ＫＬＨ」と言う）を調製した。
以下、免疫用抗原として用いた。

【０１０１】実施例３ スクリーニング用抗原の作製 実施例２と同様の方法を用いて、フサライドハプテンと
ＢＳＡとの結合体（以下、「フサライド／ＢＳＡ」と言
う）を作製し、スクリーニング用抗原として用いた。

【０１０２】実施例４ 免疫感作 免疫にはＢａｌｂ／ｃマウスを用いた。実施例２で作製
したフサライド／ＫＬＨ（免疫用抗原）１００μｇをＰ
ＢＳ１００μｌに溶解し、等量のフロイント完全アジュ
バントと混合した後、Ｂａｌｂ／ｃマウスに接種した。
初回免疫後１４日目、３１日目、５８日目、７９日目に
フロイント不完全アジュバントを用いて前記と同様の操
作により調製した免疫用抗原を、マウスに追加免疫し
た。また、１１５日後にはＰＢＳに溶解した免疫抗原を
マウスに追加免疫した。１２２日後に免疫したマウスの
尾静脈より採血を行い、血清を分離しこれを抗血清とし
た。

【０１０３】実施例５ 抗血清のフサライドに対する反
応性 実施例３で調製したスクリーニング用抗原（フサライド
ハプテン／ＢＳＡ）を用い、間接競合ＥＬＩＳＡ法によ
り、実施例４で調製した抗血清のフサライドに対する反
応性を調べた。

【０１０４】まず、実施例３で調製したフサライドハプ
テン／ＢＳＡのＰＢＳ溶液（５μｇ／ｍｌ）を１００μ
ｌ／ウェルにて９６ウェルプレートにコーティングした
（０．５μｇ／１００μｌ／ウェル）。ＰＢＳで洗浄の
後、４倍に希釈したブロックエース（「Ｂｌｏｃｋ Ａ
ｃｅ」：大日本製薬、コードＮｏ．ＵＫ−２５Ｂ）でブ
ロッキングした後、抗血清の１０００倍希釈液と各種濃
度のフサライドあるいはその類似化合物を含む１０％メ
タノ−ル溶液とを等量混合し、その１００μｌをウェル
に入れ、３７℃にて１時間反応させた。

【０１０５】反応終了後、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０
−ＰＢＳにて１回洗浄の後、ＰＢＳを用いて５０００倍
希釈したペルオキシダ−ゼ結合抗マウスＩｇＧヤギ抗体
（Ｃａｐｐｅｌ社製）を１００μｌずつ各ウェルに添加
し、３７℃にて１時間反応させた。

【０１０６】さらに反応終了後、０．０５％ Ｔｗｅｅ
ｎ２０−ＰＢＳにて２回洗浄し、０．４ｍｇ／ｍｌのＯ
ＰＤ及び０．０４％の過酸化水素を含む０．０５Ｍリン
酸クエン酸緩衝液（ｐＨ４．５）を１００μｌずつ各ウ
ェルにいれ、室温にて２０分間放置し発色させた。反応
後、２Ｎ硫酸１００μｌを各ウェルに加え、反応を停止
させた後、４９０ｎｍの吸光度を測定した。

【０１０７】実施例６ ハイブリド−マの作製 実施例５で抗血清の力価を測定したマウスについて、モ
ノクローナル抗体の作製を行った。

【０１０８】先ず、実施例４に続き、血清中の抗フサラ
イド抗体の活性が高くなったマウスの脾臓細胞と、マウ
スミエロ−マ細胞（Ｐ３Ｕ１）とを電気融合法にて細胞
融合をおこなった。細胞増殖が認められた培養上清液に
ついて以下の方法でフサライドに対する抗体活性を調べ
た。

【０１０９】フサライドハプテン／ＢＳＡの溶液（５μ
ｇ／ｍｌ）を５０μｌ／ウェルにて９６ウェルプレート
にコーティングした。洗浄の後、４倍に希釈したブロッ
クエースでブロッキングした後、培養上清液と各種濃度
のフサライドあるいはその類似化合物を含む１０％メタ
ノ−ル溶液とを等量混合し、その１００μｌをウェルに
入れ、３７℃にて１時間反応させた。反応終了後、０．
０５％ Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳにて１回洗浄の後、Ｐ
ＢＳを用いて、５０００倍希釈したペルオキシダ−ゼ結
合抗マウスＩｇＧヤギ抗体（Ｃａｐｐｅｌ社製）を５０
μｌずつ各ウェルに入れて３７℃で１時間反応させた。

【０１１０】さらに反応終了後、０．０５％ Ｔｗｅｅ
ｎ２０−ＰＢＳにて２回洗浄の後、０．４ｍｇ／ｍｌの
ＯＰＤ及び０．０４％の過酸化水素を含む０．０５Ｍリ
ン酸クエン酸緩衝液（ｐＨ４．５）を１００μｌずつ各
ウェルにいれ、室温にて２０分間放置し発色させた。反
応後、２Ｎ硫酸１００μｌを各ウェルに加え、発色反応
を停止させた後、４９０ｎｍの吸光度を測定し、特異性
のある抗体活性が認められたものを選抜した。

【０１１１】次に、選抜されたウェルの細胞について限
界希釈法を用いた細胞クロ−ニングをおこなった。その
結果、抗フサライド抗体を産生するハイブリド−マを数
株クロ−ン化した。そのうちのＦＬＤ１Ｆ９を平成１２
年２月２２日に寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１７７４０とし
て工業技術院生命工学工業研究所（〒３０５−００４６
茨城県つくば市東１丁目１番３号）に寄託した。

【０１１２】実施例７ フサライドハプテンとＨＲＰと
の結合体の作製 実施例２と同様に混合無水物法により、フサライドハプ
テンとＨＲＰの結合体を作製した。

【０１１３】１ｍｇのフサライドハプテンを無水ジオキ
サン０．２ｍｌに溶解した後、トリ−Ｎ−ブチルアミン
０．５μｌ、クロロ蟻酸イソブチル０．３μｌを添加
し、１０−１２℃にて３０分間撹拌した。（以下、これ
を「Ｂ液」とする） 一方、０．５％ＮａＨＣＯ₃をＮａＯＨでｐＨ９．４に
調整した溶液１ｍｌにＨＲＰ５ｍｇを溶解し、Ｂ液をこ
の中に滴下した。４℃にて２時間撹拌し、さらにグリシ
ンを添加して３０分間撹拌することにより反応を終了さ
せた。反応物をＰＢＳにて透析することにより、ＨＲＰ
結合フサライドハプテンを得た。

【０１１４】実施例８ 直接競合ＥＬＩＳＡ法によるフ
サライドの測定 実施例６で得られたハイブリド−マ（ＦＬＤ１Ｆ９）を
マウスの腹腔に移植し、１０日後ないし１５日後に得ら
れた腹水を採取し、硫安分画法によりモノクロ−ナル抗
体を分取した。（以後、各モノクローナル抗体はこれら
を産生するモノクローナル抗体産生細胞と同一の名称を
用いる。）得られた精製モノクローナル抗体ＦＬＤ１Ｆ
を用いて以下の方法にてフサライドを測定した。

【０１１５】上記ＦＬＤ１Ｆ９モノクロ−ナル抗体溶液
（２μｇ／ｍｌ）を１００μｌ／ウェルで９６ウェルプ
レ−トに加え、４℃で一晩静置し、翌日４倍希釈したブ
ロックエ−スでブロッキング行い、アッセイ用のプレー
トを作成した。次いで、フサライド及び実施例７で作製
した適度に希釈されたＨＲＰ結合フサライドハプテンを
含む１０％メタノ−ル−ＰＢＳ溶液を５０μｌ／ウェル
で加え、３７℃で１時間静置した。

【０１１６】反応終了後、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０
−ＰＢＳにて２回洗浄の後、０．４ｍｇ／ｍｌのＯＰＤ
及び０．０４％過酸化水素を含む０．０５Ｍリン酸クエ
ン酸緩衝液（ｐＨ４．５）を１００μｌずつ各ウェルに
いれ室温にて２０分間放置し、発色させた。

【０１１７】反応後、２Ｎ硫酸１００μｌを各ウェルに
加え、反応を停止させた後、４９０ｎｍの吸光度を測定
した。結果を図１に示す。直接競合ＥＬＩＳＡ法におい
て、フサライドを０．５ｎｇ／ｍｌないし１０００ｎｇ
／ｍｌの範囲で測定できた。

【０１１８】実施例９ モノクロ−ナル抗体の交差反応
性 フサライドハプテンに由来する、クロ−ン化したハイブ
リド−マＦＬＤ１Ｆ９の産生するモノクロ−ナル抗体Ｆ
ＬＤ１Ｆ９について実施例８と同様の方法を用いてフサ
ライドおよび他のチアゾール環を有する類似化合物に対
する交差反応性を調べた。結果を図２に示す。モノクロ
ーナル抗体ＦＬＤ１Ｆ９は類似化合物のクロロタロニル
に約２７％の交差反応性を有し、他のキントゼン、ＣＮ
Ｐに反応性を示さず、フサライド並びにクロロタロニル
に対して高い特異性を有する。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、本発明のモノクロ−ナル抗体ＦＬＤ１
Ｆ９の直接競合ＥＬＩＳＡ法によるフサライドの測定を
示す。

【図２】図２はモノクロ−ナル抗体ＦＬＤ１Ｆ９を用い
た直接競合ＥＬＩＳＡ法によるフサライドおよび他の類
似化合物の測定を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/531 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 33/577 15/00 Ｃ (72)発明者 渡辺 和明 東京都港区浜松町１丁目27番14号 株式会 社環境免疫技術研究所内 (72)発明者 香川 康浩 東京都港区浜松町１丁目27番14号 株式会 社環境免疫技術研究所内 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA53 GA01 HA15 4B064 AG27 CA10 CA19 CC24 DA13 4B065 AA91X AB05 AC14 BA08 CA25 CA46 4H045 AA11 BA10 CA40 DA76 EA50 FA72 FA74

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】以下の式（１）： 【化１】 ［式（１）中、ｎは、１−１０の整数である］で表され
   る構造を有する化合物と高分子化合物を結合させること
   により抗原を作製し、当該抗原を用いることにより、以
   下の式（２）： 【化２】 で表される構造を有する化合物に反応性を示す抗体を製
   造することを特徴とする、式（２）で表される構造を有
   する化合物に反応性を示す抗体又はそのフラグメントの
   製造方法。
2. 【請求項２】請求項１に記載の方法により製造された、
   式（２）で表される構造を有する化合物に反応性を示す
   抗体又はそのフラグメント。
3. 【請求項３】モノクローナル抗体である、請求項２に記
   載の抗体又はフラグメント。
4. 【請求項４】寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１７７４０で寄託
   されているハイブリドーマによって産生されるモノクロ
   ーナル抗体ＦＬＤ１Ｆ９である、請求項２若しくは３に
   記載の抗体又はフラグメント。
5. 【請求項５】請求項２ないし４のいずれか１項に記載の
   抗体又はフラグメントを産生するハイブリドーマ。
6. 【請求項６】寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１７７４０で寄託
   されている、請求項５に記載のハイブリドーマ。
7. 【請求項７】請求項２ないし４のいずれか１項に記載の
   抗体又はフラグメントを用いることを特徴とする、式
   （２）で表される構造を有する化合物の免疫化学的測定
   方法。
8. 【請求項８】さらに、請求項１において式（１）で表さ
   れる構造を有する化合物、および／又は、請求項１にお
   いて式（１）で表される化合物と高分子化合物若しくは
   標識物質との結合体を用いることを含む、請求項７に記
   載の免疫化学的測定方法。