JP2001002628A - カルプロパミドのハプテン化合物、抗体及び測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明は、カルプロパミド類縁化合物のハプ
テン化合物、抗体及び測定方法を提供することを目的と
する。 【解決手段】 本発明のハプテン化合物は、カルプロパ
ミド類縁化合物又はその部分にスペーサーアーム及び結
合のための官能基を共有結合させた構造を有する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、（１ＲＳ，３Ｓ
Ｒ）−２，２−ジクロロ−Ｎ−［１−（４−クロロフェ
ニル）エチル］−１−エチル−３−メチルシクロプロパ
ンカルボキサミド（以下、本明細書中「カルプロパミ
ド」と言う）のハプテン化合物、抗原、抗体及びそのフ
ラグメントに関する。

【０００２】本発明はさらに、前記抗原、抗体及びその
フラグメントを用いた免疫学的測定方法に関する。

【０００３】

【従来の技術】カルプロパミドは、以下の式（３）：

【０００４】

【化３】

【０００５】で表される構造を有する化合物であり、主
にイネいもち病用の薬剤として用いられている。イネい
もち病はイネの病害の中で最も被害が大きく、米の生産
者にとって重要な病害である。薬剤としては１９６０年
代以降抗生物質、有機リン剤、メラニン生合成阻害剤、
抵抗性誘導剤などが登録されている。カルプロパミドは
作業の省力化をめざして研究開発された薬剤であり、育
苗箱施用でイネいもち病に長期間優れた効果を示し、防
除回数を減らすことが可能である。具体的には２ｇ活性
成分／育病箱の１回の施用で穂いもちまで効果を示すこ
とが確認されており注目されている。また、省力化のた
め他の殺虫剤との混合剤として使用されうる。

【０００６】カルプロパミドはイネいもち病菌に対する
抗菌力はほとんどないが、付着器のメラニン化を阻害す
ることで付着器の強度を低下させ、イネ体内への侵入を
阻止する。トリシクラゾールなど従来のメラニン生合成
阻害剤は還元酵素反応阻害であるが、カルプロパミドは
脱水素反応の阻害であり、作用点が異なっている。ま
た、いもち病菌に感染したイネにファイトアレキシンを
誘導するという報告もある。カルプロパミド剤は胞子形
成病斑に対して胞子の離脱阻害効果があり、２次感染を
防ぐ（新農薬の開発展望 第５２頁−第５５頁、１９９
７年１１月２８日（株）シーエムシー 発行）。

【０００７】近年、土壌、水、大気等の環境中での残留
農薬や、最近特に増加してきた輸入農産物のポストハー
ベスト農薬等の残留に大きな社会的関心が寄せられてい
る。カルプロパミドについては、環境庁長官個別設定の
基準値が米で１ｐｐｍ等定められている。さらに水質に
関しても、水質汚濁に係る登録保留基準値が０．４ｍｇ
／ｌと定められている（改訂３版 農薬登録保留基準ハ
ンドブック 第１９９頁−第２０２頁、１９９８年９月
２５日、化学工業日報社 発行）。よって、環境や食品
に関する安全確保のためには、これらに含有される、カ
ルプロパミドの量を迅速かつ正確に測定することが必要
である。

【０００８】従来、例えば農作物中のカルプロパミドは
米等から抽出し、精製した後、ガスクロマトグラフィー
（ＧＣ）により分析されてきた。即ち、例えば、試料を
アセトンで抽出し、ヘキサンに転溶した後、ヘキサン−
酢酸エチルを溶媒として用いたケイ酸マグネシウムカラ
ムクロマトグラフィーで精製後、ＧＣで測定する方法等
が採用されている。これらの方法は、試料の調製が煩雑
で多大の手順と時間を必要とし、分析に熟練を要するこ
と、並びに、測定装置や設備等に高額の費用を必要とす
る等の問題点がある。カルプロパミドの測定は短時間で
膨大な数の試料の分析結果を出す必要があり、精度面だ
けでなく、簡便性、迅速性及び経済性をも具備した新規
測定方法が要求されてきている。

【０００９】免疫学的測定方法は、抗体が抗原を特異的
に認識する抗原抗体反応に基づいて抗原や抗体の検出を
行う方法であり、その優れた精度、簡便性、迅速性、経
済性から近年注目を集めてきている。免疫学的測定方法
においては検出方法として非常に多種の標識、例えば、
酵素、放射性トレーサー、化学発光あるいは蛍光物質、
金属原子、ゾル、ラテックス及びバクテリオファージが
適用されてきた。

【００１０】免疫学的測定方法の中でも、酵素を使用す
る酵素免疫測定法（ＥＩＡ）は経済性・利便性から特に
優れたものとして広く使用されるに至っている。酵素免
疫測定法についての優れた論評が、Ｔｉｊｓｓｅｎ
Ｐ，“Ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｎｄ ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ
ｅｎｚｙｍｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ” ｉｎＬ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ａｍｓｔｅｒ
ｄａｍ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｏｘｆｏｒｄ ＩＳＢＮ
０−７２０４−４２００−１（１９９０）に記載され
ている。

【００１１】一般に、分子量が大きな分子については、
それ以上修飾することなく動物に接種することにより、
適当な免疫反応を惹起し、抗原を認識する抗体を産生さ
せることができる。しかし、カルプロパミドのような低
分子化合物は通常動物に接種したとき免疫応答を引き出
すことができない。これらの分子は免疫原性を有する高
分子化合物（タンパク質や多糖類など）に結合させるこ
とによって初めて一団のエピトープとして行動し、Ｔ細
胞受容体の存在下で免疫応答を起こし、その結果、一群
のＢリンパ球により抗体が産生される。このように高分
子化合物と結合させて初めて免疫原性を生じる分子を総
称して「ハプテン」と言う。

【００１２】しかし、低分子化合物を高分子化合物と結
合させたものを抗原としても、得られた抗体は望む分子
を認識しないか、あるいはごく低い親和性しかもたない
場合がしばしばある。そのため、一般に低分子化合物そ
のものではなく、結合に利用できる官能基と共にスペー
サーアーム（結合手）を導入したものをハプテンとして
使用する必要がある。しかしその場合に、結合手／官能
基の配置、結合手の大きさ等の全ての問題を考慮して導
入が適切に行われたものを使用しないと、好ましい抗体
は得られない。適切な導入は個々の分子に応じて工夫し
なければならない。

【００１３】カルプロパミドについては、その必要性が
非常に高かったにもかかわらず、適切な抗体はもとよ
り、そのような抗体を作製するためのハプテンも本発明
前には得られていなかった。

【００１４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、カルプロパ
ミドおよびその類縁化合物（以下、文脈により「カルプ
ロパミド類縁化合物」あるいは単に「カルプロパミド」
という）に反応する新規な抗体若しくはそのフラグメン
ト、及びその作製方法を提供することを目的とする。
尚、本明細書において抗体の「フラグメント」とは、抗
原と結合可能な抗体の一部分、例えばＦ_ab断片等を意味
する。

【００１５】本発明はその一態様において、カルプロパ
ミド類縁化合物に反応性を有するモノクローナル抗体を
提供する。本発明は、また、カルプロパミド類縁化合物
に反応性を有する新規な抗体を作製するための抗原を構
成するハプテン化合物（カルプロパミドハプテン）を提
供することを目的とする。

【００１６】本発明は、さらに、カルプロパミドハプテ
ンと高分子化合物との結合体を提供することを目的とす
る。本発明は、さらにまた、前記抗体又はそのフラグメ
ントを産生するハイブリドーマを提供することを目的と
する。

【００１７】本発明は、さらに、前記抗体若しくはその
フラグメント及び／又は前記カルプロパミドハプテンと
高分子化合物との結合体を使用することを含む、カルプ
ロパミド類縁化合物の免疫学的測定方法を提供すること
を目的とする。

【００１８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、鋭意研究
を重ねた結果、カルプロパミド類縁化合物又はその部分
にスペーサーアーム及び高分子化合物との結合に利用で
きる官能基を導入した、カルプロパミドの誘導体をハプ
テンとして使用することにより、前記化合物に反応性を
有する抗体を得ることに成功し、本発明の完成に至っ
た。

【００１９】本発明の対象となるカルプロパミド類縁化
合物は、以下の式（２）：

【００２０】

【化４】

【００２１】［式（２）中、Ｒ¹、Ｒ²およびＲ³は、同
一であっても異なっていてもよい、枝分かれしていても
よい炭素数１ないし３のアルキル基であり；そして
Ｘ¹、Ｘ²およびＸ³は、同一であっても異なっていても
よい、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩから選択されるハロゲン原
子である］で表される構造を有する化合物である。

【００２２】本発明はその一態様として、特に、以下の
式（３）：

【００２３】

【化５】

【００２４】で表される構造を有するカルプロパミドを
対象とする。本発明の抗体は、例えば、カルプロパミド
類縁化合物の部分にスペーサーアーム及び結合に利用で
きる官能基を導入した誘導体をハプテンとして適当な高
分子化合物と結合させたものを抗原として用いることに
よって得ることができる。例えば、以下の式（１）：

【００２５】

【化６】

【００２６】［式（１）中、Ｒ¹、Ｒ²およびＲ³は、同
一であっても異なっていてもよい、枝分かれしていても
よい炭素数１ないし３のアルキル基であり；Ｘ¹および
Ｘ²は、同一であっても異なっていてもよい、Ｆ、Ｃ
ｌ、Ｂｒ又はＩから選択されるハロゲン原子であり；そ
してｎは、１ないし１０の整数である］で表される構造
を有する化合物を、抗体作製のためのハプテンとして使
用する。

【００２７】式（１）中、好ましくは、Ｒ¹およびＲ³が
メチル基であり、Ｒ²がエチル基であり、そしてがＸ¹お
よびＸ²がＣｌである。好ましくは、ｎは５である。本
発明は、前記ハプテン化合物、ハプテン化合物と高分子
化合物との結合体、カルプロパミド類縁化合物に反応す
る抗体及びその作製方法、並びに該ハプテン化合物又は
該抗体を用いるカルプロパミド類縁化合物の免疫学的測
定方法に関する。カルプロパミドハプテンの作製 式（１）で表されるカルプロパミドハプテンは、公知の
方法に従って製造することができる。限定するわけでは
ないが、例えば以下のような方法を用いることができ
る。

【００２８】まず、有機溶媒中、以下の式（Ｚ１）：

【００２９】

【化７】

【００３０】［式（Ｚ１）中、Ｒ¹、Ｒ²、Ｘ¹およびＸ²
は先に定義した通りである］で表される構造を有する化
合物に、溶媒中又は無溶媒で塩化チオニル等のハロゲン
化チオニルを加えて還流を行う。還流は好ましくは、１
時間ないし５時間行う。

【００３１】有機溶媒としては、クロロホルム、ヘキサ
ン、ペンタン、ベンゼン、ジクロロメタン、１，２−ジ
クロロエタン等、又はこれらの混合溶媒を用いることが
できる。

【００３２】その後、濃縮残渣を有機溶媒に溶解して、
塩基の存在下、以下の式（Ｚ２）：

【００３３】

【化８】

【００３４】［式（Ｚ２）中、Ｐ¹は、水酸基の保護基
であり；そしてＲ³は先に定義した通りである］で表さ
れる構造を有する化合物と反応させて、以下の式（Ｚ
３）：

【００３５】

【化９】

【００３６】［式（Ｚ３）中、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｘ¹、Ｘ
²およびＰ¹は先に定義した通りである］で表される構造
を有する化合物を合成する。

【００３７】水酸基の保護基Ｐ¹は、公知の保護基でよ
く、例えば、アセチル基、メチル基、エチル基、ｔｅｒ
ｔ−ブチル基、ベンジル基、ｐ−メトキシベンジル基、
３，４−ジメトキシベンジル基、トリクロロエチル基等
を挙げることができる。

【００３８】式（Ｚ３）の化合物のための有機溶媒とし
ては、例えば、アセトニトリル、アセトン、ヘキサン、
ペンタン、ベンゼン、トルエン、ジクロロメタン、クロ
ロホルム、１，２−ジクロロエタン、酢酸エチル、ジグ
リム、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ヘキサメチルリ
ン酸トリアミド等、又はこれらの混合溶媒を用いること
ができる。塩基としては、例えば、炭酸カリウム、炭酸
ナトリウム、炭酸リチウム、炭酸水素カリウム、炭酸水
素ナトリウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、ナ
トリウムメチラート、ナトリウムエチラート、トリエチ
ルアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、リチウムジイソ
プロピルアミド等を用いることができる。

【００３９】反応は、０℃から溶媒の沸点の温度、好ま
しくは室温から１００℃で、１０分から５時間、好まし
くは３０分から２時間行う。次に、式（Ｚ３）の化合物
から水酸基の保護基を除去することにより、以下の式
（Ｚ４）：

【００４０】

【化１０】

【００４１】［式（Ｚ４）中、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｘ¹およ
びＸ²は先に定義した通りである］で表される構造を有
する化合物を得る。水酸基の保護基の除去は、酸加水分
解、アルカリ加水分解等の公知の方法で行うことができ
る。

【００４２】すなわち、酸加水分解の場合は、式（Ｚ
３）の化合物を、好ましくは酢酸、蟻酸、ベンゼン、ジ
クロロメタン、１，２−ジクロロエタン等の有機溶媒に
溶解し、次いで塩酸、硫酸、トリフルオロ酢酸、トリフ
ルオロメタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸等を
加えて、０℃から溶媒の沸点の温度、好ましくは室温か
ら１５０℃で、５分から１０時間、好ましくは１時間か
ら５時間撹拌反応させることにより式（Ｚ４）の化合物
を得ることができる。

【００４３】また、アルカリ加水分解の場合は、式（Ｚ
３）の化合物を、好ましくはメタノール、エタノール、
テトラヒドロフラン、エチレングリコール等の有機溶媒
に溶解し、次いで炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウ
ム、炭酸カリウム、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム
又は水酸化カリウム等の水溶液等を加えて、０℃から溶
媒の沸点の温度、好ましくは０℃から室温で、５分から
１０時間、好ましくは１時間から２時間撹拌反応させる
ことにより式（Ｚ４）の化合物を得ることができる。

【００４４】更に、Ｐ¹がベンジル基の場合、除去は水
素による加水素分解によっても行うことができ、また、
Ｐ¹がメチル基の場合、三臭化ホウ素、三塩化ホウ素、
塩化アルミニウム等のハロゲン化物で脱メチル化を行
い、式（Ｚ４）の化合物を得ることもできる。

【００４５】次に、式（Ｚ４）の化合物に、有機溶媒
中、塩基の存在下、以下の式（Ｚ５）：

【００４６】

【化１１】

【００４７】［式（Ｚ５）中、Ｌは、Ｃｌ、Ｂｒ、およ
びＩから選択されるハロゲン原子であり；Ｐ²はカルボ
キシル基の保護基であり；そしてｎは先に定義した通り
である］で表される構造を有する化合物を反応させて、
以下の式（Ｚ６）：

【００４８】

【化１２】

【００４９】［式（Ｚ６）中、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｘ¹、Ｘ
²、Ｐ²およびｎは、先に定義した通りである］で表され
る化合物を合成する。

【００５０】反応は、０℃から溶媒の沸点の温度、好ま
しくは室温から１５０℃で、５分から１０時間、好まし
くは３０分から３時間行う。式（Ｚ６）の化合物の合成
のための溶媒としては、例えば、メタノール、エタノー
ル、ベンゼン、トルエン、キシレン、ジクロロメタン、
クロロホルム、四塩化炭素、ジエチルエーテル、テトラ
ヒドロフラン、ジオキサン、アセトン、メチルエチルケ
トン、アセトニトリル、酢酸エチル、ジメチルホルムア
ミド、ジメチルスルホキシド及び水等を用いることがで
きる。塩基としては、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、
水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、ナトリウムメチラ
ート、ナトリウムエチラート等が挙げられる。

【００５１】最後に、式（Ｚ６）の化合物からカルボキ
シル基の保護基Ｐ²を除去することにより、式（１）の
化合物を得ることができる。カルボキシル基の除去は、
式（Ｚ４）の化合物の合成に関して記載した水酸化の保
護基の除去と同様に、アルカリ加水分解、酸加水分解等
の公知の方法で行うことができる。

【００５２】上述したような製造方法によって得られた
化合物を、必要に応じシリカゲルクロマトグラフィー又
は再結晶操作等を行うことにより、さらに高純度の精製
品とすることができる。

【００５３】以下、本発明の抗原、抗体の作製、及び免
疫化学的測定法について説明する。尚、これらの調製は
公知の方法、例えば続生化学実験講座、免疫生化学研究
法（日本生化学会編）等に記載の方法に従って行うこと
ができる。カルプロパミドハプテンと高分子化合物との結合体の作
製 上述のように合成されたカルプロパミドハプテンを適当
な高分子化合物に結合させてから免疫用抗原若しくは固
相化用抗原として使用する。

【００５４】好ましい高分子化合物の例としては、スカ
シガイへモシアニン（以下、「ＫＬＨ」と言う）、卵白
アルブミン（以下、「ＯＶＡ」と言う）、ウシ血清アル
ブミン（以下、「ＢＳＡ」と言う）、ウサギ血清アルブ
ミン（以下、「ＲＳＡ」と言う）などがある。ＫＬＨ及
びＢＳＡが好ましい。

【００５５】カルプロパミドハプテンと高分子化合物と
の結合は、例えば、活性化エステル法（Ａ．Ｅ．ＫＡＲ
Ｕ ｅｔ ａｌ．：Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅ
ｍ．４２ ３０１−３０９（１９９４））、又は混合酸
無水物法（Ｂ．Ｆ．Ｅｒｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．：
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３４ １０９０‐１０９４
（１９５４））等の公知の方法によって行うことができ
る。

【００５６】活性化エステル法は、一般に以下のように
行うことができる。まず、ハプテン化合物を有機溶媒に
溶解し、カップリング剤の存在下にてＮ−ヒドロキシこ
はく酸イミドと反応させ、Ｎ−ヒドロキシこはく酸イミ
ド活性化エステルを生成させる。

【００５７】カップリング剤としては、縮合反応に慣用
されている通常のカップリング剤を使用でき、例えば、
ジシクロヘキシルカルボジイミド、カルボニルジイミダ
ゾール、水溶性カルボジイミド等が含まれる。有機溶媒
としては、例えば、ジメチルスルホキシド（以下、「Ｄ
ＭＳＯ」と言う）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（以
下、「ＤＭＦ」と言う）、ジオキサン等が使用できる。
反応に使用するハプテン化合物とＮ−ヒドロキシこはく
酸イミドのモル比は好ましくは１：１０から１０：１、
より好ましくは１：１から１：１０、最も好ましくは
１：１である。反応温度は、０℃から１００℃、好まし
くは５℃から５０℃、より好ましくは２２℃から２７℃
で、反応時間は５分から２４時間、好ましくは３０分か
ら６時間、より好ましくは１時間から２時間である。

【００５８】カップリング反応後、反応液を高分子化合
物を溶解した溶液に加え反応させると、例えば高分子化
合物が遊離のアミノ基を有する場合、当該アミノ基とハ
プテン化合物のカルボキシル基の間に酸アミド結合が生
成される。反応温度は、０℃から６０℃、好ましくは５
℃から４０℃、反応時間は５分から２４時間、好ましく
は１時間から１６時間である。反応物を、透析、脱塩カ
ラム等によって精製して、カルプロパミドハプテンと高
分子化合物との結合体を得ることができる。

【００５９】一方、混合酸無水物法において用いられる
混合酸無水物は、カルボン酸とハロ蟻酸エステルとの反
応により得られ、これを高分子化合物と反応させること
により目的とするハプテン−高分子化合物結合体が製造
される。この反応は塩基性化合物の存在下に行われる。
塩基性化合物としては、例えば、トリブチルアミン、ト
リエチルアミン、トリメチルアミン、Ｎ−メチルモルホ
リン、ピリジン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、ＤＢＮ、
ＤＢＵ、ＤＡＢＣＯ等の有機塩基、炭酸カリウム、炭酸
ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素ナトリウム等
の無機塩基等が挙げられる。該反応は、通常マイナス２
０℃から１５０℃、好ましくは０℃から１００℃におい
て行われ、反応時間は５分から１０時間、好ましくは５
分から２時間である。得られた混合酸無水物と高分子化
合物との反応は、通常マイナス２０℃から１００℃、好
ましくは０℃から５０℃において行われ、反応時間は５
分から１０時間、好ましくは５分から５時間である。混
合酸無水物法は一般に溶媒中で行われる。溶媒として
は、混合酸無水物法に慣用されているいずれの溶媒も使
用可能であり、具体的にはジオキサン、ジエチルエーテ
ル、テトラヒドロフラン、ジメトキシエタン等のエーテ
ル類、ジクロロメタン、クロロホルム、ジクロロエタン
等のハロゲン化炭化水素類、ベンゼン、トルエン、キシ
レン等の芳香族炭化水素類、酢酸メチル、酢酸エチル等
のエステル類、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチ
ルスルホキシド、ヘキサメチルリン酸トリアミド等の非
プロトン性極性溶媒等が挙げられる。混合酸無水物法に
おいて使用されるハロ蟻酸エステルとしては、例えばク
ロロ蟻酸メチル、ブロモ蟻酸メチル、クロロ蟻酸エチ
ル、ブロモ蟻酸エチル、クロロ蟻酸イソブチル等が挙げ
られる。当該方法におけるハプテンとハロ蟻酸エステル
と高分子化合物の使用割合は、広い範囲から適宜選択さ
れ得る。

【００６０】また、上記と同様の方法により、酵素等の
標識物質をカルプロパミドハプテンに結合させたもの
を、免疫学的測定方法において使用することができる。
標識物質としては、西洋わさびペルオキシダーゼ（以下
「ＨＲＰ」と言う）、アルカリフォスファターゼ等の酵
素、フルオレセインイソシアネート、ローダミン等の蛍
光物質、³²Ｐ、¹²⁵Ｉ等の放射性物質、化学発光物質な
どがある。ポリクローナル抗体の作製 カルプロパミドハプテンと高分子化合物との結合体を使
用して、常法により本発明のポリクローナル抗体を作製
することができる。例えば、カルプロパミドハプテン／
ＢＳＡ結合体をリン酸ナトリウム緩衝液（以下、「ＰＢ
Ｓ」と言う）に溶解し、フロイント完全アジュバント又
は不完全アジュバント、あるいはミョウバン等の補助剤
と混合したものを、免疫用抗原として動物に免疫するこ
とによって得ることができる。免疫される動物としては
当該分野で常用されるものをいずれも使用できるが、例
えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ等を挙げる
ことができる。

【００６１】免疫の際の投与法は、皮下注射、腹腔内注
射、静脈内注射、皮内注射、筋肉内注射のいずれでもよ
いが、皮下注射又は腹腔内注射が好ましい。免疫は１回
又は適当な間隔で、好ましくは１週間ないし５週間の問
隔で複数回行うことができる。

【００６２】免疫した動物から血液を採取し、そこから
分離した血清を用い、カルプロパミドと反応するポリク
ローナル抗体の存在を評価することができる。本発明に
おいてカルプロパミドハプテンと高分子化合物との結合
体を免疫用抗原として得られた抗血清は、後述する間接
競合ＥＬＩＳＡ法において少なくとも約１０ｎｇ／ｍｌ
の濃度でカルプロパミドと反応できる（実施例４）。モノクローナル抗体の作製 カルプロパミドハプテンと高分子化合物との結合体を使
用して、公知の方法により本発明のモノクローナル抗体
を作製することができる。

【００６３】モノクローナル抗体の製造にあたっては、
少なくとも下記のような作業工程が必要である。 （ａ）免疫用抗原として使用するカルプロパミドハプテ
ンと高分子化合物との結合体の作製 （ｂ）動物への免疫 （ｃ）血液の採取、アッセイ、及び抗体産生細胞の調製 （ｄ）ミエローマ細胞の調製 （ｅ）抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合とハ
イブリドーマの選択的培養 （ｆ）目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスク
リーニングと細胞クローニング （ｇ）ハイブリドーマの培養又は動物へのハイブリドー
マの移植によるモノクローナル抗体の調製 （ｈ）調製されたモノクローナル抗体の反応性の測定等 モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作製す
るための常法は、例えば、ハイブリドーマ テクニック
ス（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ），コ
ールド スプリング ハーバー ラボラトリーズ（Ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ，１９８０年版）、細胞組織化学（山下修二ら、日
本組織細胞化学会編；学際企画、１９８６年）に記載さ
れている。

【００６４】以下、本発明のカルプロパミド類縁化合物
に対するモノクローナル抗体の作製方法を説明するが、
これに制限されないことは当業者によって明らかであろ
う。（ａ）−（ｂ）の工程は、ポリクローナル抗体に関
して記述した方法とほぼ同様の方法によって行うことが
できる。

【００６５】（ｃ）の工程における抗体産生細胞はリン
パ球であり、これは一般には脾臓、胸腺、リンパ節、末
梢血液又はこれらの組み合わせから得ることができるが
脾細胞が最も一般的に用いられる。従って、最終免疫
後、抗体産生が確認されたマウスより抗体産生細胞が存
在する部位、例えば脾臓を摘出し、脾細胞を調製する。

【００６６】（ｄ）の工程に用いることのできるミエロ
ーマ細胞としては、例えば、Ｂａｌｂ／ｃマウス由来骨
髄腫細胞株のＰ３／Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）（Ｎａｔ
ｕｒｅ，２５６，４９５−４９７（１９７５））、Ｐ３
／Ｘ６３−Ａｇ８．Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）（Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｔｏｐｉｃｓ．ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎ
ｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８１， １−７（１９８
７））、Ｐ３／ＮＳＩ−１−Ａｇ ４−１（ＮＳ−１）
（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６，５１１−５１９
（１９７６））、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４（Ｓｐ２／０）
（Ｎａｔｕｒｅ， ２７６，２６９−２７０（１９７
８））、ＦＯ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ．Ｍｅｔｈ．，３５，
１−２１（１９８０））、ＭＰＣ−１１、Ｘ６３．６
５３、Ｓ１９４等の骨髄腫株化細胞、あるいはラット由
来の２１０．ＲＣＹ３．Ａｇ １．２．３．（Ｙ３）
（Ｎａｔｕｒｅ， ２７７，１３１−１３３，（１９７
９））等を使用できる。

【００６７】上述したミエローマ細胞をウシ胎児血清を
含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）又はイス
コフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）で継代培養し、融
合当日に約３×１０³以上の細胞数を確保する。

【００６８】（ｅ）の工程の細胞融合は公知の方法、例
えばミルスタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）らの方法（Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，７３，３
（１９８１））等に準じて行うことができる。現在最も
一般的に行われているのはポリエチレングリコール（Ｐ
ＥＧ）を用いる方法である。ＰＥＧ法については、例え
ば、細胞組織化学、山下修二ら（上述）に記載されてい
る。別の融合方法としては、電気処理（電気融合）によ
る方法を採用することもできる（大河内悦子ら、実験医
学 ５．１３１５−１９、１９８７）。その他の方法を
適宜採用することもできる。また、細胞の使用比率も公
知の方法と同様でよく、例えばミエローマ細胞に対して
脾細胞を３倍から１０倍程度用いればよい。

【００６９】脾細胞とミエローマ細胞とが融合し、抗体
分泌能及び増殖能を獲得したハイブリドーマ群の選択
は、例えば、ミエローマ細胞株としてヒポキサンチング
アニンホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損株を使用
した場合、例えば上述のＤＭＥＭやＩＭＤＭにヒポキサ
ンチン・アミノプテリン・チミジンを添加して調製した
ＨＡＴ培地の使用により行うことができる。

【００７０】（ｆ）の工程では、選択されたハイブリド
ーマ群を含む培養上清の一部をとり、例えば後述するＥ
ＬＩＳＡ法により、カルプロパミドに対する抗体活性を
測定する。

【００７１】さらに、測定によりカルプロパミドに反応
する抗体を産生することが判明したハイブリドーマの細
胞クローニングを行う。この細胞クローニング法として
は、限界希釈により１ウェルに１個のハイブリドーマが
含まれるように希釈する方法「限界希釈法」；軟寒天培
地上に撒きコロニーをとる方法；マイクロマニピュレー
ターによって１個の細胞を取り出す方法；セルソーター
によって１個の細胞を分離する「ソータークローン法」
等が挙げられる。限界希釈法が簡単であり、よく用いら
れる。

【００７２】抗体価の認められたウェルについて、例え
ば限界希釈法によりクローニングを１−４回繰り返して
安定して抗体価の得られたものを、抗カルプロパミドモ
ノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株として選択す
る。ハイブリドーマを培養する培地としては、例えば、
ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むＤＭＥＭ又はＩＭＤＭ等
が用いられる。ハイブリドーマの培養は、例えば二酸化
炭素濃度５−７％程度及び３７℃（１００％湿度の恒温
器中）で培養するのが好ましい。

【００７３】（ｇ）の工程で抗体を調製するための大量
培養は、フォローファイバー型の培養装置等によって行
われる。又は、同系統のマウス（例えば、上述のＢａｌ
ｂ／ｃ）あるいはＮｕ／Ｎｕマウスの腹腔内でハイブリ
ドーマを増殖させ、腹水液より抗体を調製することも可
能である。

【００７４】これらにより得られた培養上清液あるいは
腹水液を抗カルプロパミドモノクローナル抗体として使
用することできるが、さらに透析、硫酸アンモニウムに
よる塩析、ゲル濾過、凍結乾燥等を行い、抗体画分を集
め精製することにより抗カルプロパミドモノクローナル
抗体を得ることができる。さらに、精製が必要な場合に
は、イオン交換カラムクロマトグラフィー、アフィニテ
ィークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー
（ＨＰＬＣ）などの慣用されている方法を組合わせるこ
とにより実施できる。

【００７５】以上のようにして得られた抗カルプロパミ
ドモノクローナル抗体は、例えば後述するＥＬＩＳＡ法
などの公知の方法を使用して、サブクラス、抗体価等を
決定することができる。抗体によるカルプロパミド類縁化合物の測定 本発明で使用する抗体によるカルプロパミド類縁化合物
の測定法としては、放射性同位元素免疫測定法（ＲＩＡ
法）、ＥＬＩＳＡ法（Ｅｎｇｖａｌｌ，Ｅ．，Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，７０，４１９−４３
９（１９８０））、蛍光抗体法、プラーク法、スポット
法、凝集法、オクタロニー（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）
等の一般に抗原の検出に使用されている種々の方法
（「ハイブリドーマ法とモノクローナル抗体」、株式会
社Ｒ＆Ｄプラニング発行、第３０頁−第５３頁、昭和５
７年３月５日）が挙げられる。感度、簡便性等の観点か
らＥＬＩＳＡ法が汎用されている。

【００７６】カルプロパミド類縁化合物の測定は、各種
ＥＬＩＳＡ法のうち例えば間接競合ＥＬＩＳＡ法によ
り、以下のような手順により行うことができる。 （ａ）まず、固相化用抗原であるカルプロパミドハプテ
ンと高分子化合物との結合体を担体に固相化する。

【００７７】（ｂ）固相化用抗原が吸着していない固相
表面を抗原と無関係な物質、例えばタンパク質によりブ
ロッキングする。 （ｃ）これに各種濃度のカルプロパミドを含む試料及び
抗体を加え、該抗体を前記固相化抗原及びカルプロパミ
ドに競合的に反応させて、固相化抗原−抗体複合体及
び、カルプロパミド−抗体複合体を生成させる。

【００７８】（ｄ）固相化抗原−抗体複合体の量を測定
することにより、予め作成した検量線から試料中のカル
プロパミドの量を決定することができる。 （ａ）工程において、固相化用抗原を固相化する担体と
しては、特別な制限はなく、ＥＬＩＳＡ法において常用
されるものをいずれも使用することができる。例えば、
ポリスチレン製の９６ウェルのマイクロタイタープレー
トが挙げられる。

【００７９】固相化用抗原を担体に固相化させるには、
例えば、固相化用抗原を含む緩衝液を担体上に載せ、イ
ンキュベーションすればよい。緩衝液としては公知のも
のが使用でき、例えば、リン酸緩衝液を挙げることがで
きる。緩衝液中の抗原の濃度は広い範囲から選択できる
が、通常０．０１μｇ／ｍｌから１００μｇ／ｍｌ程
度、好ましくは０．０５μｇ／ｍｌから５μｇ／ｍｌが
適している。また、担体として９６ウェルのマイクロタ
イタープレートを使用する場合には、３００μｌ／ウェ
ル以下で２０μｌ／ウェルから１５０μｌ／ウェル程度
が望ましい。更に、インキュベーションの条件にも特に
制限はないが、通常４℃程度で一晩インキュベーション
が適している。

【００８０】なお、担体に固相化させる抗原としては、
抗体を作製したカルプロパミドハプテンと高分子化合物
との結合体自体のみならず、式（１）で表される他のハ
プテンと高分子化合物との結合体を固相化抗原として使
用することも可能である。例えば、式（１）においてＲ
¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｘ¹、Ｘ²又はｎが抗体作製用と相違する
化合物を、固相化抗原として使用することもできる。さ
らに、式（１）に含まれない他のカルプロパミド類似化
合物を固相化抗原として使用することも可能である。

【００８１】（ｂ）工程のブロッキングは、抗原（カル
プロパミドハプテンと高分子化合物との結合体）を固相
化した担体において、カルプロパミドハプテン部分以外
に後で添加する抗体が吸着され得る部分が存在する場合
があり、もっぱらそれを防ぐ目的で行われる。ブロッキ
ング剤として、例えば、ＢＳＡやスキムミルク溶液を使
用できる。あるいは、ブロックエース（「Ｂｌｏｃｋ‐
Ａｃｅ」、大日本製薬社製、コードＮｏ．ＵＫ−２５
Ｂ）等のブロッキング剤として市販されているものを使
用することもできる。具体的には、限定されるわけでは
ないが、例えば抗原を固相化した部分にブロッキング剤
を含む緩衝液（例えば、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ溶液）
を適量加え、約４℃で一晩インキュベーションした後、
洗浄液で洗浄することにより行われる。洗浄液としては
特に制限はないが、例えば、１５０ｍＭ ＮａＣｌを添
加した８５ｍＭ ホウ酸緩衝液を用いることができる。

【００８２】次いで（ｃ）工程において、カルプロパミ
ドを含む試料と抗体を固相化抗原と接触させ、抗体を固
相化抗原及びカルプロパミドと反応させることにより、
固相化抗原−抗体複合体及びカルプロパミド−抗体複合
体が生成する。

【００８３】この際、抗体としては、第一抗体として本
願発明のカルプロパミドに対する抗体を加え、更に第二
抗体として標識酵素を結合した第一抗体に対する抗体を
順次加えて反応させる。

【００８４】第一抗体は緩衝液に溶解して添加する。限
定されるわけではないが、反応は、１０℃から４０℃、
好ましくは約２５℃から約３７℃で約１時間行えばよ
い。反応終了後、緩衝液で担体を洗浄し、固相化抗原に
結合しなかった第一抗体を除去する。洗浄液としては、
例えば、１５０ｍＭ ＮａＣｌを添加した８５ｍＭ ホ
ウ酸緩衝液を用いることができる。

【００８５】次いで第二抗体を添加する。例えば第一抗
体としてマウスモノクローナル抗体を用いる場合、酵素
（例えば、ペルオキシダーゼ又はアルカリホスファター
ゼ等）を結合した抗マウス−ヤギ抗体を用いるのが適当
である。担体に結合した第一抗体に約５００倍から１０
０００倍、好ましくは最終吸光度が４以下、より好まし
くは０．５−３．０となるように希釈した第二抗体を反
応させるのが望ましい。希釈には緩衝液を用いる。限定
されるわけではないが、反応は室温で約１時間行い、反
応後、緩衝液で洗浄する。以上の反応により、第二抗体
が第一抗体に結合する。また、標識した第一抗体を用い
てもよく、その場合、第二抗体は不要である。

【００８６】次いで（ｄ）工程において担体に結合した
第二抗体の標識物質と反応する発色基質溶液を加え、吸
光度を測定することによって検量線からカルプロパミド
の量を算出することができる。

【００８７】第二抗体に結合する酵素としてペルオキシ
ダーゼを使用する場合には、例えば、過酸化水素、並び
に３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン又はｏ
−フェニレンジアミン（以下、「ＯＰＤ」と言う）を含
む発色基質溶液を使用することができる。限定されるわ
けではないが、発色基質溶液を加え室温で約１０分間反
応させた後、１Ｎの硫酸を加えることにより酵素反応を
停止させる。３，３’，５，５’−テトラメチルベンジ
ジンを使用する場合、４５０ｎｍの吸光度を測定する。
ＯＰＤを使用する場合、４９２ｎｍの吸光度を測定す
る。一方、第二抗体に結合する酵素としてアルカリホス
ファターゼを使用する場合には、例えばｐ−ニトロフェ
ニルリン酸を基質として発色させ、２ＮのＮａＯＨ溶液
を加えて酵素反応を止め、４１５ｎｍでの吸光度を測定
する方法が適している。

【００８８】カルプロパミドを添加しない反応溶液の吸
光度に対して、それらを添加して抗体と反応させた溶液
の吸光度の減少率を阻害率として計算する。既知の濃度
のカルプロパミドを添加した反応液の阻害率により予め
作成しておいた検量線を用いて、試料中のカルプロパミ
ドの濃度を算出できる。

【００８９】あるいはカルプロパミドの測定は、例えば
以下に述べるような本発明のモノクローナル抗体を用い
た直接競合ＥＬＩＳＡ法によって行うこともできる。
（ａ）まず、本発明のモノクローナル抗体を、担体に固
相化する。

【００９０】（ｂ）抗体が固相化されていない担体表面
を抗原と無関係な物質、例えばタンパク質により、ブロ
ッキングする。 （ｃ）上記工程とは別に、各種濃度のカルプロパミドを
含む試料に、カルプロパミドハプテンと酵素を結合させ
た酵素結合ハプテンを加えた混合物を調製する。

【００９１】（ｄ）上記混合物を上記抗体固相化担体と
反応させる。 （ｅ）固相化抗体−酵素結合ハプテン複合体の量を測定
することにより、あらかじめ作成した検量線から試料中
のカルプロパミドの量を決定する。

【００９２】（ａ）工程においてモノクローナル抗体を
固相化する担体としては、特別な制限はなくＥＬＩＳＡ
法において常用されるものを用いることができ、例えば
９６ウェルのマイクロタイタープレートが挙げられる。
モノクローナル抗体の固相化は、例えばモノクローナル
抗体を含む緩衝液を担体上にのせ、インキュベートする
ことによって行える。緩衝液の組成・濃度は前述の間接
競合ＥＬＩＳＡ法と同様のものを採用できる。

【００９３】（ｂ）工程のブロッキングは、抗体を固相
化した担体において、後に添加する試料中のカルプロパ
ミド並びに酵素結合ハプテンが、抗原抗体反応とは無関
係に吸着される部分が存在する場合があるので、それを
防ぐ目的で行う。ブロッキング剤及びその方法は、前述
の間接競合ＥＬＩＳＡ法と同様のものを使用できる。

【００９４】（ｃ）工程において用いる酵素結合ハプテ
ンの調製は、カルプロパミドハプテンを酵素に結合する
方法であれば特に制限なく、いかなる方法で行ってもよ
い。例えば、前述した活性化エステル法を採用すること
ができる。調製した酵素結合ハプテンは、カルプロパミ
ドを含む試料と混合する。

【００９５】なお、酵素等の標識物質に結合させるハプ
テンとしては、間接競合ＥＬＩＳＡ法における固相化抗
原の場合と同様に、抗体作製に使用したカルプロパミド
ハプテン自体のみならず、式（１）で表される他のハプ
テンと高分子化合物との結合体を標識競合用抗原として
使用することも可能である。例えば、式（１）において
Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｘ¹、Ｘ²又はｎが抗体作製用と相違す
る化合物を、標識競合用抗原として使用することもでき
る。さらに、式（１）に含まれない他のカルプロパミド
類似化合物も、標識競合用抗原として使用可能である。

【００９６】（ｄ）工程においてカルプロパミドを含む
試料及び酵素結合ハプテンを抗体固相化担体に接触さ
せ、カルプロパミドと酵素結合ハプテンとの競合阻害反
応により、これらと固相化担体との複合体が生成する。
カルプロパミドを含む試料は適当な緩衝液で希釈して使
用する。限定されるわけではないが、反応は例えば、室
温でおよそ１時間行う。反応終了後、緩衝液で担体を洗
浄し、固相化抗体と結合しなかった酵素結合ハプテンを
除去する。洗浄液は、例えば１５０ｍＭ ＮａＣｌを添
加した８５ｍＭ ホウ酸緩衝液を使用することができ
る。

【００９７】さらに、（ｅ）工程において酵素結合ハプ
テンの酵素に反応する発色基質溶液を前述の間接競合Ｅ
ＬＩＳＡ法と同様に加え、吸光度を測定することにより
検量線からカルプロパミドの量を算出することができ
る。

【００９８】本発明のモノクローナル抗体ＣＰＡ１２−
３２は、直接競合ＥＬＩＳＡ法において約０．３ｎｇ／
ｍｌから１００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは１．０ｎｇ／ｍ
ｌから４０ｎｇ／ｍｌの濃度範囲でカルプロパミドと反
応する（実施例６、図２）。

【００９９】さらに、前述したように直接競合ＥＬＩＳ
Ａ法において抗体作製用と異なるハプテンを標識競合用
抗原として使用でき、その組み合わせによって直接競合
ＥＬＩＳＡ法において固有の反応性を示す。本発明の抗体の交差反応性 上述した直接競合ＥＬＩＳＡ法又は間接競合ＥＬＩＳＡ
法により、本発明のモノクローナル抗体の交差反応性を
調べることができる。

【０１００】例えば、モノクローナル抗体ＣＰＡ１２−
３２はカルプロパミド類似化合物（ペルメトリン、シペ
ルメトリン、シクロプロピルフェニルカルビノール、シ
クロプロピルフェニルケトン）並びにカルプロパミドの
測定において混在する可能性のある化合物（フルトラニ
ル、イミダクロプリドおよびブプロフェジン）に反応性
を示さず、カルプロパミドに対して非常に高い特異性を
有する（実施例７、表２）。以下、実施例によって本発
明を具体的に説明するが、これらは本発明の技術的範囲
を限定するためのものではない。当業者は本明細書の記
載に基づいて容易に本発明に修飾、変更を加えることが
でき、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。

【０１０１】

【実施例】実施例１ カルプロパミドハプテンの合成

【０１０２】

【化１３】

【０１０３】本発明のカルプロパミドハプテンの例とし
て、６−［４−（（Ｒ）−１−（（１ＲＳ，３ＳＲ）−
２，２−ジクロロ−１−エチル−３−メチルシクロプロ
パンカルボキサミド）エチル）フェノキシ］ヘキサン酸
（４）を合成した。（１ＲＳ，３ＳＲ）−２，２−ジクロロ−１−エチル−
Ｎ−［（Ｒ）−１−（４−メトキシフェニル）エチル］
−３−メチルシクロプロパンカルボキサミド（１）の合
成 クロロホルム５ｍｌ中の（１ＲＳ，３ＳＲ）−２，２−
ジクロロ−１−エチル−３−メチルシクロプロパンカル
ボン酸１．４ｇ（７．５ｍｍｏｌ）の溶液に、塩化チオ
ニル１．３ｇ（１２．６ｍｍｏｌ）を加え、環流下に２
時間反応させた。反応混合物を濃縮後、残渣の塩化物を
５ｍｌのアセトンに溶かし、この溶液をアセトン３０ｍ
ｌ中の（Ｒ）−１−（４−メトキシフェニル）エチルア
ミン１．１ｇ（７．５ｍｍｏｌ）と炭酸水素ナトリウム
０．７０ｇ（８．３ｍｍｏｌ）の混合物に加え、１時間
撹拌、環流させた。反応混合物を濃縮し、残渣に３０ｍ
ｌの水を加え、酢酸エチル４０ｍｌで３回抽出した。酢
酸エチル層を水洗後、硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮
した。残渣をカラムクロマト（ｎ−ヘキサン：酢酸エチ
ル＝３：１）で精製し、１．５ｇ（収率６３％）の
（１）を得た。（１ＲＳ，３ＳＲ）−２，２−ジクロロ−１−エチル−
Ｎ−［（Ｒ）−１−（４−ヒドロキシフェニル）エチ
ル］−３−メチルシクロプロパンカルボキサミド（２）
の合成 ジクロロメタン３０ｍｌ中の（１ＲＳ，３ＳＲ）−２，
２−ジクロロ−１−エチル−Ｎ−［（Ｒ）−１−（４−
メトキシフェニル）エチル］−３−メチルシクロプロパ
ンカルボキサミド（１）１．４ｇ（４．２ｍｍｏｌ）の
溶液に、三臭化ホウ素２．３ｇ（９．２ｍｍｏｌ）をマ
イナス１５℃ないしマイナス１０℃で加え、室温下に２
時間反応させた。反応混合物に水５ｍｌを１０℃ないし
２０℃で徐々に加え、ジクロロメタン層を１０％水酸化
ナトリウム水溶液で抽出した。水層を希塩酸で酸性に
し、酢酸エチル３０ｍｌで３回抽出した。酢酸エチル層
を水洗後、硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮して０．８
ｇ（収率６２％）の（２）を得た。６−［４−（（Ｒ）−１−（（１ＲＳ，３ＳＲ）−２，
２−ジクロロ−１−エチル−３−メチルシクロプロパン
カルボキサミド）エチル）フェノキシ］ヘキサン酸エチ
ル（３）の合成 エタノール２０ｍｌ中に（１ＲＳ，３ＳＲ）−２，２−
ジクロロ−１−エチル−Ｎ−［（Ｒ）−１−（４−ヒド
ロキシフェニル）エチル］−３−メチルシクロプロパン
カルボキサミド（２）０．７０ｇ（２．２ｍｍｏｌ）、
６−ブロモヘキサン酸エチル０．５９ｇ（２．６ｍｍｏ
ｌ）および炭酸カリウム０．３３ｇ（２．４ｍｍｏｌ）
を含む懸濁液を、環流下で１時間撹拌した。反応混合物
を濃縮し、残渣に３０ｍｌの水を加え、酢酸エチル４０
ｍｌで２回抽出した。酢酸エチル層を水洗後、無水硫酸
マグネシウムで乾燥し、濾過、濃縮した。残渣をカラム
クロマトグラフィ（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝５：
１）で精製し、０．６０ｇ（収率６０％）の（３）を得
た。６−［４−（（Ｒ）−１−（（１ＲＳ，３ＳＲ）−２，
２−ジクロロ−１−エチル−３−メチルシクロプロパン
カルボキサミド）エチル）フェノキシ］ヘキサン酸
（４）の合成 メタノール１０ｍｌ中に６−［４−（（Ｒ）−１−
（（１ＲＳ，３ＳＲ）−２，２−ジクロロ−１−エチル
−３−メチルシクロプロパンカルボキサミド）エチル）
フェノキシ］ヘキサン酸エチル（３）０．５０ｇ（１．
１ｍｍｏｌ）を含む溶液に、水１０ｍｌに溶解した水酸
化ナトリウム０．２２ｇ（５．５ｍｍｏｌ）を加え、室
温で１時間撹拌した。減圧下にメタノールを留去し、残
渣に水３０ｍｌとエーテル３０ｍｌを加え、分配後、水
層を希塩酸で酸性にし、酢酸エチル７０ｍｌで２回抽出
した。酢酸エチル層を水洗し、無水硫酸マグネシウムで
乾燥後、濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィ
ー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝１：１）で精製し０．
２１ｇ（収率４３％）の（４）を得た。

【０１０４】上記カルプロパミドハプテン（４）の¹Ｈ
−ＮＭＲによる物性データ（ケミカルシフトδ）を以下
に示す。

【０１０５】

【表１】¹ Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−Ｄ₆，４００ＭＨｚ）δ ０．７７（３Ｈ，ｔ，ｔ，ＣＨ₃）， １．１３（３
Ｈ，ｍ，ＣＨ₃），１．３６（７Ｈ，ｍ，２ＣＨ₂，ＣＨ
₃），１．５５（２Ｈ，ｍ，ＣＨ₂），１．６９（２Ｈ，
ｍ，ＣＨ₂）， ２．２２（３Ｈ，ｍ，ＣＨ，Ｃ
Ｈ₂），３．９２（２Ｈ，ｔ，ＣＨ₂）， ４．９５
（１Ｈ，ｍ，ＣＨ），６．８３（２Ｈ，ｍ，２Ａｒ：
Ｈ）， ７．２２（２Ｈ，ｍ，２Ａｒ：Ｈ），８．４８
（１Ｈ，ｍ，ＮＨ）， １２．００（１Ｈ，ｓ，Ｃ
ＯＯＨ）実施例２ カルプロパミドハプテンと高分子化合物との
結合体の作製 カルプロパミドハプテンをＫＬＨに結合させた免疫用抗
原、およびＢＳＡに結合させたスクリーニング用抗原を
活性化エステル法により作製した。

【０１０６】まず、実施例１で作製したカルプロパミド
ハプテンの３．６４μｍｏｌをＤＭＳＯ ５０μｌに溶
解した。次に、１８４ｍｇ／ｍｌのＮ−ヒドロキシこは
く酸イミドのＤＭＳＯ溶液１０μｌと５３ｍｇ／ｍｌの
１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カル
ボジイミド塩酸塩のＤＭＳＯ溶液を２０μｌ添加した。
ＤＭＳＯ ５０μｌを加えた後、遮光下、室温で９０分
間静置し活性化させた。

【０１０７】一方、ＫＬＨ及びＢＳＡを各々１０ｍｇ秤
量し、８５ｍＭ ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）５００μ
ｌに添加溶解した。これを上記の反応液と混合し、遮光
下、室温で９０分間放置することにより結合反応を行っ
た。

【０１０８】最後に反応試薬除去のため、遮光、４℃の
条件下で１晩、２Ｌのリン酸緩衝液（以下、「ＰＢＳ」
と言う）で２回透析を行い、カルプロパミドハプテンと
ＫＬＨとの結合体（以下、「カルプロパミドハプテン／
ＫＬＨ」と言う）、及びカルプロパミドハプテンとＢＳ
Ａとの結合体（以下、「カルプロパミドハプテン／ＢＳ
Ａ」と言う）を各々作製した。実施例３ 免疫感作 免疫にはＢａｌｂ／ｃマウス（日本ＳＬＣ社より購入）
を用いた。実施例２で調製した免疫用抗原（カルプロパ
ミドハプテン／ＫＬＨ）をマウス１匹あたり１００μｇ
／５０μｌとなるようにＰＢＳで希釈した。さらに５０
μｌのフロイント完全アジュバントを添加混合した後、
マウスの腹腔内に接種した。その１ヶ月後に、マウス１
匹あたり２５μｇ／５０μｌのＰＢＳの免疫用抗原（カ
ルプロパミドハプテン／ＫＬＨ）を等量の不完全アジュ
バントと混合し、追加免疫した。さらにその１週間後に
マウス尾静脈から採血した血液を３７℃で３０分インキ
ュベーションした後、４℃で１晩静置した。５０００ｒ
ｐｍで１０分間遠心分離を行い、上清を採取し、これを
抗血清とした。実施例４ 抗血清のカルプロパミドに対する反応性 実施例２で調製したスクリーニング用抗原（カルプロパ
ミドハプテン／ＢＳＡ）を用いた間接競合ＥＬＩＳＡ法
により、実施例３で調製した抗血清のカルプロパミドに
対する反応性を調べた。

【０１０９】まず、実施例２で調製したカルプロパミド
ハプテン／ＢＳＡを４μｇ／ｍｌとなるようにＰＢＳで
希釈した。これを９６ウェルのＥＬＩＳＡ用プレートに
１００μｌ／ウェルとなるように添加し、４℃で１晩静
置することにより固相化した。次に溶液を廃棄し、１％
ＢＳＡを含んだＰＢＳ溶液を３００μｌ／ウェル添加し
て４℃で１晩静置することによりブロッキングを行っ
た。

【０１１０】このウェルを洗浄液（１５０ｍＭ ＮａＣ
ｌを含む８５ｍＭホウ酸緩衝液）で１回洗浄した。次い
で、少量のメタノールに溶解しＰＢＳで任意の濃度にな
るように希釈したカルプロパミド溶液５０μｌと０．３
％ＢＳＡを含むＰＢＳで希釈した抗体溶液５０μｌを混
合、添加し、１時間常温で反応を行った。洗浄液で３回
洗浄した後、１μｇ／ｍｌのペルオキシダーゼ結合抗マ
ウスＩｇＧ抗体（キルケガードアンドペリー社製）を１
００μｌ／ウェルで添加した。常温でさらに１時間反応
を行った。３回洗浄した後、１００μｌのペルオキシダ
ーゼ基質溶液（１００μｇ／ｍｌの３，３’，５，５’
−テトラメチルベンチジン、並びに０．００６％過酸化
水素を含む０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．
５））で１０分間発色させた。次いで、１００μｌの１
Ｎ硫酸で反応を停止した。この溶液の４５０ｎｍの吸光
度を分光光度計で測定した。

【０１１１】結果を図１に示す。いずれのマウスも１０
ｎｇ／ｍｌ以上の濃度のカルプロパミドに対して反応し
た。実施例５ ハイブリドーマ体の作製 実施例４で抗血清の力価を測定したマウスについて、ポ
リエチレングリコール法を用いて細胞融合を行った。

【０１１２】マウス１匹あたり２５μｇ／１００μｌ
ＰＢＳの免疫用抗原（カルプロパミドハプテン／ＫＬ
Ｈ）を実施例３で示したとおりにマウス腹腔内に投与し
た。３日後、抗カルプロパミド抗体を産生するマウスの
脾臓とマウスミエローマ細胞（Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．
６５３）とを用い、山下らの方法（組織細胞化学：日本
組織細胞学会編：学際企画、１９８６年）に従ってポリ
エチレングリコール法により細胞融合操作を行った。こ
れらを９６ウェルマイクロプレートに総細胞数が２×１
０⁷となるように分注し、ＨＡＴ及び１０％ＢＳＡを含
んだダルベッコ培地中で選択培養した。培養後、細胞培
養液を用いて実施例４と同様の間接競合ＥＬＩＳＡ法
で、カルプロパミドに対する反応性を指標にハイブリド
ーマ細胞の選抜操作を行った。

【０１１３】次に選抜された細胞について、限界希釈法
により細胞のクローニングを実施した。３日後に培養液
を半量交換し、ハイブリドーマ細胞がコロニーを形成す
るまで培養を続けた。

【０１１４】以上の操作により、カルプロパミドに反応
性を示すモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ
細胞（ＣＰＡ１２−３１、ＣＰＡ１２−３２、ＣＰＡ１
２−３３）を分離した。そのうちのＣＰＡ１２−３２を
平成１１年６月１５日に寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１７４
２５で工業技術院生命工学工業技術研究所（〒３０５−
００４６ 茨城県つくば市東１丁目１番３号）に寄託し
た。実施例６ 直接競合ＥＬＩＳＡ法によるカルプロパミド
の測定 実施例５で得られたハイブリドーマ細胞ＣＰＡ１２−３
２をマウスの腹腔に移植し、１０日ないし１５日経過後
の腹水を採取し、硫安分画法、さらにプロテインＡカラ
ム（アマルシャム社製）を用いて抗体を精製した。この
操作によって抗カルプロパミド抗体ＣＰＡ１２−３２を
得た（以後、モノクローナル抗体はこれを産生するモノ
クローナル抗体産生細胞と同一の名称を用いる）。モノ
クローナル抗体ＣＰＡ１２−３２のサブクラスはＩｇＧ
１κであった。

【０１１５】モノクローナル抗体ＣＰＡ１２−３２を用
い、以下のように直接競合ＥＬＩＳＡ法によりカルプロ
パミドを測定した。まず、直接競合ＥＬＩＳＡ法で用い
るカルプロパミドハプテンとＨＲＰとの結合体（以下、
「カルプロパミドハプテン／ＨＲＰ」と言う）を、実施
例２と同様に活性化エステル法により作製した。

【０１１６】精製したモノクローナル抗体ＣＰＡ１２−
３２を４．７２μｇ／ｍｌとなるようにＰＢＳで希釈し
た。次いで、９６ウェルマイクロプレートに１００μｌ
ずつ添加し、４℃で１晩静置することにより固相化し
た。抗体結合後、４倍希釈のブロックエース（大日本製
薬社製）でブロッキングを行った。ここに、任意の濃度
のカルプロパミドを含む１０％メタノール溶液と６５ｎ
ｇ／ｍｌのカルプロパミドハプテン／ＨＲＰを含む０．
３％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液とを各々１００μｌずつ添加
し、２５℃で１時間反応させた。

【０１１７】反応後、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ＰＢＳ
で５回洗浄した後、ＢＭ Ｂｌｕｅ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇ
ｅｒ Ｍａｎｎｈａｅｉｍ，）を１００ｕｌずつ各ウェ
ルに入れ、室温で１０分間静置して発色を行った。次
に、１Ｎ硫酸を５０ｕｌずつ各ウェルに加えて発色停止
させ、４５０ｎｍの吸光度を測定した。

【０１１８】その結果を図２に示す。本発明のモノクロ
ーナル抗体ＣＰＡ１２−３２は、直接競合ＥＬＩＳＡ法
によりカルプロパミドを０．３ｎｇ／ｍｌないし１００
ｎｇ／ｍｌの範囲で測定することができた。実施例７ モノクローナル抗体ＣＰＡ１２−３２の交差
反応性 実施例６の直接競合ＥＬＩＳＡ法を用いてモノクローナ
ル抗体ＣＰＡ１２−３２の交差反応性を調べた。具体的
には、対象化合物としてカルプロパミドおよびカルプロ
パミドの他に、４種類のカルプロパミド類似化合物（ペ
ルメトリン、シペルメトリン、シクロプロピルフェニル
カルビノール、シクロプロピルフェニルケトン）並びに
カルプロパミドの測定において混在する可能性のある３
種類の化合物（フルトラニル、イミダクロプリドおよび
ブプロフェジン）を用いた。

【０１１９】その結果を表２に示す。

【０１２０】

【表２】

【０１２１】表２中、交差反応率（％）は、（カルプロ
パミドのＩＣ５０／対象化合物のＩＣ５０）ｘ１００で
定義される。ここでＩＣ５０（ｐｇ／ｍＬ）は反応を５
０％阻害する化合物の濃度を示す。各化合物のＩＣ５０
値がカルプロパミドのＩＣ５０値より大きく乖離してい
る程、すなわち、各化合物の交差反応率が低いほど抗体
のカルプロパミドに対する特異性が高いことを意味す
る。

【０１２２】表１に示したように、モノクローナル抗体
ＣＰＡ１２−３２はカルプロパミドおよびカルプロパミ
ドハプテンに対しては高い反応性を示したが、類似化合
物及び混在する可能性のある化合物に対しては、ほとん
ど反応性を示さなかった。よって、モノクローナル抗体
ＣＰＡ１２−３２はカルプロパミドに対して高い特異性
をもつ抗体であることが分かった。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、本発明のカルプロパミドハプテンを用
いて得られた抗血清の間接競合ＥＬＩＳＡ法によるカル
プロパミドとの反応性を示す。

【図２】図２は、本発明のモノクローナル抗体の直接競
合ＥＬＩＳＡ法によるカルプロパミドとの反応性を示
す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 15/02 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｊ Ｃ１２Ｐ 21/08 33/577 Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 33/577 15/00 Ｃ (72)発明者 南條 正仁 東京都港区浜松町１丁目27番14号 株式会 社環境免疫技術研究所内 (72)発明者 木村 浩子 東京都港区浜松町１丁目27番14号 株式会 社環境免疫技術研究所内 (72)発明者 皆川 郁子 東京都港区浜松町１丁目27番14号 株式会 社環境免疫技術研究所内 Ｆターム(参考） 4B024 AA05 AA07 AA11 BA53 GA03 HA15 4B064 AG26 AG27 AG31 CA10 CA20 CC24 DA10 DA11 DA13 4B065 AA92X AB05 AC14 BA08 CA24 CA25 CA46 4H006 AA01 AA02 AA03 AB80 AC43 BJ20 BJ50 BM20 BM30 BM72 BP30 BS10 BS20 BV62 4H045 AA11 AA20 AA30 BA72 CA40 DA75 DA76 DA86 EA50 FA72

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】以下の式（１）： 【化１】 ［式（１）中、 Ｒ¹、Ｒ²およびＲ³は、同一であっても異なっていても
   よい、枝分かれしていてもよい炭素数１ないし３のアル
   キル基であり；Ｘ¹およびＸ²は、同一であっても異なっ
   ていてもよい、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩから選択されるハ
   ロゲン原子であり；そしてｎは、１ないし１０の整数で
   ある］で表される構造を有する化合物。
2. 【請求項２】式（１）において、Ｒ¹およびＲ³がメチル
   基であり、Ｒ²がエチル基であり、そしてがＸ¹およびＸ
   ²がＣｌである、請求項１に記載の化合物。
3. 【請求項３】式（１）において、ｎが５である請求項１
   又は２に記載の化合物。
4. 【請求項４】請求項１ないし３のいずれか１項に記載の
   化合物と高分子化合物又は標識物質との結合体。
5. 【請求項５】請求項１ないし３のいずれか１項に記載の
   化合物と高分子化合物を結合させることにより抗原を作
   製し、当該抗原を用いることにより、以下の式（２）： 【化２】 ［式（２）中、 Ｒ¹、Ｒ²およびＲ³は、同一であっても異なっていても
   よい、枝分かれしていてもよい炭素数１ないし３のアル
   キル基であり；そしてＸ¹、Ｘ²およびＸ³は、同一であ
   っても異なっていてもよい、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩから
   選択されるハロゲン原子である］で表される構造を有す
   る化合物に反応性を示す抗体を製造することを特徴とす
   る、式（２）で表される構造を有する化合物に反応性を
   示す抗体又はそのフラグメントの製造方法。
6. 【請求項６】式（２）において、Ｒ¹およびＲ³がメチル
   基であり、Ｒ²がエチル基であり、そしてがＸ¹、Ｘ²お
   よびＸ³がＣｌである、請求項５に記載の製造方法。
7. 【請求項７】請求項４に記載の結合体を抗原として用い
   ることにより製造された、式（２）の化合物に反応性を
   示す抗体又はそのフラグメント。
8. 【請求項８】モノクローナル抗体である、請求項７に記
   載の抗体又はフラグメント。
9. 【請求項９】モノクローナル抗体ＣＰＡ１２−３２であ
   る、請求項７若しくは８に記載の抗体又はフラグメン
   ト。
10. 【請求項１０】請求項７ないし９のいずれか１項に記載
    の抗体又はフラグメントを産生するハイブリドーマ。
11. 【請求項１１】寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１７４２５で寄
    託されている、請求項１０に記載のハイブリドーマ。
12. 【請求項１２】請求項７ないし９のいずれか１項に記載
    の抗体又はフラグメントを用いることを特徴とする、式
    （２）で表される化合物の免疫学的測定方法。
13. 【請求項１３】さらに、請求項１ないし３のいずれか１
    項に記載の化合物、又は請求項４に記載の結合体を用い
    ることを含む、請求項１２に記載の免疫学的測定方法。