JP3015306B2 - 酸アミド系化合物のハプテン化合物、抗体および測定方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、酸アミド系化合
物、特にベンズアニリド系化合物のハプテン化合物、抗
原、抗体に関する。

【０００２】本発明はさらに、前記抗原または抗体を用
いた免疫化学的測定方法に関する。

【０００３】

【従来の技術】酸アミド系化合物は殺菌剤として広く使
用されており、そのうち、カルボキシン、オキシカルボ
キシン、メプロニル、フルトラニルはミトコンドリア内
の呼吸に関与している電子伝達系に作用し、その呼吸阻
害作用は高い選択性を有し、担子菌及び近縁の不完全菌
のみに活性を示す。また、担子菌以外の菌類に効果のあ
るものとして例えば白葉枯病に効果のあるテクロフタラ
ムが開発されている。

【０００４】それらの酸アミド系化合物は、以下の式
（３）：

【化５】 ［式中、Ｒ₁は、１ないし３不飽和で５または６員の、
炭素環あるいは１または２個のＮ、Ｏ、ＳもしくはＳＯ
₂を含む複素環であって、前記炭素環および複素環は所
望により１ないし４個の低級アルキル基、ハロゲン原
子、トリフルオロメチル基、ヒドロキシ基またはカルボ
キシル基で置換されていてもよく；そしてＲ₂は、ベン
ゼン環またはシクロヘキサン環であって、前記ベンゼン
環は所望により１個ないし３個の、低級アルキル基、塩
素、フッ素等のハロゲン原子、トリフルオロメチル基等
のハロゲン化アルキル基、アルコキシ基またはハロゲン
化アルコキシ基で置換されていてもよく、あるいは前記
ベンゼン環のとなり合う２個の炭素は、間にＯを含んで
もよい炭素数２ないし４個のメチレン基で架橋されてい
てもよく、当該メチレン基は１ないし３個のメチル基で
置換されていてもよい］で表される一群の化合物であ
る。

【０００５】酸アミド系化合物の代表的なものとして、
３'−イソプロポキシ−２−メチルベンズアニリド［式
（３）中、Ｒ₁は２位がメチル基で置換されたベンゼン
環であり、Ｒ₂は３位がイソプロポキシ基で置換された
ベンゼン環である］、並びにα,α,α−トリフルオロ−
３'−イソプロポキシ−ｏ−トルアニリド［式（３）
中、Ｒ₁は２位がトリフルオロメチル基で置換されたベ
ンゼン環であり、Ｒ₂は３位がイソプロポキシ基で置換
されたベンゼン環である］がある。

【０００６】３'−イソプロポキシ−２−メチルベンズ
アニリドは一般名をメプロニルといい、リゾトニア菌な
どの担子菌に属する病原菌に特異的に高い抗菌活性を有
し、イネ紋枯病、ムギ、シバのさび病、雪腐菌核病、ジ
ャガイモの黒あざ病、ナシやリンゴの赤星病、野菜の苗
立枯病などの防除に用いられる。予防効果と治療効果を
合わせ持ち、水溶性が小さいために雨露による流亡が少
なく、効果の持続性、安定性に優れている。

【０００７】α,α,α−トリフルオロ−３'−イソプロ
ポキシ−ｏ−トルアニリドは一般名をフルトラニルとい
い、イネ紋枯病に対して予防効果および治療効果を有す
る。また、浸透移行性があるので、根あるいは葉髄下部
に処理した薬剤が吸収され上部へと移行し、安定した効
果が得られる。リゾトニア菌、さび病菌などの担子菌類
によって起こる諸病害に有効である。（農薬ハンドブッ
ク １９９４年版 日本植物防疫協会； 最新農薬の残
留分析法 農薬残留分析法研究班編集 中央法規出版）

【０００８】近年、土壌、水、大気等の環境中での残留
農薬や、最近特に増加してきた輸入農産物のポストハー
ベスト農薬等の残留に大きな社会的関心が寄せられてい
る。例えば、メプロニルについても以下のように食品に
残留する基準値が定められている：穀類（２ｐｐｍ）、
果実類（２−５ｐｐｍ）、野菜類（１−５ｐｐｍ）、種
実類（２ｐｐｍ）（最新農薬の残留分析法 前出）。環
境や食品に関する安全確保のためには、これらに含有さ
れる酸アミド系化合物の量を迅速、かつ正確に測定する
ことが必要である。

【０００９】従来酸アミド系化合物は、主に穀類、果実
等の試料から農薬を抽出し、精製後、ガスクロマトグラ
フィー（ＧＣ）や高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬ
Ｃ）により分析されている。例えばメプロニルおよびフ
ルトラニルの場合、試料をアセトンで抽出し、転溶した
後、フロリジルカラムクロマトグラフィー（ＣＣ）で溶
出し、さらにＧＣで測定する方法が採用されている（最
新農薬の残留分析法農薬残留分析法研究班編集 中央法
規出版）。これらの方法は、試料の調製が煩雑で多大の
手間と時間を必要とし、分析に熟練を有すること、並び
に、測定装置や設備等に高額の費用を必要とする等の問
題点がある。酸アミド系化合物の測定は、特に輸入農産
物等の残留農薬の分析では測定試料が多大で、短時間内
に結果をだす必要があり、精度面以外にも、簡便性、迅
速性及び経済性を具備した新しい測定法が要求されてい
る。

【００１０】免疫化学測定法は、抗体が抗原を特異的に
認識する、抗原−抗体反応に基づいて抗原の検出を行う
方法であり、その優れた精度、簡便性、迅速性、経済性
から近年注目を集めている。免疫化学測定法においては
検出方法として非常に多種の標識、例えば、酵素、放射
性トレーサー、化学発光性および蛍光性標識、金属原子
およびゾル、安定遊離基、ラテックスならびにバクテリ
オファージが適用されてきた。

【００１１】免疫化学測定法の内でも、酵素を使用する
酵素免疫測定法（ＥＩＡ）は特に優れたものとして広く
使用されるに至った。酵素免疫測定法についての優れた
論評が、Tijssen P, "Practice and theory of enzyme
immunoassays" in Laboratory techniques in biochemi
stry and molecular biology, Elsevier Amsterdam New
York, Oxford ISBN 0-7204-4200-1 (1990) により提供
されている。

【００１２】一般に、大きい抗原分子および生物学的有
機分子については、それ以上修飾することなく動物に接
種することにより、適当な免疫反応を惹起し、抗原を認
識する抗体を産生させることができる。しかし、酸アミ
ド系化合物のような小さい分子は通常動物に接種したと
き免疫応答を引き出すことができない。これら分子はよ
り大きい分子（高分子化合物）に結合させることによっ
て初めて一団のエピトープとして行動し、Ｔ細胞受容体
の存在下で免疫応答を起こし、その結果、１群のＢリン
パ球により抗体を産生させる。このように高分子化合物
と結合させて初めて免疫原性を生じる分子を総称して
「ハプテン」という。

【００１３】しかし、小分子を高分子化合物と結合させ
たものを抗原としても、得られた抗体は望む分子を認識
しないか、あるいはごく低い親和性しかもたない場合が
しばしばある。そのため、一般に小さい分子そのもので
はなく、結合に利用できる官能基と共にスペーサーアー
ム（結合手）を導入したものをハプテンとして使用する
必要がある。しかしその場合に、結合手／官能基の配
置、結合手の大きさ等の全ての問題を考慮して導入が適
切に行われたものを使用しないと、好ましい抗体は得ら
れない。適切な導入は個々の分子に応じて工夫しなけら
ばならない。酸アミド系化合物についてはその必要性が
非常に高かったにもかかわらず、適切な抗体はもとよ
り、抗体を作成するためのハプテンも、本発明前には得
られていなかった。

【００１４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、酸アミド系
化合物、特にベンズアニリド系化合物に反応する新規な
抗体を作製するための抗原を構成する、ハプテン化合物
を提供することを目的とする。

【００１５】本発明は、また、抗原となる前記ハプテン
と高分子化合物との結合体を提供することを目的とす
る。

【００１６】本発明は、さらに、酸アミド系化合物に反
応する新規な抗体およびその製造方法を提供することを
目的とする。

【００１７】本発明はその一態様において、特定のベン
ズアニリド系化合物、例えばフルトラニルに対する特異
性が極めて高く、他のベンズアニリド系化合物との交差
反応性が低いという特徴を有する、モノクローナル抗体
を提供する。

【００１８】本発明はその一態様において、数種類の酸
アミド系化合物と反応するという特徴を有する、モノク
ローナル抗体を提供する。

【００１９】本発明は、さらにまた、前記抗体を産生す
るハイブリドーマを提供することを目的とする。

【００２０】本発明は、さらに、前記ハプテン化合物ま
たは抗体を使用することを含む、酸アミド系化合物また
はその誘導体の免疫化学的測定法を提供することを目的
とする。

【００２１】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、鋭意研究
を重ねた結果、酸アミド系化合物のアミド結合部分また
はベンゼン環部分を修飾してスペーサーを導入し、当該
スペーサーにさらに適当な高分子化合物を結合させたも
のが抗原として利用できることを発見した。このような
抗原を用いて得られた抗体は、高分子化合物およびスペ
ーサー部分とは無関係に、抗原中の酸アミド系化合物に
由来する部分を特異的に認識することができる。

【００２２】具体的には、酸アミド系化合物中の

【化６】 ［Ｒ²は、下記一般式（１）または（２）において定義
する通りである］で表される構造部分にスペーサーを導
入して

【化７】 ［Ｒ₂，Ｒ₃およびＡは下記一般式（１）または（２）に
おいて定義する通りである］に変化させた、酸アミド系
化合物誘導体をハプテンとして使用することにより、酸
アミド系化合物に特異的な抗体を得られる。

【００２３】すなわち本発明のハプテン化合物は、以下
の式（１）または（２）：

【化８】 ［式中、Ｒ₁は、１ないし３不飽和で５または６員の、
炭素環あるいは１または２個のＮ、Ｏ、ＳもしくはＳＯ
₂を含む複素環であって、前記炭素環および複素環は所
望により１ないし４個の、炭素数１−４、好ましくは１
−２の低級アルキル基、ハロゲン原子（本明細書中、ハ
ロゲン原子はＦ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩを意味する）、ト
リフルオロメチル基、ヒドロキシ基またはカルボキシル
基で置換されていてもよく；Ｒ₂は、ベンゼン環または
シクロヘキサン環であって、前記ベンゼン環は所望によ
り１個ないし３個の、低級アルキル基、ハロゲン原子、
ハロゲン化アルキル基、アルコキシ基またはハロゲン化
アルコキシ基で置換されていてもよく、あるいは前記ベ
ンゼン環のとなり合う２個の炭素は、間にＯを含んでも
よい炭素数２ないし４個のメチレン基で架橋されていて
もよく、当該メチレン基は１ないし３個のメチル基で置
換されていてもよく；Ｒ₃は、水素原子、ヒドロキシ基
またはハロゲン原子であり；そしてＡは、−ＣＨ（ＣＨ
₃）−を除く、所望により枝分かれしてもよい炭素数１
−１０、好ましくは２−５のアルキレン基である］で表
される構造を有する酸アミド系化合物誘導体である。

【００２４】上記式（１）または（２）中において、Ｒ
₁およびＲ₂は好ましくは以下の基：

【化９】 からなるグループから選択される。より好ましくは、Ｒ
₁およびＲ₂は、所望により置換されていてもよいベンゼ
ン環である。

【００２５】本発明のハプテン化合物は、特に好ましく
は、メプロニルまたはフルトラニルの誘導体、即ち、式
（１）または（２）において、Ｒ₁ は２位がメチル基、
トリフルオロメチル基または塩素原子で置換されたベン
ゼン環であり、Ｒ₂ は３位がイソプロポキシ基で置換さ
れたベンゼン環であり、Ｒ₃ はヒドロキシ基である化合
物である。

【００２６】本発明の酸アミド系化合物誘導体をハプテ
ンとして適当な高分子化合物と結合させたものを抗原と
して用いることによって、酸アミド系化合物に特異的な
抗体を得ることができる。

【００２７】本発明は、前記ハプテン化合物、ハプテン
化合物と高分子化合物との結合体、酸アミド系化合物に
反応する抗体およびその製造方法、ならびに該ハプテン
化合物または該抗体を用いる酸アミド系化合物の免疫化
学的測定法に関する。

【００２８】酸アミド系化合物誘導体の作製 一般式（１）または（２）の酸アミド系化合物誘導体
は、公知の方法に従って製造することができる。

【００２９】Ａ．一般式（１）の化合物は、例えば、一
般式（４）：

【化１０】 ［式中、Ｒ₄はカルボキシル保護基を示す；Ｒ₁、Ｒ₂、
およびＡは式（１）および（２）で定義した通りであ
る］で表されるエステル化合物から、Ｒ₄で示されるカ
ルボキシル保護基を除去することにより製造できる。

【００３０】上記一般式（４）中、Ｒ₄で示されるカル
ボキシル保護基は公知のものでよく、その具体例とし
て、例えばメチル基、エチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、
ベンジル基、ｐ−メトキシベンジル基、トリクロロエチ
ル基、トリメチルシリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジメチル
シリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル基、トリ
エチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、トリメチ
ルシリルエトキシメチル基等を挙げることができる。

【００３１】Ｒ₄で示されるカルボキシル保護基の除去
は、アルカリ加水分解、酸加水分解等の公知の方法で行
うことができる。

【００３２】すなわち、アルカリ加水分解の場合は、一
般式（４）のエステル化合物を、好ましくはメタノー
ル、エタノール、テトラヒドロフラン、エチレングリコ
ール等の有機溶媒に溶解し、次いで水酸化ナトリウムま
たは水酸化カリウム水溶液を加えて、０℃から溶媒の沸
点の温度、好ましくは室温から５０℃で、１−２時間撹
拌反応させることにより一般式（１）の力ルボン酸化合
物を得ることができる。

【００３３】また酸加水分解の場合は、一般式（４）の
エステル化合物を、好ましくは酢酸、蟻酸、ベンゼン、
ジクロロメタン、１,２−ジクロロエタン等の有機溶媒
に溶解し、次いで塩酸、硫酸、三塩化ホウ素、トリフル
オロ酢酸、ｐ−トルエンスルホン酸等を加えて、０℃か
ら溶媒の沸点の温度、好ましくは室温から５０℃で、1
−５時間撹拌反応させることにより一般式（１）のカル
ボン酸化合物を得ることができる。

【００３４】更に、ベンジル基の除去は水素による接触
還元反応によっても行うことができる。

【００３５】一般式（４）のエステル化合物は、種々の
方法によって合成することができる。例えば、一般式
（５）： Ｙ−Ａ−ＣＯＯＲ₄ （５） ［式中、Ｙはハロゲン原子であり、Ａ，Ｒ⁴は上記に同
じ］で表されるハロゲン化エステル化合物と、上述した
一般式（３）で表される酸アミド系化合物をベンゼン、
トルエン、キシレン、ジクロロメタン、クロロホルム、
四塩化炭素、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、
ジオキサン、アセトン、メチルエチルケトン、アセトニ
トリル、酢酸エチル、ジメチルホルムアミド、ジメチル
スルホキシド等の不活性溶媒中、水素化ナトリウム、ナ
トリウムメチラート、ナトリウムエチラート等の塩基の
存在下、０℃から溶媒の沸点の温度、好ましくは室温か
ら５０℃で、１−５時間撹拌反応させることにより一般
式（４）のエステル化合物を得ることができる。

【００３６】Ｂ．式（２）の化合物も、式（１）の化合
物の場合と同様に、例えば、一般式（６）：

【化１１】 ［式中、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₄およびＡは上記定義した通りで
ある］で表されるエステル化合物からＲ₄で表されるカ
ルボキシル保護基を除去することによって合成できる。

【００３７】式（６）のエステル化合物は、例えば以下
の（イ）または（ロ）の方法によって合成できる。

【００３８】（イ）先ず、ニトロフェノールに、一般式
（７）： Ｙ−Ｂ−ＣＯＯＲ₄ （７） ［式中、Ｂは、Ｙからβ位置の炭素が不飽和の、所望に
より枝別れしていてもよい炭素数２−１０、好ましくは
３−５のアルケンであり；ＹおよびＲ₄は上記に定義し
た通りである］で表される化合物を塩基の存在下に反応
させることにより、一般式（８）：

【化１２】 ［式中、ＢおよびＲ₄は上記定義した通りである］の化
合物を製造することができる。溶媒としては、メタノー
ル、エタノール、ベンゼン、トルエン、キシレン、ジク
ロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、ジエチルエー
テル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、アセトン、メ
チルエチルケトン、アセトニトリル、酢酸エチル、ジメ
チルホルムアミド、ジメチルスルホキシドおよび水等
が、塩基としては、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、水
酸化ナトリウム、水酸化カリウム、ナトリウムメチラー
ト、ナトリウムエチラート、トリエチルアミン等が挙げ
られる。反応温度は０℃から溶媒の沸点の温度、好まし
くは室温から５０℃で、１−５時間撹拌反応させること
により一般式（８）のエステル化合物を得ることができ
る。

【００３９】次に、式（８）の化合物を還元し、一般式
（９）：

【化１３】 ［式中、ＡおよびＲ⁴は上記定義した通りである］の化
合物を製造することができる。還元反応はＰｄ−Ｃ，Ｐ
ｔ０₂ 等の触媒の存在下、水、メタノール、エタノー
ル、酢酸エチル、酢酸等の溶媒中で、常圧または加圧下
に行われる。反応温度は０℃から溶媒の沸点の温度、好
ましくは室温から５０℃で、１−２４時間撹拌反応させ
ることにより一般式（９）の化合物を得ることができ
る。

【００４０】さらに、式（９）の化合物に、一般式（１
０）；Ｒ ₁ −ＣＯＹ （１０） ［式中、Ｙはハロゲン原子、Ｒ ₁ は上記定義した通りで
ある］で表される酸ハライド化合物を、ベンゼン、トル
エン、キシレン、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩
化炭素、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオ
キサン、アセトン、メチルエチルケトン、アセトニトリ
ル、酢酸エチル、ジメチルホルムアミド、ジメチルスル
ホキシド等の不活性溶媒中、炭酸水素ナトリウム、炭酸
水素カリウム等の無機塩基、トリエチルアミン、ピリジ
ン、ジイソプロピルエチルアミン等の有機塩基の存在
下、または非存在下に、０℃から溶媒の沸点の温度、好
ましくは室温から５０℃で、１−５時間撹拌反応させる
ことにより一般式（６）の化合物を得ることができる。

【００４１】（ロ）先ず、一般式（１１） Ｒ₁−ＣＯＮＨ−Ｐｈ−ＯＨ （１１） ［式中、Ｐｈはベンゼン環を表し、Ｒ₁は上記で定義し
た通りである］で表される化合物に、経路（イ）の説明
において記載した式（７） Ｙ−Ｂ−ＣＯＯＲ₄ （７） ［式中、Ｂは、Ｙからβ位置の炭素が不飽和の、所望に
より枝別れしていてもよい炭素数２−１０、好ましくは
３−５のアルケンであり；ＹおよびＲ₄は上記に定義し
た通りである］の化合物を塩基の存在下に反応させるこ
とにより、一般式（１２）

【化１４】 ［式中、Ｒ₁、Ｒ₄およびＢは上記定義した通りである］
の化合物を製造することができる。溶媒としては、メタ
ノール、エタノール、ベンゼン、トルエン、キシレン、
ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、ジエチル
エーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、アセト
ン、メチルエチルケトン、アセトニトリル、酢酸エチ
ル、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシドおよ
び水等が、塩基としては、炭酸ナトリウム、炭酸カリウ
ム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、ナトリウムメ
チラート、ナトリウムエチラート、トリエチルアミン等
が挙げられる。反応温度は０℃から溶媒の沸点の温度、
好ましくは室温から５０℃で、１−５時間撹拌反応させ
ることにより一般式（１２）の化合物を得ることができ
る。

【００４２】なお、式（１１）の化合物は例えば、経路
（イ）の説明において記載した式（１０）；Ｒ ₁ −ＣＯＹ （１０） ［式中、Ｙはハロゲン原子、Ｒ ₁ は上記定義した通りで
ある］で表される酸ハライド化合物とアミノフエノール
とを、ベンゼン、トルエン、キシレン、ジクロロメタ
ン、クロロホルム、四塩化炭素、ジエチルエーテル、テ
トラヒドロフラン、ジオキサン、アセトン、メチルエチ
ルケトン、アセトニトリル、酢酸エチル、ジメチルホル
ムアミド、ジメチルスルホキシド等の不活性溶媒中、炭
酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム等の無機塩基、ト
リエチルアミン、ピリジン、ジイソプロピルエチルアミ
ン等の有機塩基の存在下、または非存在下に、０℃から
溶媒の沸点の温度、好ましくは室温から５０℃で、１−
５時間撹拌反応させることにより一般式（１１）の化合
物を得ることができる。

【００４３】次に、一般式（１２）の化合物を、Ｐｄ−
Ｃ，ＰｔＯ₂等の触媒の存在下、水、メタノール、エタ
ノール、酢酸エチル、酢酸等の溶媒中で、常圧または加
圧下に、０℃から溶媒の沸点の温度、好ましくは室温か
ら５０℃で、１−２４時間撹拌反応させることにより一
般式（６）の化合物を得ることができる。

【００４４】以上の製造法によって、化合物は結晶もし
くは油状で得られるので、必要ならばカラムクロマトグ
ラフイーまたは再結晶操作を行うことにより、さらに高
純度の精製品とすることができる。

【００４５】以下、本発明の抗原、抗体の作製、および
免疫化学的測定法について説明する。尚、これらの調製
は、例えば続生化学実験講座、免疫生化学研究法（日本
生化学会編）等に記載の公知の方法に従って行うことが
できる。

【００４６】酸アミド系化合物誘導体−高分子化合物結
合体の作製 上述のように合成された酸アミド系化合物誘導体は適当
な高分子化合物に結合させてから免疫用抗原として使用
する。

【００４７】好ましい高分子化合物の例としては、スカ
シガイのヘモシアニン、卵白アルブミン、ウシ血清アル
ブミン、ウサギ血清アルブミンなどがある。スカシガイ
のヘモシアニン及びウシの血清アルブミンが好ましい。

【００４８】酸アミド系誘導体と高分子化合物との結合
は、例えば、混合酸無水物法（B.F.Erlanger et al.:J.
Biol.Chem. 234 1090-1094 (1954)），または活性化エ
ステル法（A.E. KARU et al.:J. Agric. Food Chem. 42
301-309 (1994)）等の公知の方法によって行うことが
できる。

【００４９】混合酸無水物法において用いられる混合酸
無水物は、カルボン酸とハロ蟻酸エステルとの反応によ
り得られ、これを高分子化合物と反応させることにより
目的とするハプテン−高分子化合物結合体が製造され
る。この反応は塩基性化合物の存在下に行われる。塩基
性化合物としては例えば、トリエチルアミン、トリメチ
ルアミン、ピリジン、ジメチルアニリン、Ｎ−メチルモ
ルホリン、ＤＢＮ、ＤＢＵ、ＤＡＢＣＯ等の有機塩基、
炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭
酸水素ナトリウム等の無機塩基等が挙げられる。該反応
は、通常−２０℃から１００℃、好ましくは０℃から５
０℃において行われ、反応時間は５分から１０時間、好
ましくは５分から２時間である。得られた混合酸無水物
と高分子化合物との反応は、通常−２０℃から１５０
℃、好ましくは５℃から１００℃において行われ、反応
時間は５分から１０時間、好ましくは５分から５時間で
ある。混合酸無水物法は一般に溶媒中で行われる。溶媒
としては、混合酸無水物法に慣用されているいずれの溶
媒も使用可能であり、具体的にはジクロロメタン、クロ
ロホルム、ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素類、
ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素類、
ジエチルエーテル、ジオキサン、テトラヒドロフラン、
ジメトキシエタン等のエーテル類、酢酸メチル、酢酸エ
チル等のエステル類、Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド、
ジメチルスルホキシド、ヘキサメチルリン酸トリアミド
等の非プロトン性極性溶媒等が挙げられる。混合酸無水
物法において使用されるハロ蟻酸エステルとしては、例
えばクロロ蟻酸メチル、ブロモ蟻酸メチル、クロロ蟻酸
エチル、ブロモ蟻酸エチル、クロロ蟻酸イソブチル等が
挙げられる。当該方法におけるハプテンとハロ蟻酸エス
テルと高分子化合物の使用割合は、広い範囲から適宜選
択され得る。

【００５０】一方、活性化エステル法は、一般に以下の
ように行うことができる。まず、ハプテン化合物を有機
溶媒に溶解し、カップリング剤の存在下にてＮ−ヒドロ
キシスクシンイミドと反応させ、Ｎ−ヒドロキシスクシ
ンイミド活性化エステルを生成する。

【００５１】カップリング剤としては、縮合反応に慣用
されている通常のカップリング剤を使用でき、例えば、
ジシクロヘキシルカルボジイミド等が含まれる。有機溶
媒としては、例えば、無水ジメチルホルムアミド（ＤＭ
Ｆ）、ＤＭＳＯ等が使用できる。反応に使用するハプテ
ン化合物とＮ−ヒドロキシスクシンイミドのモル比は好
ましくは１：１０〜１０：１、最も好ましくは１：１で
ある。反応温度は、０−１００℃、好ましくは５−５０
℃で、反応時間は５分−２４時間、好ましくは３０分−
６時間である。

【００５２】カップリング反応後反応液を遠心し、上清
液を高分子化合物を溶解した溶液に加え反応させると、
例えば高分子化合物が遊離のアミノ基を有する場合、当
該アミノ基とハプテン化合物のカルボキシル基の間に酸
アミド結合が生成される。反応温度は、０−６０℃、好
ましくは５−４０℃で、反応時間は５分−２４時間、好
ましくは１−１６時間である。反応物を、透析、脱塩カ
ラム等によって精製して、酸アミド系化合物誘導体−高
分子化合物結合体を得ることができる。

【００５３】また、上記と同様の方法により、高分子化
合物の代わりに酵素標識を酸アミド系化合物誘導体に結
合させたものを、免疫化学的測定方法において使用する
ことができる。

【００５４】ポリクローナル抗体の作製 酸アミド系化合物誘導体−高分子化合物結合体を使用し
て、慣用化された方法により本発明のポリクローナル抗
体を作製することができる。例えば、酸アミド系化合物
誘導体−ウシ血清アルブミン結合体をリン酸緩衝液（以
下、「ＰＢＳ」という）に溶解し、フロイント完全アジ
ュバントまたは不完全アジュバント、あるいはミョウバ
ン等の補助剤と混合したものを、免疫原として動物を免
疫化することによって行う。免疫化される動物としては
当該分野で常用されるものをいずれも使用できるが、例
えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ等を挙げる
ことができる。

【００５５】免疫の際の投与法は、皮下注射、腹腔内注
射、静脈内注射、皮内注射、筋肉内注射のいずれでもよ
いが、皮下注射または腹腔内注射が好ましい。免疫は１
回または適当な間隔で、好ましくは１週間ないし５週間
の間隔で複数回行うことができる。

【００５６】免疫した動物から血液を採取し、そこから
分離した血清を用いて後述する方法によって酸アミド系
化合物と反応させ、ポリクローナル抗体の存在または力
価を評価することができる。

【００５７】ポリクローナル抗体による酸アミド系化合
物の測定 本発明で使用するポリクローナル抗体による酸アミド系
化合物の測定法としては、放射性同位元素免疫測定法
（ＲＩＡ法）、ＥＬＩＳＡ法（Engvall,E.,Meth.Enzymo
l., 70, 419-439 (1980)）、蛍光抗体法、プラーク法、
スポット法、血球凝集反応、オクタロニー（Ｏｕｃｈｔ
ｅｒｌｏｎｙ）等の一般に抗体の検出に使用されている
種々の方法（「ハイブリドーマ法とモノクローナル抗
体」、株式会社Ｒ＆Ｄプラニング発行、第３０頁−第５
３頁、昭和５７年３月５日）が挙げられる。感度、迅速
性、正確性、自動化等の観点からＥＬＩＳＡ法が好まし
い。

【００５８】上述の測定は、例えば間接競合阻害ＥＬＩ
ＳＡ法により、以下のような手順により行うことができ
る。（ａ）まず、抗原である酸アミド系化合物−高分子
化合物結合体を担体に固相化する。（ｂ）抗原が吸着し
ていない固相表面を抗原と無関係なタンパク質によりブ
ロッキングする。（ｃ）これに各種濃度の酸アミド系化
合物を含む試料及びポリクローナル抗体を加え、該抗体
を前記固相化抗原および遊離酸アミド系化合物に競合的
に反応させて、抗体−固相化抗原複合体及び抗体−遊離
酸アミド系化合物複合体を生成させる。（ｄ）抗体−固
相化抗原複合体の量を測定することにより、予め作成し
た検量線から試料中の遊離酸アミド系化合物の量を決定
することができる。

【００５９】（ａ）工程において、抗原を固相化する担
体としては、特別な制限はなく、ＥＬＩＳＡ法において
常用されるものをいずれも使用することができる。例え
ば、ポリスチレン製の９６穴マイクロプレートが挙げら
れる。

【００６０】抗原を担体に固相化させるには、例えば、
抗原を含む緩衝液を担体上に載せ、インキュベーション
すればよい。緩衝液としては公知のものが使用でき、例
えば、１４５ｍＭ ＮａＣｌを含む１０ｍＭ リン酸緩衝
液（ｐＨ７.２）の組成のものを挙げることができる。
緩衝液中の抗原の濃度は広い範囲から選択できるが、通
常０.０１−１００μｇ／ｍｌ程度、好ましくは０.０５
−５μｇ／ｍｌが適している。また、担体として９６穴
マイクロプレートを使用する場合には、２０−１５０μ
ｌ／ウェル程度が望ましい。更に、インキュベーション
の条件にも特に制限はないが、通常４℃程度で一晩イン
キュベーションが適している。

【００６１】（ｂ）工程のブロッキングは、酸アミド系
化合物−高分子化合物結合体を固相化した担体におい
て、酸アミド系化合物の部分以外に後で添加する抗体が
吸着され得る部分が存在する場合があり、もっぱらそれ
を防ぐ目的で行われる。ブロッキング剤として、例え
ば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）やスキムミルク溶液
を使用できる。あるいは、ブロックエース（「Ｂｌｏｃ
ｋ Ａｃｅ」、雪印乳業社製、コードＮｏ．ＵＫ−２５
Ｂ）等のブロッキング剤として市販されているものを使
用することもできる。具体的には、限定されるわけでは
ないが、例えば抗原を固相化した部分にブロックエース
を適量加え、約４℃で、一晩インキュベーションした
後、緩衝液で洗浄することにより行われる。緩衝液とし
ては特に制限はないが、例えば、１０ｍＭ リン酸緩衝
液（ｐＨ７.２）、０.８％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ、０.０
２％（ｗ／ｖ）ＫＣｌ、０.０２％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅ
ｎ２０の組成のものが適している。

【００６２】次いで（ｃ）工程において、酸アミド系化
合物を含む試料とポリクローナル抗体を固相化抗原と接
触させ、抗体を固相化抗原及び遊離酸アミド系化合物と
反応させることにより、固相化抗原−抗体複合体及び遊
離酸アミド系化合物−抗体複合体が生成する。

【００６３】この際、抗体としては、第一抗体としてポ
リクローナル抗体を加え、更に第二抗体として標識酵素
を結合した第一抗体に対する抗体を順次加えて反応させ
る。

【００６４】第一抗体は緩衝液に溶解して添加する。限
定されるわけではないが、反応は、２５℃程度で約１時
間行えばよい。反応終了後、緩衝液で担体を洗浄し、未
反応の第一抗体を除去する。洗浄液としては、１０ｍＭ
リン酸緩衝液（ｐＨ７.２）、０.８％（ｗ／ｖ）Ｎａ
Ｃｌ、０.０２％（ｗ／ｖ）ＫＣｌの組成のものが好ま
しい。

【００６５】次いで第二抗体を添加する。例えば第一抗
体としてウサギ抗血清を用いる場合、酵素（例えば、ペ
ルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ等）を結
合した抗ウサギＩｇＧヤギ抗体を用いるのが適当であ
る。担体に結合した第一抗体に約１０００−１００００
倍、好ましくは最終吸光度が１.０−１.５となるように
希釈した第二抗体を反応させるのが望ましい。希釈には
緩衝液を用いる。限定されるわけではないが、反応は約
２５℃で約１時間行い、反応後、緩衝液で洗浄する。以
上の反応により、第二抗体が第一抗体に結合する。ま
た、標識した第一抗体を用いてもよく、その場合、第二
抗体は不要である。

【００６６】次いで（ｄ）工程において担体に結合した
第二抗体の酵素と基質との反応によって発色する試薬を
加え、吸光度を測定することによって検量線から酸アミ
ド系化合物の量を算出することができる。

【００６７】第二抗体に結合する酵素としてペルオキシ
ダーゼを使用する場合には、基質として過酸化水素、発
色試薬としてｏ−フェニレンジアミンを使用することが
望ましい。限定されるわけではないが、発色溶液を加え
約２５℃で約１０分間反応させた後、４Ｎの硫酸を加え
ることにより酵素反応を停止させる。ｏ−フェニレンジ
アミンを使用する場合、４９２ｎｍの吸光度を測定す
る。一方、第二抗体に結合する酵素としてアルカリホス
ファターゼを使用する場合には、ｐ−ニトロフェニルリ
ン酸を基質として発色させ、２ＮのＮａＯＨを加えて酵
素反応を止め、４１５ｎｍでの吸光度を測定する方法が
適している。

【００６８】上述した間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によれ
ば、本発明のポリクローナル抗体は、例えばフルトラニ
ルの量を、０.００１−１００μｇ／ｍｌ、好ましくは
０.０１−１０μｇ／ｍｌの範囲で測定できる（実施例
１１、図１）。

【００６９】モノクローナル抗体の作製 酸アミド系化合物−高分子化合物結合体を使用して、慣
用化された方法により本発明のモノクローナル抗体を作
製することができる。

【００７０】モノクローナル抗体の製造にあたっては、
少なくとも下記のような作業工程が必要である。

【００７１】（ａ）免疫用抗原として使用する酸アミド
系化合物−高分子化合物結合体の作製 （ｂ）動物への免疫用抗原の接種 （ｃ）血液を採取、アッセイし、抗体産生細胞調製の時
期を決定することからなる抗体産生細胞の調製 （ｄ）ミエローマの調製 （ｅ）抗体産生細胞とミエローマとの細胞融合 （ｆ）目的とする抗体を産生するハイブリドーマのクロ
ーニング （ｇ）場合によってはモノクローナル抗体を大量に製造
するためのハイブリドーマの培養または動物へのハイブ
リドーマの移植 （ｈ）製造されたモノクローナル抗体の生理活性または
標識試薬としての検定等

【００７２】モノクローナル抗体を産出するハイブリド
ーマを作製するための常法は、例えば、ハイブリドーマ
テクニックス（Hybridoma Techniques），コールド
スプリング ハーバーラボラトリーズ（Cold Spring Ha
rbor Laboratory），１９８０年版）、細胞組織化学
（山下修二ら、日本組織細胞化学会編；学際企画、１９
８６年）に記載されている。

【００７３】以下、本発明の抗酸アミド系化合物 モノ
クローナル抗体の作製方法を説明するが、これに制限さ
れず、例えば脾細胞以外の抗体産生細胞、ミエローマ、
他の哺乳動物の抗体産生細胞、ミエローマが使用できる
ことは、当業者によって明らかであろう。

【００７４】（ａ）−（ｃ）の工程は、ポリクローナル
抗体に関して記述した方法とほぼ同様の方法によって行
うことができる。

【００７５】ミエローマとしては、例えば、ＢＡＬＢ／
ｃマウス由来骨髄腫細胞株のＰ３／Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ
６３）（Nature，256, 495-497 (1975)）、Ｐ３／Ｘ６
３−Ａｇ８．Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）（Current Topics.in Mi
crobiology and Immunology,81 1-7 (1987)）、Ｐ３／
ＮＳＩ−１−Ａｇ４−１（ＮＳ−１）（Eur.J.Immuno
l., 6, 511-519 (1976)）、Ｓｐ２／Ｏ−Ａｇ１４（Ｓ
ｐ２／Ｏ）（Nature 276,269-270 (1978)）、ＦＯ（J.
Immuno. Meth., 35, 1-21 (1980)）、ＭＰＣ−１１、Ｘ
６３.６５３、Ｓ１９４等の骨髄腫株化細胞、あるいは
ラット由来の２１０．ＲＣＹ３．Ａｇ１.２.３.（Ｙ
３）（Nature 277, 131-133, (1979)）等を使用でき
る。

【００７６】これらの株化細胞を、例えば８−アザグア
ニン培地で選択し、ヒポキサンチンホスホリボシルトラ
ンスフェラーゼ欠損となった細胞株を用いる。そして、
ＩＭＤＭ（Iscove Modified Dulbecco's Medium）また
はＤＭＥＭ（Dulbecco's MEM）で継代培養し、融合当日
に３×１０³以上の細胞数を確保する。

【００７７】抗体産生細胞はリンパ球であり、これは一
般には脾臓、胸腺、リンパ節、末梢血液またはこれらの
組み合わせからえることができるが脾細胞が最も一般的
に用いられる。

【００７８】最終免疫後、抗体産生が確認されたマウス
より抗体産生細胞が存在する部位、例えば脾臓を摘出
し、抗体産生細胞である脾細胞を調製する。この脾細胞
と工程（ｄ）で得られたミエローマの融合は公知の方
法、例えばミルスタイン（Milstein）らの方法（Method
s in Enzymology, 73, 3 (1981)）等に準じて行うこと
ができる。現在最も一般的に行われているのは、融合作
業も簡単なポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いる
方法である。ＰＥＧ法については、例えば、細胞組織化
学、山下修二ら（上述）に記載されている。あるいは、
電気処理（電気融合）による方法等を適宜採用すること
もできる（大河内悦子ら、実験医学 ５．１３１５−１
９、１９８７）。また、細胞の使用比率も公知の方法と
同様でよく、例えばミエローマ細胞に対して脾細胞を３
〜１０倍程度用いればよい。

【００７９】抗体産生細胞とミエローマとが融合し、抗
体生産能および増殖能を獲得したハイブリドーマ群の選
択は、例えば、ミエローマ細胞株として８−アザグアニ
ン耐性株を使用した場合、ＨＡＴ培地の使用により行う
ことができる。さらに、選択されたハイブリドーマ群を
含む培養上清の一部をとり、例えば上述したＥＬＩＳＡ
法により、酸アミド系化合物に対する活性を測定する。

【００８０】さらに、上述の測定により酸アミド系化合
物に反応する抗体を産生することが判明したハイブリド
ーマのクローニングを行う。このクローニング法として
は、限界希釈により１ウェルに１個のハイブリドーマが
含まれるように希釈する方法；軟寒天培地上に撒きコロ
ニーをとる方法；マイクロマニピュレーターによって１
個の細胞を取り出す方法；セルソーターによって１個の
分離する「ソータークローン」法等が挙げられる。限界
希釈法が簡単でありよく用いられる。

【００８１】抗体価の認められたウェルについて、例え
ば限界希釈法によりクローニングを１−４回繰り返して
安定して抗体価の得られたものを、抗酸アミド系化合物
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株として選択
する。

【００８２】ハイブリドーマを培養する培地としては、
例えば、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むＤＭＥＭまたは
ＩＭＤＭ等が用いられる。ハイブリドーマの培養は、例
えば二酸化炭素濃度５−７％程度及び３７℃（１００％
湿度中の恒温器中）で培養するが好ましい。

【００８３】抗体を作製するための大量培養は大型培養
ビンを用いた回転培養等によって行われる。または、同
系統のマウス（例えば、上述のＢＡＬＢ／ｃ）あるいは
Ｎｕ／Ｎｕマウスの腹腔内でハイブリドーマを増殖さ
せ、腹水液より抗体を作製することも可能である。

【００８４】これらにより得られた培養上清液あるいは
腹水液を酸アミド系化合物モノクローナル抗体として使
用することができるが、さらに透析、硫酸アンモニウム
による塩析、ゲル濾過、凍結乾燥等を行い、ＩｇＧ画分
を集め精製することにより抗酸アミド系化合物モノクロ
ーナル抗体を得ることができる。さらに、精製が必要な
場合には、イオン交換カラムクロマトグラフィー、ＤＥ
ＡＥ−セファロースカラム、プロテインＡ−セファロー
スカラム、ＨＰＬＣなどの慣用されている方法を使用し
てＩｇＧ画分を集める操作を１回、または複数回行うこ
とにより実施できる。

【００８５】以上のようにして得られた抗酸アミド系化
合物モノクローナル抗体は、例えば上述したＥＬＩＳＡ
法などの公知の方法を使用して、イソタイプ、サブクラ
ス、抗体価等を決定することができる。

【００８６】本発明のモノクローナル抗体の一つ、２Ａ
７−１−１は非常に特異性が高く、フルトラニルとのみ
反応し、他の酸アミド系化合物であるメプロニル、メベ
ニル、ベノダニルおよびサリチルアニリドとは反応しな
い。モノクローナル抗体２Ａ７−１−１を使用してのフ
ルトラニルの量を０．０１−１００ｎｍｏｌ／ｍｌ、好
ましくは１−１００ｎｍｏｌ／ｍｌの範囲で測定するこ
とができる（実施例１３、図２）。

【００８７】一方、本発明の別のモノクローナル抗体３
Ａ１４−１−１は、類似する数種類の酸アミド系化合物
と反応する。具体的には、モノクローナル抗体３Ａ−１
４−１−１を使用して、０.００１−１０ｎｍｏｌ／ｍ
ｌ、好ましくは０．０１−１ｎｍｏｌ／ｍｌのフルトラ
ニルを始め、０.０１−１００ｎｍｏｌ／ｍｌ、好まし
くは０．１−１０ｎｍｏｌ／ｍｌのメプロニル、０.０
１−１００ｎｍｏｌ／ｍｌ、好ましくは０．１−１０ｎ
ｍｏｌ／ｍｌのベノダニル、並びに、１−１００ｎｍｏ
ｌ／ｍｌのメベニルを測定することができる。モノクロ
ーナル抗体３Ａ１４−１−１は、サリチルアニリドとは
反応しない（実施例１４、図３）。

【００８８】本発明の方法により作製されたモノクロー
ナル抗体による酸アミド系化合物の測定 上述した方法によって得られた本発明のモノクローナル
抗体は、例えば免疫化学的測定法により酸アミド系化合
物を定量するために使用できる。免疫化学的測定法は、
それぞれの抗原物質に対応する抗体が、選択的に反応す
るという抗原抗体反応を応用したものであり、検出感度
も高く、抗原物質、抗体の定量を行うのに適している。

【００８９】既に述べたように、免疫化学的測定法とし
ては、例えばＲＩＡ法，ＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法、血
液凝集反応法等があり、種々の点においてＥＬＩＳＡ法
が最も適している。

【００９０】本発明のモノクローナル抗体を用いた酸ア
ミド系化合物の測定は、例えば以下に述べるような直接
競合阻害ＥＬＩＳＡ法によって行うことができる。即
ち、本発明の酸アミド系化合物と反応するモノクローナ
ル抗体を、固相に吸着させ、抗原と無関係なタンパク質
により、該抗体により吸着されていない固相表面を覆
う。該表面を洗浄後、試料ならびに酵素標識抗原または
酵素標識した酸アミド系化合物を加え、反応させる。洗
浄後、酵素基質を加え、酵素活性を測定することによ
り、抗原の定量を行うことができる。

【００９１】本発明のモノクローナル抗体の一つ、２Ａ
７−１−１は、直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法でフルトラニ
ルの量を０.００１−１０μｇ／ｍｌ、好ましくは０．
０１−１０μｇ／ｍｌの範囲で測定できる（実施例１
６、図４）。

【００９２】また、本発明の別のモノクローナル抗体Ｍ
ＰＮ２−４３は、メプロニルを初めとする数種類の酸ア
ミド系化合物と反応する。具体的には、モノクローナル
抗体ＭＰＮ２−４３は直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法でメプ
ロニルの量を０.１−１００ｐｍｏｌ／ｍｌ、好ましく
は０.１−１０ｐｍｏｌ／ｍｌの範囲で、フルトラニ
ル、メベニル、ベノダニルの量を１−１０００ｐｍｏｌ
／ｍｌ、好ましくは１−１００ｐｍｏｌ／ｍｌの範囲で
測定することができる（実施例１８、図５）。

【００９３】以下、本発明の説明のために実施例を記載
するが、実施例は本発明の技術的範囲を制限するための
ものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易
に本発明に修飾、変更を加えることができ、それらは本
発明の技術的範囲に含まれる。

【００９４】

【実施例】実施例１ フルトラニルハプテン−１の合成

【化１５】 （１）エチル ４−［Ｎ−（３−イソプロポキシフェニ
ル）−Ｎ−（２−トリフルオロメチルベンゾイル）アミ
ノ］ブタノエートの合成 Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド７０ｍｌに２−トリフル
オロメチル−３'−イソプロポキシベンズアニリド（フ
ルトラニル）（１）３.２ｇ（１０ｍｍｏｌ）および６
０％水素化ナトリウム０.４４ｇ（１１ｍｍｏｌ）を加
え、室温で１時間、１２０℃で１時間撹拌した。この混
合物にエチル ４−ブロモブタノエート２.３ｇ（１２
ｍｍｏｌ）を室温下に加えて、６０〜７０℃で３時間、
１２０℃で１時間撹拌反応させた。この反応混合物を室
温まで冷却後、水５０ｍｌを加え、トルエンで抽出し
た。トルエン層を水洗いし、無水硫酸マグネシウムで乾
燥後、トルエンを留去した。残渣をシリカゲルクロマト
グラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝３：１）で精
製し、３.６ｇ（収率８２％）のエチル ４−［Ｎ−
（３−イソプロポキシフェニル）−Ｎ−（２−トリフル
オロメチルベンゾイル）アミノ］ブタノエート（２）を
得た。

【００９５】（２）フルトラニルハプテン−１（４−
［Ｎ−（３−イソプロポキシフェニル）−Ｎ−（２−ト
リフルオロメチルベンゾイル）アミノ］ブタン酸）の合
成 エチル ４−［Ｎ−（３−イソプロポキシフェニル）−
Ｎ−（２−トリフルオロメチルベンゾイル）アミノ］ブ
タノエート（２）３.６ｇ（８ｍｍｏｌ）をエタノール
５０ｍｌに溶解し、この溶液に水１０ｍｌに溶解した苛
性ソーダ１.０ｇを加え、室温下に１時間撹拌した。反
応混合物を濃縮し、残渣を水５０ｍｌに溶解した。この
溶液に５Ｎの塩酸を徐々に加えて酸性にし、酢酸エチル
で抽出した。酢酸エチル層を水洗いし、無水硫酸マグネ
シウムで乾燥後、減圧下に濃縮した。残渣をシリカゲル
クロマトグラフィー（酢酸エチル：エタノール＝４：
１）で精製し、２.２ｇ（収率６６％）のフルトラニル
ハプテン−１（４−［Ｎ−（３−イソプロポキシフェニ
ル）−Ｎ−（２−トリフルオロメチルベンゾイル）アミ
ノ］ブタン酸）（３）を得た。

【００９６】

【表１】¹Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃，ｐｐｍ） １.１９（６Ｈ，ｄ） １.９７（２Ｈ，ｑｕｉｎ） ２.４７（２Ｈ，ｔ） ４.０１（２Ｈ，ｂｒ） ４.３５（１Ｈ，ｑｕｉｎ） ６.５８−６.６８（３Ｈ，ｍ） ７.０５−７.１２（２Ｈ，ｍ） ７.２４−７.３０（２Ｈ，ｍ） ７.５４−７.５７（１Ｈ，ｍ） ８.６９（１Ｈ，ｂｒ）

【００９７】実施例２ フルトラニルハプテン−２の合
成

【化１６】 （１）エチル ４−（３−ニトロフェノキシ）−２−ペ
ンテノエートの合成 エタノール１００ｍｌに３−ニトロフェノール（１）
４.２ｇ（３０ｍｍｏｌ）および炭酸カリウム５.０ｇ
（３６ｍｍｏｌ）を加え、この混合物にエチル４−ブロ
モ−２−ペンテノエート６.８ｇ（３３ｍｍｏｌ）を室
温下に加えて、還流下に１.５時間撹拌反応させた。こ
の反応混合物を濃縮後、水５０ｍｌを加えトルエンで抽
出した。トルエン層を水、１０％苛性ソーダ水溶液、水
の順に洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、トルエ
ンを留去した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー
（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝４：１）で精製し、６.
４ｇ（収率８０％）のエチル ４−（３−ニトロフェノ
キシ）−２−ペンテノエート（２）を得た。

【００９８】（２）エチル ４−（３−アミノフェノキ
シ）ペンタノエートの合成 エタノール１５０ｍｌにエチル ４−（３−ニトロフェ
ノキシ）−２−ペンテノエート（２）６ｇ（２３ｍｍｏ
ｌ）および１０％パラジウムカーボン５０ｍｇを加え、
この混合物に水素ガスを室温下に７時間かけて吹き込ん
だ。この反応混合物を濾過し、濾液を濃縮して、４.８
ｇ（収率８０％）のエチル ４−（３−アミノフェノキ
シ）ペンタノエート（３）を得た。

【００９９】（３）エチル ４−［３−（２−トリフル
オロメチルベンゾイルアミノ）フェノキシ］ペンタノエ
ートの合成 トルエン４０ｍｌにエチル ４−（３−アミノフェノキ
シ）ペンタノエート（３）２.４ｇ（１０ｍｍｏｌ）お
よび炭酸水素ナトリウム０.９２ｇ（１１ｍｍｏｌ）を
加え、この混合物に２−トリフルオロメチルベンゾイル
クロリド２.１ｇ（１０ｍｍｏｌ）を室温下に加えて、
６０−７０℃で２時間撹拌反応させた。この反応混合物
を室温まで冷却後、トルエン１００ｍｌおよび水５０ｍ
ｌを加え分液した。トルエン層を水、１０％苛性ソーダ
水溶液、水の順に洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥
後、トルエンを留去した。残渣をシリカゲルクロマトグ
ラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝３：１）で精製
し、２.０ｇ（収率５０％）のエチル ４−［３−（２
−トリフルオロメチルベンゾイルアミノ）フェノキシ］
ペンタノエート（４）を得た。

【０１００】（４）フルトラニルハプテン−２（４−
［３−（２−トリフルオロメチルベンゾイルアミノ）フ
ェノキシ］ペンタン酸）の合成 エチル ４−［３−（２−トリフルオロメチルベンゾイ
ルアミノ）フェノキシ］ペンタノエート（４）２ｇ（５
ｍｍｏｌ）をエタノール６０ｍｌに溶解し、この溶液に
水１０ｍｌに溶解した苛性ソーダ１ｇ（２５ｍｍｏｌ）
を加え、室温下に１.５時間撹拌した。反応混合液を濃
縮し、残渣を水５０ｍｌに溶解した。この溶液に５Ｎの
塩酸を徐々に加えて酸性にし、酢酸エチルで抽出した。
酢酸エチル層を水洗いし、無水硫酸マグネシウムで乾燥
後、減圧下に濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラ
フィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝１：１）で精製
し、１.５ｇ（収率７９％）のフルトラニルハプテン−
２（４−［３−（２−トリフルオロメチルベンゾイルア
ミノ）フェノキシ］ペンタン酸）（５）を得た。融点１
４３−１４５℃

【０１０１】

【表２】¹Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−Ｄ₆，ｐｐｍ） １.２４（３Ｈ，ｄ） １.８３（２Ｈ，ｍ） ２.３４（２Ｈ，ｍ） ４.４２（１Ｈ，ｑ） ６.６９（１Ｈ，ｍ） ７.２１−７.３４（３Ｈ，ｍ） ７.６８−７.８６（４Ｈ，ｍ） １０.４９（１Ｈ，ｓ） １２.１０（１Ｈ，ｓ）

【０１０２】実施例３ メプロニルハプテン−１の合成

【化１７】 （１）エチル ４−［３−（２−メチルベンゾイルアミ
ノ）フェノキシ］−２−ペンテノエートの合成 エタノール１５０ｍｌに２−メチル−３'−ヒドロキシ
ベンズアニリド（１）（特開昭５２−６２２３４号に記
載された公知の化合物）３.７ｇ（１６ｍｍｏｌ）およ
び炭酸カリウム２.９ｇ（２１ｍｍｏｌ）を加え、この
混合物にエチル４−ブロモ−２−ペンテノエート ４.
０ｇ（２０ｍｍｏｌ）を室温下に加えて、６０℃で３時
間撹拌反応した。この反応混合物を濃縮後、水５０ｍｌ
を加えトルエンで抽出した。トルエン層を水、１０％苛
性ソーダ水溶液、水の順に洗浄し、無水硫酸マグネシウ
ムで乾燥後、トルエンを留去した。残渣をシリカゲルク
ロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝３：
１）で精製し、５.０ｇ（収率８９％）のエチル ４−
［３−（２−メチルベンゾイルアミノ）フェノキシ］−
２−ペンテノエート（２）を得た。

【０１０３】（２）エチル ４−［３−（２−メチルベ
ンゾイルアミノ）フェノキシ］ペンタノエートの合成 エタノール１００ｍｌにエチル ４−［３−（２−メチ
ルベンゾイルアミノ）フェノキシ］−２−ペンテノエー
ト（２）５ｇ（１４ｍｍｏｌ）および１０％パラジウム
カーボン６０ｍｇを加え、この混合物に水素ガスを室温
下に６時間かけて吹き込んだ。この反応混合物を濾過
し、濾液を濃縮してエチル ４−［３−（２−メチルベ
ンゾイルアミノ）フェノキシ］ペンタノエート（３）を
得た。

【０１０４】（３）メプロニルハプテン−１（４−［３
−（２−メチルベンゾイルアミノ）フェノキシ］ペンタ
ン酸）の合成 エチル ４−［３−（２−メチルベンゾイルアミノ）フ
ェノキシ］ペンタノエート（３）をエタノール５０ｍｌ
に溶解し、この溶液に水１０ｍｌに溶解した苛性ソーダ
２ｇ（５０ｍｍｏｌ）を加え、室温下に１時間撹拌し
た。反応混合物を濃縮し、残渣を水５０ｍｌに溶解し
た。この溶液に５Ｎの塩酸を徐々に加えて酸性にし、酢
酸エチルで抽出した。酢酸エチル層を水洗いし、無水硫
酸マグネシウムで乾燥後、減圧下に濃縮した。残渣をシ
リカゲルクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチ
ル＝１：１）で精製し、０.５ｇ（収率１１％）のメプ
ロニルハプテン−１（４−［３−（２−メチルベンゾイ
ルアミノ）フェノキシ］ペンタン酸（４）を得た。融点
１００−１０５℃

【０１０５】

【表３】¹Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃，ｐｐｍ） １.３０（３Ｈ，ｄ） １.９６（２Ｈ，ｍ） ２.４６（５Ｈ，ｓ） ４.４４（１Ｈ，ｍ） ６.６６（１Ｈ，ｑ） ７.０５−７.４３（７Ｈ，ｍ） ７.６６（１Ｈ，ｓ） ８.９８（１Ｈ，ｂ）

【０１０６】実施例４ メプロニルハプテン−２の合成

【化１８】 （１）エチル ４−［Ｎ−（３−イソプロポキシフェニ
ル）−Ｎ−（２−メチルベンゾイル）アミノ］ブタノエ
ートの合成 Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド７０ｍｌに２−メチル−
３'−イソプロポキシベンズアニリド（メプロニル）
（１）２.６ｇ（１０ｍｍｏｌ）および６０％水酸化ナ
トリウム０.４４ｇ（１１ｍｍｏｌ）を加え、室温で１
５分間、６０℃で３０分間撹拌した。この混合物にエチ
ル ４−ブロモブタノエート２.３ｇ（１２ｍｍｏｌ）
を室温下に加えて、６０−７０℃で３時間、１２０℃で
１時間撹拌反応させた。この反応混合物を室温まで冷却
後、水５０ｍｌを加え、トルエンで抽出した。トルエン
層を水洗し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、トルエン
を留去した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ｎ
−ヘキサン：酢酸エチル＝３：１）で精製し、１.６ｇ
（収率４２％）のエチル ４−［Ｎ−（３−イソプロポ
キシフェニル）−Ｎ−（２−メチルベンゾイル）アミ
ノ］ブタノエート（２）を得た。

【０１０７】（２）メプロニルハプテン−２（４−［Ｎ
−（３−イソプロポキシフェニル）−Ｎ−（２−メチル
ベンゾイル）アミノ］ブタン酸）の合成 エチル ４−［Ｎ−（３−イソプロポキシフェニル）−
Ｎ−（２−メチルベンゾイル）アミノ］ブタノエート
（２）１.６ｇ（４ｍｍｏｌ）をエタノール５０ｍｌに
溶解し、この溶液に水１０ｍｌに溶解した苛性ソーダを
１.０ｇ（２５ｍｍｏｌ）を加え、室温下に１時間撹拌
した。反応混合物を濃縮し、残渣を水５０ｍｌに溶解し
た。この溶液に５Ｎの塩酸を徐々に加えて酸性にし、酢
酸エチルで抽出した。酢酸エチル層を水洗いし、無水硫
酸マグネシウムで乾燥後、減圧下に濃縮した。残渣をシ
リカゲルクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：エタノー
ル＝４：１）で精製し、１.０ｇ（収率６３％）のメプ
ロニルハプテン−２（４−［Ｎ−（３−イソプロポキシ
フェニル）−Ｎ−（２−メチルベンゾイル）アミノ］ブ
タン酸）（３）を得た。

【０１０８】

【表４】¹Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃，ｐｐｍ） １.１８ （６Ｈ，ｄ） １.９６ （２Ｈ，ｄ） ２.３５ （３Ｈ，ｓ） ２.４５ （２Ｈ，ｄ） １.９２ （２Ｈ，ｄ） ４.３２ （１Ｈ，ｍ） ６.５０−７.２６ （８Ｈ，ｍ） ９.３２ （１Ｈ，ｂ）

【０１０９】実施例５ メプロニルハプテン−３の合成

【化１９】 （１）２−クロロ−３'−ヒドロキシベンズアニリドの
合成 トルエン１００ｍｌとアセトン５０ｍｌにメタアミノフ
ェノール２.２ｇ（２０ｍｍｏｌ）および炭酸水素ナト
リウム２.０ｇ（２４ｍｍｏｌ）を加え、この混合物に
オルソクロロ安息香酸クロリド３.５ｇ（２０ｍｍｏ
ｌ）を室温下に加えて、５０−６０℃で１時間撹拌反応
させた。この反応混合物を室温まで冷却後、水５０ｍｌ
を加え、析出している個体を濾取した。この個体を水、
ｎ−ヘキサンで洗浄後、乾燥し、３.８ｇ（収率７６
％）の２−クロロ−３'−ヒドロキシベンズアニリド
（１）を得た。融点：１６４℃

【０１１０】（２）エチル ４−［３−（２−クロロベ
ンゾイルアミノ）フェノキシ］−２−ペンテノエートの
合成 エタノール１００ｍｌに２−クロロ−３'−ヒドロキシ
ベンズアニリド（１）３.７ｇ（１５ｍｍｏｌ）および
炭酸カリウム２.７（２０ｍｍｏｌ）を加え、この混合
物にエチル ４−ブロモ−２−ペンテノエート３.７ｇ
（１８ｍｍｏｌ）を室温下に加えて、６０℃で３時間撹
拌反応させた。この反応混合物を濃縮後、水５０ｍｌを
加えトルエンで抽出した。トルエン層を水、１０％苛性
ソーダ水溶液、水の順に洗浄し、無水硫酸マグネシウム
で乾燥後、トルエンを留去した。残渣をシリカゲルクロ
マトグラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝２：１）
で精製し、５.５ｇ（収率９８％）のエチル ４−［３
−（２−クロロベンゾイルアミノ）フェノキシ］−２−
ペンテノエート（２）を得た。

【０１１１】（３）エチル ４−［３−（２−クロロベ
ンゾイルアミノ）フェノキシ］ペンタノエートの合成 エタノール８０ｍｌにエチル ４−［３−（２−クロロ
ベンゾイルアミノ）フェノキシ］−２−ペンテノエート
（２）５.３ｇ（１４ｍｍｏｌ）および１０％パラジウ
ムカーボン１００ｍｇを加え、この混合物に水素ガスを
室温下に８時間かけて吹き込んだ。この反応混合物を濾
過し、濾液を濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラ
フィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝２：１）で精製
し、３.７ｇ（収率７０％）のエチル ４−［３−（２
−クロロベンゾイルアミノ）フェノキシ］ペンタノエー
ト（３）を得た。

【０１１２】（４）メプロニルハプテン−３（４−［３
−（２−クロロベンゾイルアミノ）フェノキシ］ペンタ
ン酸）の合成 エチル ４−［３−（２−クロロベンゾイルアミノ）フ
ェノキシ］ペンタノエート（３）２.１ｇ（５.６ｍｍｏ
ｌ）をエタノール４０ｍｌに溶解し、この溶液に水１０
ｍｌに溶解した苛性ソーダを１.５ｇ（３８ｍｍｏｌ）
を加え、室温下に１時間撹拌した。反応混合物を濃縮
し、残渣を水５０ｍｌに溶解した。この溶液に５Ｎの塩
酸を徐々に加えて酸性にし、酢酸エチルで抽出した。酢
酸エチル層を水洗いし、無水硫酸マグネシウムで乾燥
後、減圧下に濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラ
フィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝１：１）で精製
し、１.１ｇ（収率５８％）のメプロニルハプテン−３
（４−［３−（２−クロロベンゾイルアミノ）フェノキ
シ］ペンタン酸）（４）を得た。

【０１１３】

【表５】¹Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−Ｄ₆，ｐｐｍ） １.２４ （３Ｈ，ｄ） １.８１−１.８８ （２Ｈ，ｍ） ２.３２−２.３５ （２Ｈ，ｍ） ４.３９−４.４４ （１Ｈ，ｍ） ６.６８ （１Ｈ，ｄ） ７.２０−７.２２ （２Ｈ，ｍ） ７.３８−７.５８ （５Ｈ，ｍ） １０.４５ （１Ｈ，ｓ） １２.１３ （１Ｈ，ｂｒ）

【０１１４】実施例６ メプロニルハプテン−４の合成

【化２０】 （１）エチル ４−［Ｎ−（２−クロロベンゾイル）−
Ｎ−（３−イソプロポキシフェニル）アミノ］ブタノエ
ートの合成 Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド４０ｍｌに２−クロロ−
３'−イソプロポキシベンズアニリド（１）（特開昭５
２−１３３９３９）２.９ｇ（１０ｍｍｏｌ）および６
０％水素化ナトリウム０.４４ｇ（１１ｍｍｏｌ）を加
え、室温で１５分間、６０℃で３０分間撹拌した。この
混合物にエチル ４−ブロモ酪酸エステル２.４ｇ（１
２ｍｍｏｌ）を室温下に加えて、１２０℃で８時間撹拌
反応させた。この反応混合物を室温まで冷却後、水５０
ｍｌを加え、トルエンで抽出した。トルエン層を水洗い
し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、トルエンを留去し
た。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサ
ン：酢酸エチル＝４：１）で精製し、１.５ｇ（収率３
７％）のエチル ４−［Ｎ−（２−クロロベンゾイル）
−Ｎ−（３−イソプロポキシフェニル）アミノ］ブタノ
エート（２）を得た。

【０１１５】（２）メプロニルハプテン−４（４−［Ｎ
−（２−クロロベンゾイル）−Ｎ−（３−イソプロポキ
シフェニル）アミノ］ブタン酸）の合成 エチル ４−［Ｎ−（２−クロロベンゾイル）−Ｎ−
（３−イソプロポキシフェニル）アミノ］ブタノエート
（２）１.４ｇ（３.４ｍｍｏｌ）をエタノール４０ｍｌ
に溶解し、この溶液に水１０ｍｌに溶解した苛性ソーダ
１.０ｇ（２５ｍｍｏｌ）を加え、室温下に１時間撹拌
した。反応混合物を濃縮し、残渣を水５０ｍｌに溶解し
た。この溶液に５Ｎの塩酸を徐々に加えて酸性にし、酢
酸エチルで抽出した。酢酸エチル層を水洗いし、無水硫
酸マグネシウムで乾燥後、減圧下に濃縮した。残渣をシ
リカゲルクロマトグラフィー（酢酸エチル：エタノール
＝４：１）で精製し、０.９６ｇ（収率７４％）のメプ
ロニルハプテン−４（４−［Ｎ−（２−クロロベンゾイ
ル）−Ｎ−（３−イソプロポキシフェニル）アミノ］ブ
タン酸）（３）を得た。

【０１１６】

【表６】¹Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−Ｄ₆，ｐｐｍ） １.１０−１.１５ （６Ｈ，ｍ） １.７１−１.８０ （２Ｈ，ｍ） ２.２９−２.３４ （２Ｈ，ｍ） ３.８５ （２Ｈ，ｂｒ） ４.４３−４.４６ （１Ｈ，ｍ） ６.６４−６.６９ （１Ｈ，ｍ） ６.７４−６.７９ （２Ｈ，ｍ） ７.０５−７.２９ （５Ｈ，ｍ） １２.０９ （１Ｈ，ｂｒ）

【０１１７】実施例７ メプロニルハプテン−５の合成

【化２１】 （１）エチル ６−［Ｎ−（２−クロロベンゾイル）−
Ｎ−（３−イソプロポキシフェニル）アミノ］ヘキサノ
エートの合成 Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド４０ｍｌに２−クロロ−
３'−イソプロポキシベンズアニリド（１）（特開昭５
２−１３３９３９）２.９ｇ（１０ｍｍｏｌ）および６
０％水素化ナトリウム０.４４ｇ（１１ｍｍｏｌ）を加
え、室温で１５分間、６０℃で３０分間撹拌した。この
混合物にエチル ６−ブロモヘキサン酸エステル２.７
ｇ（１２ｍｍｏｌ）を室温下に加えて、１２０℃で５時
間撹拌反応させた。この反応混合物を室温まで冷却後、
水５０ｍｌを加え、トルエンで抽出した。トルエン層を
水洗いし、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、トルエンを
留去した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ｎ−
ヘキサン：酢酸エチル＝４：１）で精製し、４.１ｇ
（収率９５％）のエチル ６−［Ｎ−（２−クロロベン
ゾイル）−Ｎ−（３−イソプロポキシフェニル）アミ
ノ］ヘキサノエート（２）を得た。

【０１１８】（２）メプロニルハプテン−５（６−［Ｎ
−（２−クロロベンゾイル）−Ｎ−（３−イソプロポキ
シフェニル）アミノ］ヘキサン酸）の合成 エチル ６−［Ｎ−（２−クロロベンゾイル）−Ｎ−
（３−イソプロポキシフェニル）アミノ］ヘキサノエー
ト（２）１.９ｇ（４.４ｍｍｏｌ）をエタノール５０ｍ
ｌに溶解し、この溶液に水１０ｍｌに溶解した苛性ソー
ダ１.０ｇ（２５ｍｍｏｌ）を加え、室温下に１時間撹
拌した。反応混合物を濃縮し、残渣を水５０ｍｌに溶解
した。この溶液に５Ｎの塩酸を徐々に加えて酸性にし、
酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル層を水洗いし、無水
硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧下に濃縮した。残渣を
シリカゲルクロマトグラフィー（酢酸エチル：エタノー
ル＝４：１）で精製し、１.６ｇ（収率８９％）のメプ
ロニルハプテン−５（６−［Ｎ−（２−クロロベンゾイ
ル）−Ｎ−（３−イソプロポキシフェニル）アミノ］ヘ
キサン酸）（３）を得た。

【０１１９】

【表７】¹Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−Ｄ₆，ｐｐｍ） １.４０ （６Ｈ，ｄ） １.３３−１.３８ （２Ｈ，ｍ） １.４８−１.５３ （４Ｈ，ｍ） ２.２０ （２Ｈ，ｔ） ３.８２ （２Ｈ，ｂｒ） ４.２３ （１Ｈ，ｑ） ６.６７ （１Ｈ，ｄ） ６.７６−７.０８ （２Ｈ，ｍ） ７.１０−７.３０ （５Ｈ，ｍ） １２.００ （１Ｈ，ｂｒ）

【０１２０】実施例８ 免疫用抗原の作製 免疫原としてフルトラニルまたはメプロニル誘導体（ハ
プテン）とそれぞれ牛血清アルブミン（ＢＳＡ）または
スカシガイヘモシアニン（ＫＬＨ）との結合体を混合酸
無水物法により作製した。実施例１から７によって作製
された７種類のハプテン化合物のそれぞれ１２ｍｇを無
水ジオキサン １ｍｌに溶解した後、Ｎ−メチルモルフ
ォリン２５μｌを添加し室温にて１５分間攪拌した。次
にクロロ蟻酸イソブチル １０μｌを添加し、室温にて
２０分間攪拌した（以下これをＡ液とする）。

【０１２１】一方、蒸留水 ２ｍｌにＢＳＡまたはＫＬ
Ｈを４０ｍｇ溶解し、０.５Ｍ水酸化ナトリウムでｐＨ
７.０〜７.５に調整した後、無水ジオキサンを１.３ｍ
ｌ加え再度ｐＨ７.０〜７.５に調整したＡ液をｐＨ７.
０〜７.５になるように調整しながら滴下し、１０℃に
て４時間反応させた。反応終了後、蒸留水にて透析し、
その後凍結乾燥をおこない、免疫用抗原を得た。このよ
うにして得られた結合体のうち、実施例１−３で得られ
たハプテン化合物を用いて作製された３種類のフルトラ
ニルハプテン−ＢＳＡ結合体及びメプロニルハプテン−
ＫＬＨ結合体を免疫用抗原として用いた。

【０１２２】実施例９ スクリーニング用抗原の作製 スクリーニング用抗原として実施例８と同様の方法によ
り、３種類のフルトラニルハプテン−ウサギ血清アルブ
ミン（ＲＳＡ）結合体、及びメプロニルハプテン−ウシ
血清アルブミン（ＢＳＡ）結合体を得た。

【０１２３】実施例１０ 免疫感作 免疫用抗原として得られた３種類のハプテン−ＢＳＡお
よびＫＬＨ結合体について、それぞれマウスに免疫をお
こなった。免疫用抗原 ５０μｇを １４５ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ−１０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７.４：以下、Ｐ
ＢＳと略）１００μｌに溶解し、等量のフロイント完全
アジュバントと混合した後、Ｂａｌｂ／ｃマウスに接種
した。２週間及び４週間後にフロイント不完全アジュバ
ントを用いて調製した免疫用抗原を、前記と同様の操作
によりマウスに追加免疫をおこなった。また、６週間目
にはＰＢＳに溶解した免疫抗原をマウスの尾静脈に追加
免疫した。

【０１２４】実施例１１ 抗血清による測定 フルトラニルハプテンーＲＳＡ結合体またはメプロニル
ハプテン−ＢＳＡ結合体の溶液（０.１μｇ／ｍｌ）を
５０μｌ／ウェルにて９６ウェルプレートにコーティン
グした。洗浄の後、４倍に希釈したブロックエース
（「Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ」：雪印乳業製 コードＮｏ．
ＵＫ−２５Ｂ）でブロッキングした後、抗血清希釈液と
各種濃度のフルトラニルまたはメプロニルを含む ２０
％メタノール溶液とを等量混合し、その５０μｌをウェ
ルにいれ、室温にて１時間反応させた。

【０１２５】反応終了後、ＰＢＳにて５回洗浄の後、１
０倍希釈のブロックエースを用いて、２０００倍希釈し
たペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧヤギ抗体（Ｔａ
ｇｏ社製）を５０μｌずつ各ウェルにて１時間室温にて
反応させる。

【０１２６】さらに反応終了後、ＰＢＳにて５回洗浄の
後、２ｍｇ／ｍｌオルトフェニレンジアミン（ＯＰ
Ｄ）、及び０.０２％過酸化水素を含む０.１Ｍリン酸ク
エン酸緩衝液（ｐＨ５.０）を５０μｌずつ各ウェルに
いれ室温にて１０分間放置し、発色させた。

【０１２７】反応後、１Ｎ硫酸５０μｌを各ウェルに加
え、反応を停止させた後、４９０ｎｍの吸光度を測定し
た。その１例を図１に示す。

【０１２８】抗血清（ポリクローナル抗体）を使用する
ことにより、例えばフルトラニルの量を０.０１〜１０
０μｇ／ｍｌまで測定することができた。

【０１２９】実施例１２ ハイブリドーマ細胞の作製 実施例１０につづき、血清中の抗フルトラニルまたはメ
プロニル抗体の活性が高くなったマウスの脾臓細胞と、
マウスミエローマ細胞（ＳＰ２／０−Ａｇ１４）とをそ
れぞれポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法、または大
河内悦子ら、実験医学 ５．１３１５−１９，１９８７
に記載されている電気処理（電気融合）法にて細胞融合
をおこなった。細胞増殖が認められた培養上清液につい
て以下の方法でフルトラニルまたはメプロニルに対する
抗体活性を調べた。

【０１３０】フルトラニルまたはメプロニルハプテン化
合物ーＲＳＡ結合体の溶液（０.１μｇ／ｍｌ）を５０
μｌ／ウェルにて９６ウェルプレートにコーティングし
た。洗浄の後、４倍に希釈したブロックエース（「Ｂｌ
ｏｃｋ Ａｃｅ」：雪印乳業製コードＮｏ．ＵＫ−２５
Ｂ）でブロッキングした後、培養上清液 ５０μｌを各
ウェルにいれ、室温にて１時間反応させた。

【０１３１】反応終了後、ＰＢＳにて５回洗浄の後、１
０倍希釈のブロックエースを用いて、２０００倍希釈し
たペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧヤギ抗体（Ｔａ
ｇｏ社製）を５０μｌずつ各ウェルにて１時間室温にて
反応させる。

【０１３２】さらに反応終了後、ＰＢＳにて５回洗浄の
後、２ｍｇ／ｍｌオルトフェニレンジアミン（ＯＰ
Ｄ）、及び０.０２％過酸化水素を含む０.１Ｍ リン酸
クエン酸緩衝液（ｐＨ５.０）を５０μｌずつ各ウェル
にいれ室温にて１０分間放置し、発色させた。

【０１３３】反応後、１Ｎ硫酸 ５０μｌを各ウェルに
加え、反応を停止させた後、４９０ｎｍの吸光度を測定
し、抗体活性が認められたものを選抜した。

【０１３４】次に、選抜された ウェルのフルトラニル
またはメプロニルに対する反応性を実施例１１の方法に
従って調べ、目的の抗体を産生している細胞について限
界希釈法を用いたクローニングをおこなった。

【０１３５】その結果、抗フルトラニル抗体または抗メ
プロニル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株としてク
ローン化した。その一部である２Ａ７−１−１及び３Ａ
１４−１−１、ＭＰＮ２−４３を、それぞれ平成８年６
月５日、平成８年６月５日、平成８年５月３０日にそれ
ぞれ寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１５６７０、ＦＥＲＭＰ−
１５６７１、ＦＥＲＭ Ｐ−１５６６１として工業技術
院生命工学工業研究所（〒３０５ 茨城県つくば市東１
丁目１番３号）に寄託した。

【０１３６】実施例１３ モノクローナル抗体の評価
（その１） 酸アミド系化合物と２Ａ７−１−１抗体と
の反応性 フルトラニルハプテン−１に由来する、クローン化した
ハイブリドーマ２Ａ７−１−１の産生するモノクローナ
ル抗体２Ａ７−１−１について、その培養上清を用いて
実施例１１に記載した方法を用いて吸光度を調べ、他の
酸アミド系化合物に対する反応性について調べた。この
結果を図２に示す。図２より、この抗体はフルトラニル
に対して特異的に反応した。具体的には、抗体２Ａ７−
１−１を使用してフルトラニルの量を０.０１−１００
ｎｍｏｌ／ｍｌの範囲で測定できた。

【化２２】

【０１３７】実施例１４ モノクローナル抗体の評価
（その２） 酸アミド系化合物と３Ａ１４−１−１抗体
との反応性 フルトラニルハプテンー２に由来する、クローン化した
ハイブリドーマ３Ａ１４−１−１の産生するモノクロー
ナル抗体３Ａ１４−１−１ついて、実施例１３と同様に
他の酸アミド系化合物に対する反応性について調べた。
この結果を図３に示す。図３より、この抗体はフルトラ
ニル、メプロニル、メベニル、ベノダニルに対して反応
し、測定できることを確認した。具体的には、３Ａ１４
−１−１を使用して０.００１−１０ｎｍｏｌ／ｍｌの
フルトラニル、０.０１−１００ｎｍｏｌ／ｍｌのメプ
ロニル、０.０１−１００ｎｍｏｌ／ｍｌのベノダニル
および１−１００ｎｍｏｌ／ｍｌのメベニルを測定でき
た。

【０１３８】実施例１５ フルトラニルハプテン化合物
と西洋わさびペルオキシダーゼ(HRP)との結合体作製 直接競合阻害法をおこなうために必要なプローブ結合フ
ルトラニルハプテンを作製するため、活性化エステル法
を用いてフルトラニルハプテン化合物とＨＲＰとの結合
をおこなった。

【０１３９】フルトラニルハプテン化合物−１,２それ
ぞれを、０.２ｍｍｏｌ秤量し、無水ジメチルホルムア
ミド（ＤＭＦ）１ｍｌに溶解した。次に N-ヒドロキシ
スクシンイミド０.２ｍｍｏｌ、ジシクロヘキシルカル
ボジイミド０.２ｍｍｏｌを加え、３時間室温にて攪拌
し、反応させた。

【０１４０】反応後、遠心にて沈殿物と上清に分離し、
あらかじめ準備しておいたＰＢＳ２.５ｍｌとＤＭＦ０.
５ｍｌを混ぜ合わせた溶液に ＨＲＰ２５ｍｇを溶解し
た溶液に遠心上清液１２５μｌを加え、4℃にて一晩攪
拌し反応させた。反応終了後、ＨＲＰ結合フルトラニル
ハプテンをPBSによる透析もしくは脱塩カラムによって
精製した。

【０１４１】実施例１６ 直接競合阻害法によるフルト
ラニルの測定 実施例１２で得られたハイブリドーマ細胞（２Ａ７−１
−１）をマウスの腹腔に移植し、１０−１５日後に得ら
れた腹水を採取し、硫安分画法によりモノクローナル抗
体を分取し、以下の試験法にてフルトラニルを測定し
た。

【０１４２】それぞれのモノクローナル抗体溶液（１０
μｇ／ｍｌ）を ５０μｌ／ウェルで９６ウェルプレー
トに加え、４℃で一晩静置し、翌日４倍希釈したブロッ
クエースでブロッキングした後、フルトラニル及び実施
例１５で作製した適度に希釈されたＨＲＰ結合フルトラ
ニルハプテンー１またはＨＲＰ結合フルトラニルハプテ
ンー２を含む１０％メタノール−ＰＢＳ溶液を５０μｌ
／ウェルで加え、２５℃１時間静置した。

【０１４３】反応後、ＰＢＳを用いて５回洗浄し、２ｍ
ｇ／ｍｌのＯＰＤ、０.０２％の過酸化水素を含む０.１
Ｍ リン酸クエン酸緩衝液（ｐＨ５.０）を ５０μｌ
／ウェル加え、室温にて１０分間静置し、発色させた。
発色後、１Ｎ硫酸を５０μｌ／ウェル加えて反応を停止
し、４９０ｎｍの吸光度を測定した。その結果を図４に
示す。直接競合法においても、フルトラニルを測定する
ことができ、その測定範囲は ０.００１−１０μｇ/ｍ
ｌであった。

【０１４４】実施例１７ メプロニルハプテン化合物と
ＨＲＰとの結合体作製 実施例８と同様な混合酸無水物法により実施例３で作製
したメプロニルハプテン−１とＨＲＰの結合体を作製し
た。１ｍｇのメプロニルハプテン−１を無水ジオキサン
０.２ｍｌに溶解した後、トリ−Ｎ−ブチルアミン ０.
５μｌ，クロロギ酸イソブチル０.３μｌを添加し、１
０−１２℃にて３０分間撹拌した。（以下、これをＡ液
とする） 一方、０.５％ ＮａＨＣＯ₃をＮａＯＨでｐＨ９.４に調
整した溶液１ｍｌにＨＲＰ５ｍｇを溶解し、Ａ液をこの
中に滴下した。４℃にて２時間撹拌し、さらにグリシン
を添加して３０分間撹拌することにより反応を終了させ
た。反応物をＰＢＳにて透析することにより、精製ＨＲ
Ｐ結合メプロニルハプテンを得た。

【０１４５】実施例１８ モノクローナル抗体の評価
酸アミド系化合物とＭＰＮ２−４３抗体との反応性 メプロニルハプテン−１に由来する、クローン化したハ
イブリドーマＭＰＮ２−４３の産生するモノクローナル
抗体ＭＰＮ２−４３について実施例１６と同様の方法を
用いて酸アミド系化合物等に対する反応性について調べ
た。ただし、実施例１７で作製したＨＲＰ結合メプロニ
ルハプテンを用いた。この結果を図５に示す。図５よ
り、この抗体はフルトラニル、ベノダニル、メベニルに
対しても反応することを確認した。

【０１４６】実施例１９ 直接競合阻害法によるメプロ
ニルの測定 モノクローナル抗体ＭＰＮ２−４３について、実施例１
８と同様にして、メプロニルに対する反応性を調べた。
この結果を図６に示す。モノクローナル抗体ＭＰＮ２−
４３は、直接結合阻害ＥＬＩＳＡ法で、メプロニルの量
を約０.０１−１０ｎｇ／ｍｌの範囲で測定できた。

【０１４７】実施例２０ モノクローナル抗体の評価
酸アミド系化合物とＭＰＮ２−４２抗体との反応性 実施例８において作製された、メプロニルハプテン−３
とＫＬＨとの結合体を免疫用抗原として用い、実施例９
−１２と同様の方法により、スクリーニング用抗原の作
製、免疫感作、抗血清による測定及びハイブリドーマ細
胞の作製を行い、クローン化したハイブリドーマＭＰＮ
２−４２の産生するモノクローナル抗体ＭＰＮ２−４２
を得た。この抗体を用いて、実施例１８と同様の方法に
より酸アミド系化合物に対する反応性を調べた。

【０１４８】この結果を図７に示す。図７より、この抗
体は、メプロニルを始めフルトラニル、ベノダニルおよ
びメベニルに対しても反応性を有することが確認され
た。

【０１４９】実施例２１ 直接競合阻害法によるメプロ
ニルの測定 モノクローナル抗体２−４２について、実施例２０と同
様にして、メプロニルに対する反応性を調べた。この結
果を図８に示す。モノクローナル抗体ＭＰＮ２−４２は
直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法で、メプロニルの量を約０.
１−１００ｎｇ／ｍｌの範囲で測定できることがわかっ
た。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、マウス抗血清を用いたフルトラニル
の測定を示す。

【図２】 図２は、本発明のモノクローナル抗体２Ａ７
−１−１による酸アミド系化合物の測定を示す。

【図３】 図３は、本発明のモノクローナル抗体３Ａ１
４−１−１による酸アミド系化合物の測定を示す。

【図４】 図４は、モノクローナル抗体２Ａ７−１−１
の直接競合阻害法によるフルトラニルの測定を示す。

【図５】 図５は、本発明のモノクローナル抗体ＭＰＮ
２−４３による酸アミド系化合物等の測定を示す。

【図６】 図６は、モノクローナル抗体ＭＰＮ２−４３
の直接競合阻害法によるメプロニルの測定を示す。

【図７】 図７は、本発明のモノクローナル抗体ＭＰＮ
２−４２による酸アミド系化合物の測定を示す。

【図８】 図８は、モノクローナル抗体ＭＰＮ２−４２
の直接競合阻害法によるメプロニルの測定を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ 33/577 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 面田 内記 東京都港区浜松町１丁目27番14号 株式 会社環境免疫技術研究所内 (72)発明者 宗像 浩 東京都港区浜松町１丁目27番14号 株式 会社環境免疫技術研究所内 (72)発明者 菅野 恒博 神奈川県鎌倉市手広1111番地 株式会社 東レリサーチセンター内 (72)発明者 香川 康浩 東京都港区浜松町１丁目27番14号 株式 会社環境免疫技術研究所内 (72)発明者 渡辺 和明 東京都港区浜松町１丁目27番14号 株式 会社環境免疫技術研究所内 (56)参考文献 特開 平６−239898（ＪＰ，Ａ) 特開 平１−294698（ＪＰ，Ａ) 特表 平９−500874（ＪＰ，Ａ) 国際公開95／3296（ＷＯ，Ａ１) Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅ ｍ．，Ｖｏｌ．33，Ｎｏ．３（1985) ｐ．528−ｐ．530 農薬ハンドブック1992年版編集委員会 編、農薬ハンドブック1992年版、平成４ 年、社団法人日本植物防疫協会発行、第 544頁 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C07C 233/75,233/83 C07K 16/44 C12N 5/10 C12N 15/02 C12P 21/08 G01N 33/53 G01N 33/577 ＣＡ（ＳＴＮ) ＣＡＯＬＤ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims (11)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】以下の式（Ｉ）： 【化１】 ［式中、 Ｒ₁は、所望により１ないし４個の低級アルキル基、ハ
   ロゲン原子、トリフルオロメチル基、ヒドロキシ基また
   はカルボキシル基で置換されていてもよいベンゼン環で
   あり、 Ｒ₃は、水素原子、ヒドロキシ基またはハロゲン原子で
   あり；そしてｎは、１−５の整数である］で表される構
   造を有する、ハプテン化合物。
2. 【請求項２】請求項１に記載の式において、Ｒ₁が２位
   がメチル基、トリフルオロメチル基または塩素原子で置
   換されたベンゼン環であり、そしてＲ₃がヒドロキシ基
   である、請求項１に記載のハプテン化合物。
3. 【請求項３】請求項１または２に記載のハプテン化合物
   と高分子化合物との結合体。
4. 【請求項４】請求項３に記載の結合体を抗原として用い
   ることにより製造された、以下の式（ＩＩ）： 【化２】 ［式中、 Ｒ₁は、請求項１において定義した通りであり；そして
   Ｒ₂は、所望により１個ないし３個の、低級アルキル
   基、ハロゲン原子、ハロゲン化アルキル基、アルコキシ
   基またはハロゲン化アルコキシ基で置換されていてもよ
   い、ベンゼン環である］で表される構造を有する化合物
   と反応する抗体。
5. 【請求項５】モノクローナル抗体である、請求項４に記
   載の抗体。
6. 【請求項６】数種の酸アミド系化合物と反応することを
   特徴とする、請求項４または５に記載の抗体。
7. 【請求項７】３Ａ１４−１−１またはＭＰＮ２−４３で
   ある、請求項４ないし６のいずれか１項に記載の抗体。
8. 【請求項８】請求項１または２に記載のハプテン化合物
   に高分子化合物を結合させることにより抗原を作製し、
   当該抗原を用いることにより式（ＩＩ）： 【化３】 ［式中、 Ｒ₁は、請求項１において定義した通りであり；そして
   Ｒ₂は、所望により１個ないし３個の、低級アルキル
   基、ハロゲン原子、ハロゲン化アルキル基、アルコキシ
   基またはハロゲン化アルコキシ基で置換されていてもよ
   い、ベンゼン環である］で表される構造を有する化合物
   と反応する抗体を作ることを特徴とする、請求項４ない
   し７のいずれか１項に記載の抗体の製造方法。
9. 【請求項９】請求項４ないし７のいずれか１項に記載の
   抗体を産生するハイブリドーマ。
10. 【請求項１０】寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１５６６１また
    はＦＥＲＭ Ｐ−１５６７１で寄託されている、請求項
    ９に記載のハイブリドーマ。
11. 【請求項１１】請求項１若しくは２に記載のハプテン化
    合物、または請求項４ないし７のいずれか１項に記載の
    抗体を利用することを特徴とする、式（ＩＩ）で表され
    る化合物の免疫化学的測定方法。